정화와 조직적 조상 세포의 이식 파생 듀 켄 씨 근 Dystrophic 쥐에서 심장 기능을 개선 하기 위해 Exosomes

Summary

여기, 선물이 정도 정상 조직적 조상 세포에서 파생 된 exosomes를 이식 하 여 듀 켄 씨 근이 영양 증 쥐에 심장 기능을 개선 하는 프로토콜.

Abstract

Duchene 근 위축 증 (DMD)은 X 연결 된 열성 유전 질환 기능 dystrophin 단백질 부족으로 인 한. 질병을 치료 수 없습니다, 그리고 및 질병 진행 되는 동안, 환자는 동 공이 확장 되어 심장 근육 병 증, 부정맥, 울 혈 심장 마비의 증상을 개발 합니다. DMD^MDX 돌연변이 마우스 dystrophin, 표현 하지 않는 그리고의 DMD 쥐 모형으로 일반적으로 사용 됩니다. 우리의 최근 연구에서 그 intramyocardial 주입 와이드 타입 (WT)의 관찰-조직적 조상 세포에서 파생 된 exosomes (MPC-엑 소) 정도 연관 되었다 dystrophin DMD^MDX 돌연변이 생쥐의 심근에서의 식을 복원 심장 기능을 제안에 일시적인 개선 WT-MPC-엑 소 DMD의 심장 증상을 완화 하는 옵션을 제공할 수 있습니다. 이 문서에서는 MPC-엑 소 정화 및 DMD^MDX 돌연변이 생쥐의 마음에 이식 하는 기술을 설명합니다.

Introduction

듀 켄 씨 근이 영양 증 (DMD)은 X 연결 된 열성, 진보적인 신경 근육 학 질환 기능 dystrophin¹의 손실과 DMD 유전자에 돌연변이 의해 발생. Dystrophin 골격 근육에 심근, 주로 표현 하 고 덜 부드러운 근육, 내 분 비 샘과 신경^2,3에 표시 됩니다. DMD는 3500 5000 신생아 소년 전세계^4,5에 하나씩의 발생률과 근 위축 증의 가장 일반적인 유형입니다. 개인은 일반적으로 진보적인 근육 괴 사, 손실 초기 청소년 기, 그리고 두 번째 제 3 년간 심장 마비 및 호흡⁶그들의 생활의 죽음에의 한 독립적인 지나가는의 개발.

동 공이 확장 되어 심장 근육 병 증, 부정맥 및 심부는 DMD^7,8의 일반적인 심장 혈관 발현. 질병을 치료 수 없습니다, 지지 치료 증상을 향상 시킬 수 있습니다 또는 심장 마비의 진행을 지연 하....

Protocol

동물은 승인 된 프로토콜 및 기관 동물 관리 및 사용 위원회 오 거 스타 대학에서 조오지 아의 의학 대학의의 동물 복지 규정에 따라 처리 합니다.

1. 격리와 MPC에서 파생 된 Exosomes의 정화

1. 20 mL 완전 한 Dulbecco와 15 cm 세포 문화 접시에 시드 5 x 10⁶ C2C12 셀이 글의 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 100 U/mL 페니실린 G 및 100 μ g/mL 스 수정. 37 ° C, 5% CO₂에서 품 어.
2. 진동 물통 회전자를 사용 하 여 4 ° C에 18 h에 대 한 100000 x g 에서 FBS의 ultracentrifugation에 의해 exosome 고갈 매체를 준비 합니다. 펠 릿을 삭제 합니다.
3. 단층 세포 문화 접시에 80%의 합류를 도달할 때 완전 한 DMEM 매체 exosome 고갈 대체.
4. 전송 피 펫을 사용 하 여 셀 문화 접시 총 3 번에 대 한 모든 48 h에서에서는 상쾌한 수집. 50 mL 원심 분리기 튜브, 그리고 나머지 셀을 제거 하려면 10 분 동안 150 x g 에서 원심 분리기에 상쾌한을 수집 합니다.
....

