확산의 분석 및 형광 현미경 검사 법에 의해 수용 체 막의 클러스터 크기에 대 한 프로토콜을 처리 하는 이미지

Summary

여기, 우리는 확산 계수, 형광 현미경 검사 법에 의해 감지 하는 단일 입자의 모션 및 클러스터 크기의 종류의 정량적 인 평가 허용 하는 이미지 분석을 추적 하는 단일 입자에 대 한 프로토콜을 제시.

Abstract

비디오 시퀀스에 그들의 궤도의 후부 분석 추적 입자 요즘 많은 생물학 연구에서 일반적인 작업입니다. 모델 클러스터 세포 막 수용 체의 분석을 사용 하 여, 피지 (ImageJ) 및 Matlab 루틴을 사용 하 여이 이미지 분석 작업에 대 한 자세한 프로토콜 소개: 1) 관심 영역을 정의 하 고 마스크;이 지역에 맞게 디자인 2) 형광 현미경 동영상; 입자 추적 3) 선택 된 트랙의 확산 및 강도 특성 분석. 확산 계수의 정량 분석, 모션, 및 클러스터 크기의 유형 형광 현미경으로 얻은 이미지 처리 하며 객관적으로 입자 역학과 수정 결과 확인 하는 유용한 도구 환경 조건입니다. 이 문서에서는 이러한 기능 분석에 대 한 상세한 프로토콜 선물이. 설명 하는 방법을 여기 뿐만 아니라 단일 분자 추적 탐지를 허용 하지만 측면 확산 세포 막에서 매개 변수 추정 자동화, 궤적의 유형을 분류 하 고 따라서 극복 하는 완전 한 분석을 수는 세포 막에서 그것의 전체 궤도에 자리 크기 측정에 어려움

Introduction

막 단백질 지질 bilayer에 포함 된 열 확산으로 지속적인 운동에 있습니다. Intermolecular 상호 작용 올리고 단위체에서 크기에서 변화 하 고 신호 복합물의 안정성에 영향을 단지의 형성으로 그들의 역학 세포 응답 통제에 필수적입니다. 단백질 역학을 제어 하는 메커니즘을 elucidating 따라서 세포 생물학, 신호 전달 경로 이해 하 고 예기치 않은 셀 기능을 식별 하는 데 필요한 새로운 도전 이다.

일부 광 방법은 개발 되었다¹셀 생활에 이러한 상호 작용을 공부 하. 이러한 가운데, 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 검사 법, 1980 년대 초에 개발 또는 세포 막²근처 매우 분자 상호 작용의 연구를 수 있습니다. 공부 하 고 살아있는 세포에 TIRF 데이터에서 가져온 막 단백질 궤적의 동적 매개 변수, 단일 입자 추적 방법 (SPT)가 필요 합니다. 여러 알고리즘이 사용할 수 있습니다, 있지만 우리 현재 Jaqaman 외.³ 는 입자 결과 트랙을 연결 하려면 연속 프레임 사이 연결 하 여 입자 모션이 조밀한 입자 필드에 의해 그 사용 완전 한 궤도 (임시 입자 실종)에 세그먼트. 소프트웨어를....

Protocol

1입니다. 생물 샘플의 준비

1. 10 %fcs 보충 RPMI 1640 매체에 Jurkat 세포 성장 NaPyr 및 L-글루타민 (완전 한 RPMI). Electroporate Jurkat 세포 (20 x 10⁶ 셀/400 µ L 10% fcs RPMI 1640의) 단위체 GFP 표시 chemokine 수용 체 벡터 (CXCR4-AcGFP, 20 μ g) 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 그것의 탐지를 허용 하도록.
   참고: 그것은 mCherry, mScarlet, 등 등과 같은 다른 단위체 형광 단백질을 사용 하 여 수 있습니다.
2. transfection 후 24 h 셀 교류 cytometer 세포 생존 능력 및 CXCR4 AcGFP 식 결정을 분석.
3. 같이 transfected 수용 체의 낮은 식 TIRFM 실험에 개별 추적에 대 한 단일 입자 추적을 보장 하는 데 필요한 세포 GFP^낮은 긍정적인 세포 (그림 1)의 분류에 의해 CXCR4 AcGFP 저급을 표현 하는 셀을 선택 궤적⁹.
4. 세포 표면에 있는 수용 체의 수를 수량화 합니다.
   참....

