여기에서 우리는 질량 분광법을 위한 HIV-1 복제의 존재에 있는 Rev 면역 침전을 기술합니다. 기재된 방법은 HIV-1 감염 주기에 관여하는 뉴클레올러 인자의 식별을 위해 사용될 수 있으며, 연구되지 않은 경로의 특성화를 위한 다른 질병 모델에 적용가능하다.
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이 논문에서
요약
초록
HIV-1 전염주기는 바이러스 복제, 포장 및 방출을 촉진하기 위해 호스트 인자와의 바이러스 성 단백질 상호 작용을 필요로합니다. 전염주기는 더 접합을 통제하고 뉴클레오세포 수송을 가능하게 하기 위하여 HIV-1 RNA를 가진 바이러스성/호스트 단백질 복합체의 대형을 요구합니다. HIV-1 Rev 단백질은 인트로닉 시스-연기 표적-레브 반응 요소(RRE)를 가진 다중 병합을 통해 HIV-1 mRNAs의 핵 수출을 달성한다. 핵국화 신호(NoLS)는 레브 아르기닌이 풍부한 모티프(ARM)의 COOH 말단 내에 존재하며, 핵소체내의 Rev/RRE 복합체의 축적을 허용한다. 핵균 요인은 mRNA 독립적인 핵 수출 및 접합을 중재하는 것 이외에 각종 그밖 기능을 통해 HIV-1 전염주기를 지원하기 위하여 추측됩니다. 우리는 질량 분광법을 위한 HIV-1 복제의 존재에 있는 Rev 뉴클레올라 돌연변이 (삭제 및 단점 Rev-NoLS 돌연변이)에 비교된 야생형 (WT) Rev의 면역 침전 방법을 기술합니다. 뉴클레오세포 인자 (뉴클레오포스민 B23 및 뉴클레오린 C23)뿐만 아니라 세포 접합 인자에 연루된 핵세포 인자는 Rev-NoLS 돌연변이의 존재에서 Rev와의 상호 작용을 잃게된다. snoRNA C/D 상자 58와 같은 각종 그밖 핵포 요인은, Rev 돌연변이와의 상호 작용을 분실하기 위하여 확인됩니다, 그러나 HIV-1 복제 주기에 있는 그들의 기능은 알려지지 않은 남아 있습니다. 여기에 제시된 결과는 HIV-1 전염주기를 유지하는 바이러스성/호스트 뉴클레올라 요인의 확인을 위한 이 접근의 사용을 보여줍니다. 이 접근에 사용된 개념은 연구되지 않은 통로의 특성화를 요구하는 그밖 바이러스성 및 질병 모형에 적용가능합니다.
서론
핵약은 바이러스 복제에 필요한 다양한 세포 숙주 및 바이러스 인자의 상호 작용 접지로 가정됩니다. 핵소종은 세 개의 서로 다른 구획으로 세분화된 복잡한 구조입니다: 섬유실, 조밀한 섬유실 및 과립 구획. HIV-1 Rev 단백질은 특히 세분화된 구획 내에서 국소화됩니다. 그러나 이 지역화 패턴에 대한 이유는 알 수 없습니다. NoLS 서열(Rev 돌연변이 4, 5 및 6) 내의 단일 점 돌연변이가 있는 경우, Rev는 뉴클레올러 패턴을 유지하고 이전에 HIV-1HXB2 복제를 구출하는 것으로 나타났지만 WT Rev 1에 비해 효율성이 감소했습니다. . 모든 단점 돌연변이는 HIV-1NL4-3 전염주기를 지탱할 수 없습니다. NoLS 서열(Rev-NoLS 돌연변이 2 및 9) 내에서 다중 단일 점 돌연변이의 존재에서, Rev는 핵 및 세포질 전반에 걸쳐 분산되는 것으로 관찰되었으며HIV-1HXB2 복제 1을 구출할 수 없었다. 이 proteomics 연구 결과의 목표는 Rev 중재한 HIV-1 전염하는 통로에서 관련시킨 비핵구세포 세포 요인 뿐만 아니라 핵을 해독하는 것입니다. 레브 면역 침전 조건은 이전에 뉴클레오체 돌연변이의 존재하에서 Rev와의 ....