Results

분리 하 고 순화 C2C12 세포에서 exosomes에 대 한 흐름 차트는 그림 1에 표시 됩니다. Exosomes의 존재를 확인, 우리는 전송 전자 현미경 분석을 수행. 전송 전자 현미경 이미지 (그림 1B) 파생 하는 C2C12 exosomes의 밝고 둥근 모양 vesicles의 형태를 보여 줍니다. 서쪽 오 점 분석 exosome 마커, CD63 및 TSG101 등의 존재를 확인 했다 (그림 1C).

심근에 성공적인 분사를 나타내는 intramyocardial MDX 생쥐 (그림 2)의 좌 심 실의 앞쪽 벽에 PBS/MPC-엑 소 주입 후 반투명 부 종 지역을 관찰 합니다........

Discussion

순수한 exosomes를 분리 하는 방법은 exosomes의 기능을 공부에 대 한 필수적입니다. Exosome 격리에 대 한 일반적인 기술 중 하나는 폴 리 에틸렌 glycols (나무 못) 중재 강수량^17,18,25입니다. Exosomes, 구슬에서 시 켰 던 고 저속 원심 분리에 의해 일지도. 못-중재 정화는 매우 편리 하 고, 낮은-비용, 어떤 고급 장비를 필요 하지 않습니다 하지만 exosomes의 순수성에 대 한 우려 다른 지 단백질 함께 침전 될 수 있기 때문에 제거 하기가 어렵습니다. 적용은 exosome 분리, 분자량 및 제외 크기 제한²⁶에 대 한 일상적인 방법입니다. 한 격리 ultracentrifugation 기반으로 분리, 보다 빠릅니다 하지만 그것은 큰 소포에 구조적 손상을 일으킬 수 있습니다. C.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 &무; m 필터	Fisherbrand	09-720-004
15 cm 세포 배양 접시	Thermo Fisher Scientific	157150
24 G 카테터	TERUMO	SR-OX2419CA
31 G 인슐린 바늘	BD	328291
4% 파라포름알데히드	Affymetrix	AAJ19943K2
50 mL 원심분리기 튜브	Thermo Fisher Scientific	339652
6-0 봉합	Pro Advantage by NDC	P420697
Alexa Fluor 488 염소 항토끼 IgG	Thermo Fisher Scientific	A-11008
항생제 항진균 용액	Corning	30-004-CI
항-디스트로피핀 항체	Abcam	ab15277
항원 회수기	Aptum Biologics	R2100-US	항원 회수
자가형광 담금질 키트	Vector Laboratories	SP-8400
C2C12 세포주	ATCC	CRL-1772
원심분리기	Unico	C8606
Change-A-Tip 고온 소작기	Bovie Medical Corporation	HIT
컨포칼 현미경 Zeiss		Zeiss 780 Upright Confocal
DBA/2J-mdx 마우스	The Jackson Laboratory	013141
DMEM	코닝	10-013-CM
소태아 세럼 (FBS)	코닝	35-011-CV
염소 혈청	MP Biomedicals, LLC	191356
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-1389
케타민	Henry Schein	056344
DAPI가 있는 장착 매체;	Vector Laboratories	H-1500
마우스 견인기 세트	Kent Scientific	SURGI-5001
폴리에틸렌 글리콜 tert-옥틸페닐 에테르	Fisher Scientific	BP151-100
설치류 인공호흡기	Harvard Apparatus	55-7066
SW-28 Ti 로터	Beckman	342207
Vevo 2100 이미징 플랫폼	FUJIFILM VisualSonics	Vevo 2100	초음파 시스템
초원심분리기	Beckman	365672
Ultra-Clear Tubes	Beckman	344058
Xylazine (XylaMed)	Bimeda-MTC Animal Health Inc.	1XYL003 8XYL006