Results

이 프로토콜을 사용 하는 형광 현미경 영화와 그들의 동적 특성의 분석에서 발견 하는 입자의 자동화 된 추적을 허용 한다. 처음, 셀 추적 붙일 결합 단백질으로 페는. SPT 셀 (그림 1)을 정렬 하 여 얻을 수 있는 세포 표면에 수용 체의 적절 한 수준을 제공 합니다. 선택한 셀이이 프로토콜 (보충 비디오 1)에 설명 된 도구로 공부 될 수 있는 형식에 비디오를 생성 하는 TIRF 현미경에 의해 분석 된다.

생성 하는 비디오를 직접 분석할 수 없습니다, 그리고 각 비디오의 독립적인 프레임 필요 합니다. ImageJ 사용 하 여 비디오 프레임.tiff 형식 또는 마스크 같은 Matlab 소프트웨어를 사용 하 여 해석 될 수 있는 파일을 생성 합니다. U-트랙 선택된 비디오에서 본 .......

Discussion

설명된 방법을 Matlab 함께 어떤 이전 경험을 필요 없이 수행 하기 쉽습니다. 그러나, Matlab 루틴 매우 다른 명령의 명칭 및 프로그램에 의해 고용 된 다른 폴더의 지역화와 정확성이 필요 합니다. 추적에서 분석 루틴 (3 단계), 여러 개의 매개 변수를 수정할 수 있습니다. "설정 가우스 혼합 모델 피팅" 창 (단계 3.8) U-트랙 비디오에 단일 입자 감지 방법을 제어 합니다. 이 피팅 가우스 혼합 모델³에 설명 된 대로 하면 됩니다. 이이 음 쇠에 대 한 주요 매개 변수 중 하나는 로컬 맥시 마를 식별 수 있도록 필터를 정의 합니다. 이 작업의 성공 이미지 대비와 소음 이미지에 의존합니다. 첫 번째 매개 변수 (로컬 백그라운드와 비교에 대 한 알파 값) 제어 소음을 줄이기 위해 관광 명소의 식별 하는 동안 두 번째 도움이 동안 진짜 자리 되는 맥시 마의 자신감. "추적" 단계 (3.9)에 중요 한 매개 변수는 (즉, 트랙 프레임 있는 입자는 실제로 본, 하지만 이러한 프레임.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
인간 Jurkat 세포	ATCC	CRL-10915	인간 T 세포주. 이 소프트웨어로 다른 세포 유형도 분석할 수 있습니다
pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP	Clontech	632469	이 루틴으로 다른 형광 단백질을 추적하고 분석할 수 있습니다
. Gene Pulse X Cell electroporator	바이오라드		우리는 Jurkat 셀에 280V, 975mF를 사용합니다. 손에 가장 잘 맞는 transfection 방법을 사용하십시오.
Cytomics FC 500 유세포 분석기	Beckman Coulter
MoFlo Astrios 세포 분류기	벡크만 쿨터(Beckman Coulter		) 형질주입 수준에 따라 세포 분류가 필요하지 않을 수도 있습니다.  또한 관심 수용체의 적절한 수준의 안정적인 발현을 가진 세포를 사용할 수 있습니다.
Dako Qifikit	DakoCytomation	K0078	세포 표면의 수용체 수를 정량화하는 데 사용됩니다.
유리 바닥 마이크로웰 접시	MatTek corporation	P35G-1.5-10-C
플라즈마에서 인간 피브로넥틴	Sigma-Aldrich	F0895
재조합 인간 CXCL12	PeproTech	300928A
반전 Leica AM TIRF	Leica
EM-CCD 카메라	Andor	DU 885-CSO-#10-VP
MATLAB	The MathWorks, Natick, MA
U-Track2 소프트웨어	Danuser Laboratory ImageJ
	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/
FiJi	FiJi		https://imagej.net/Fiji)
u-Track2 소프트웨어			Matlab 도구.  설치하려면 웹 페이지(http://lccb.hms.harvard.edu/software.html)에서 .zip 파일을 다운로드하고 선택한
GraphPad Prism	GraphPad 소프트웨어의