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프로토콜
1. 세포 배양
- Dulbecco의 수정된 독수리 배지(DMEM)에 10% 태아 소 혈청(FBS), 2 mML-글루타민, 1 mMM 나트륨 피루브산을 조직 배양 처리된 100 mm 플레이트 내에 보충하여 HLfB를 유지합니다. 5% CO2와 함께 공급되는 가습 된 인큐베이터에서 세포배양을 37 °C로 유지하십시오. 1 x 106 세포 / mL의 세포 밀도로 통로 결합 셀.
- 세포 배양 배지를 폐기한다. 1x 인산완식염수린(PBS)의 10 mL로 세포를 부드럽게 헹구십시오. 세포 층을 방해하지 않고 1x PBS를 제거하고 폐기하십시오.
- 세포에 1x 트립신-EDTA 용액 2mL를 추가합니다. 접시를 흔들어 단층을 코팅하고 가습 챔버 내에서 37°C에서 5분 동안 배양한다.
- 접시의 측면을 손바닥으로 단단히 눌러 세포를 분리합니다. 분리된 세포를 신선한 배양 배지의 8 mL에서 다시 중단합니다. 세포를 400 x g에서 5 분 동안 돌이꿉지 모릅니다.
- 세포 펠릿을 방해하지 않고 배양 배지를 폐기한다. 신선한 배양 배지의 10 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 계배양 1 mL의 농축 된 세포의 9 mL의 신선한 배양 배지를 조직 배양 처리 100 mm 플레....
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결과
Rev-NoLS 단일 및 다중 점 아르기닌 돌연변이, 다양한 세포 국소화 패턴에 대응하는, WT Rev. Rev-3'flag 및 pcDNA-flag에 비해 세포 숙주 인자와 상호 작용하는 능력에서 조사되었다. 벡터는 HLfB 배양체로 발현되었다. 단백질 복합체는 총 세포 포해액에서 처리하고 은 얼룩 시약으로 염색되었습니다. Rev-NoLS-3'flag는 도1에서 NaCl(137 mM, 200 mM, 및 300 mM)의 다양한 농도를 포함하는 3가지 상이한 용해 완충 조건에서 검출가능(약 18 kDa)이다. B23은 낮은 염농도(137 mM, 레인 2-4)를 함유하는 라시스 버퍼에서 검출가능(37 kDa), 200 mM NaCl을 함유하는 라시스 버퍼에서 간신히 검출가능하고, 높은 염농도(300 mM NaCl)를 함유하는 라시스 버퍼에서 검출할 수 없었다. 도2에서, WT Rev-3'flag, Rev-NoLS.......
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토론
HIV-1의 존재 에서 Rev-NoLS 돌연변이 및 WT Rev를 비교한 질량 분광 분석은 바이러스 복제 주기에서 관련시킨 뉴클레오요인을 이해하기 위하여 평가되었다. 이것은 바이러스성 감염에 필요한 핵성분을 확인할 것입니다. 뉴클레올러 B23은 Rev-NoLS에 대한 높은 친화력을 가지며, 레브-바운드 HIV mRNAs22의레브-NoLS 및 뉴클레오라국소화 및 뉴클레오세포국질 수송에서의 기능을 가지고 있다. 단일 또는 다중 아르기닌 치환을 포함하는 Rev-NoLS 돌연변이를 가진 B23의 친화성은, 바이러스성 생산 도중 Rev-3'flag의 면역 침전을 통해 평가되었습니다 (그림2; WT 및 돌연변이 M2, M6, 및 M9). 단일 점 Rev-NoLS 돌연변이 M4, M5 및 M6에 대한 B23 친화성은 HIV-1 복제의 존재 에서 이전에 조사되었다. 이전 연구에서, M4, M5 및 M6의 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
저자는 국립 보건원 (NIH) 에이즈 연구 및 참조 시약 프로그램, 에이즈의 부서, 알레르기 및 전염성 의 국립 연구소에서 제공하는 HLfB 준수 문화에 대한 박사 바바라 K. 펠버와 박사 조지 N. 파블라키스를 인정 질병 (NIAID), NIH. 저자는 또한 NIH, 그랜트 AI042552 및 AI029329에서 제공하는 금융 소스를 인정합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아세트산 | 피셔 케미컬 | A38S-212 | |
| 아세토니트릴 | 피셔 케미컬 | A955-500 | |
| 아크릴아미드:비사크릴아미드 | BioRad | 1610158 | |
| 중탄산암모 | 피셔 케미컬 | A643-500 | |
| 과황산암모늄 | 시그마-알드리치 | 7727-54-0 | |
| 안티 플래그 M2 친화력 젤 | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| 안티 플래그 M2 마우스 단클론 IgG | Sigma-Aldrich | F3165 | |
| BioMax MS 필름 | Carestream | 8294985 | |
| Bio-Rad 단백질 분석 염료 시약 농축액, 450 mL | Bio-Rad | 5000006 | |
| B23 마우스 단클론 IgG | Santa Cruz Biotechnologies | sc-47725 | |
| 브로모페놀 블루 | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| Carnation 무지방 분유 | Nestle | N/A | |
| Cell Scraper | ThermoFisher Scientific | 179693PK | |
| C18IonKey nanoTile column | Waters | 186003763 | |
| Corning 100mm TC 처리 배양 접시 | Fisher Scientific | 08-772-22 | |
| Dithiothreitol | Thermo Scientific | J1539714 | |
| 1 x DPBS | Corning | 21-030-CVRS | |
| ECL Estern 블로팅 기판 | Pierce | 32106 | |
| 에탄올, 200 증거 | Fisher Chemical | A409-4 | |
| FBS | Gibco | 16000044 | |
| Formic Acid | Fisher Chemical | A117-50 | |
| GelCode 블루 염색 시약 | ThermoFisher | 24590 | |
| 글리세롤 | 피셔 화학 | 56-81-5 | |
| 염소 안티 마우스 IgG-HRP | 산타 크루즈 생명 공학 | sc-2005 | |
| 요오드 아세트 아 | 미드 ACROS 유기물 | 122270050 | |
| KimWipe 섬세한 작업 와이퍼 | Kimberly Clark Professional | 34120 | |
| L-글루타민 | Gibco | ||
| 메탄올 | 피셔 케미컬 | 67-56-1 | |
| NanoAcuity UPLC | Waters | N/A | |
| 피어스 실버 스테인 키트 | Thermo Scientific | 24600df | |
| 15-mL 폴리프로필렌 원추형 튜브 | Falcon | 352097 | |
| Prestained Protein Ladder, 10 - 180 kDa | Thermo Scientific | 26616 | |
| 프로테아제 억제제 칵테일 | Roche | 4693132001 | |
| 정제 BSA | New England Biolabs | B9001 | |
| PVDF Western blotting membrane | Roche | 3010040001 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| 10 x TBS | Fisher Bioreagents | BP2471500 | |
| TEMED | BioRad | 1610880edu | |
| Triton X-100 detergent solution | BioRad | 1610407 | |
| Trizaic source | Waters | 해당 없음 | |
| 트립신-EDTA | 코닝 | 25-051-CIS | |
| 트윈 20 | BioRad | 1706531 | |
| Synapt G2 질량 분석기 | Waters | N/A | |
| Whatman 여과지 | Tisch Scientific | 10427813 |
참고문헌
- Arizala, J. A. C., et al. Nucleolar Localization of HIV-1 Rev Is Required, Yet Insufficient for Production of Infectious Viral Particles. AIDS Research and Human Retroviruses. , (2018).
- Li, Y. P.
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