전 생체 내 공초점 현미경을 사용하여 림프절 구조 및 세포 국소화 시각화

Summary

이 프로토콜은 장기 구조의 변화없이 림프절을 배출하는 다른 세포 집단을 이미지화하는 기술을 설명합니다.

Abstract

림프절 (LN)은 타고난 면역 반응이 적응 면역과 연결할 수있는 신체 내에서 퍼지는 기관입니다. 사실, LN은 전략적으로 림프관의 경로에 개입되어 LN의 모든 상주 면역 세포와 조직 항원과 친밀한 접촉을 허용합니다. 따라서, 전 생체 내 LN 이미징을 사용하여 세포 조성, 분포, 위치 및 상호 작용을 이해하는 것은 신체가 국소 및 전신 면역 반응을 어떻게 조정시키는지에 대한 지식을 추가할 것이다. 이 프로토콜은 기존의 공초점 현미경 및 재고 시약을 사용하여 매우 재현 가능하고 수행하기 쉬운 방법론을 허용하는 형광 표지 항체의 생체 내 투여 에 따른 생체 내 이미징 전략을 보여줍니다. 항체의 피하 주입을 통해, 기존의 면역 형광 현미경 기술에 의해 잠재적으로 손상될 수 있는 조직 구조에 영향을 미치지 않고 배수 LN에 있는 다른 세포 인구를 표지하는 것이 가능합니다.

Introduction

림프절 (LN)은 선천적이고 적응성 면역 반응을 연결하는 중요한 기능을 가진 몸 전체에 널리 존재하는 난형 형 기관입니다. LN은 이물질과 암세포를 식별하기 위해 림프를 걸루어면역 반응을 장착한다 1. 항원 제시 세포(APC), T 세포 및 B 세포는 항원 특이적 항체(체액성 면역) 및 세포독성 림프구(cellular immunity)를생성하여 이물질 및 암세포를 제거하기 위해 함께 작용한다 2. 따라서, 림프계에 존재하는 면역 세포의 역학을 이해하는 것은 백신 개발 및 암 면역 요법에 중요한 영향을 미칠 것이다.

새로운 공초점 및 초고해상도 현미경을 포함한 강력한 현미경의 출현은 다른 면역 세포 집단이 그들의 모국환경에서어떻게 행동하는지 이해하는 특별한 발전을 허용했습니다 3. 이제 특정 표적4,^5의통제하에 형광 단백질을 발현하는 유전자 변형 마우스와 프로브의 조합을 사용하여 여러 동시 세포 아류형을 영상화할 수 있다. 실제로, 질량 세포 분석 및 다중 파라메트릭 흐름 분석을 포함한 고차원 기술은 건강과 질병의 다양한 면역 세포 구획화 및 기능에 대한 지식을 확장하는 데 매우 중요했습니다^{6, 7}. 그러나, 이러한 기술에 대한 샘플을 준비하기 위해, 조직은 소화가 필요하고 세포는 세포 현탁액에서 분석될 수 있도록 천연 밀리외에서 분리된다. 이러한 한계를 능가하고 생물학에서 더 나은 번역을 허용하기 위해, 여기에 제안 된 프로토콜의 목표는 개선 된 속도, 조직의 이점으로 스톡 공초점 현미경을 사용하여 생체 전체 림프절을 이미지화하는 간단한 방법론을 적용하는 것입니다. 기존의 면역형광 염색에 비해 구조 보존 및 세포 생존능력. 이 접근법을 사용하여, 우리는 γδ T 세포에 대한 결핍 마우스가 병원체에 대하여 호스트 초기 방어에 관여하는T 림프구의 특수형 4, 야생 형 마우스에 비해 여포 및 T 세포 영역을 손상했다는 것을 보여줄 수 있었습니다. 이 사실 인정은 우리가 γδ T 세포가 림프기관 및 체액 성 면역 반응의 항상성에 있는 중요한역할을 한다는 것을 설명한 연구 결과를 추구하는 것을 허용했습니다 4. 또한, 이 프로토콜은 프로브와 항체가 림프절에 도달하기 위한 생리적 경로를 제공하며, 피하 투여되고 조직 림프순환을 통해 소멸되기 때문에, situ labeling에 사용된 이전 보고서에 근거하여 림프 관련 구조를 시각화하는 항체8,^9,발아 중심 역학^10,11,12,혈류에 쉽게 접근할 수 있는 표적^{13 ,14,15}.

Protocol

이 프로토콜은 하버드 의과 대학과 브리검 여성 병원의 동물 상임위원회에 의해 승인되었다, 프로토콜 2016N000230.

1. 실험에 사용되는 마우스

1. 항체 혼합을 투여하기 위한 B6 배경에 8주 된 수컷 및 암컷 마우스를 사용한다.
2. CX3CR1^GFP/WTCCR2^RFP/WT 마우스를 사용하여 항체 혼합을 투여하지 않고 리포터 마우스에 전 생체 전체 LN 이미징을 적용할 수 있는지 여부를 결정하고 항원 제시를 포함한 단핵 세포의 존재를 조사할 수 있습니다. 세포와 식세포, 그리고 LN에서의 분포.
   참고: CX3CR1^GFP/WTCCR2^RFP/WT 리포터 마우스는 각각 CX3CR1 및 CCR2 프로모터의 제어 하에 삽입된 녹색 형광 단백질(GFP) 및 적색 형광 단백질(RFP)을 가지고 있습니다. 리포터 마우스는 항체 혼합물의 주입 유무에 관계없이 사용할 수 있다. 리포터 마우스에서 항체 혼합 주입에 대한 참조^4를 참조하십시오. 항체가 주입되지 않을 경우 수술을 진행하십시오.

2. 항체 혼합 준비 및 주입

참고: 1.1단계에서 설명된 마우스에서 이러한 단계를 수행합니다.

1. 1:10 의 화려한 보라색 (BV) 421 안티 CD4 (GK1.5; 0.2 mg/mL), 1:10 브릴리언트 블루(BB) 515 안티 CD19(1D3; 0.2 mg/mL) 및 1:20 의 피코에리트린(PE) 안티-F4/80 (T45-2342; 0.2 mg/mL) PBS내 허벅지에 주입할 수 있는 적절한 최종 부피(T45-2342; 0.2 mg/mL) 이미지 inguinal) 또는 발 패드에 (이미지 popliteal) 림프에.
   참고 : 아이소 타입으로 사용 : BV421 마우스 IgG2b, k 아이소 타입 제어 (R35-38; 0.2 mg / mL); PE 쥐 IgG2a, θ 이소형 제어 (R35-95; 0.2 mg/mL); BB515 쥐 IgG2a, θ 이소타입 제어 (R35-95; 0.2 mg/mL). 염색 항체를 변경하는 경우 올바른 등방형을 사용하십시오.
2. 인과 LN을 이미지화하기 위해, 100 μL의 항체 혼합물을 내부 허벅지 내로 피하주사한다(도1A). 대안적으로, 50 μL의 피하 혼합물을 발 패드내로 주입하여 포퓰리즘LN(도 2A)을 이미지화한다. 크기 0.30 mm × 13mm (30 게이지 × 1/2 인치)의 바늘로 섬세한 1 mL 인슐린 주사기 (인슐린 U-100)를 사용하십시오.
   참고 : 인큐니얼 LN 염색을위한 주사가 피하이고 근육 내 (i.m.)가 아닌지 확인하십시오.
3. 항체 혼합 주입 전에 동물을 마취시키지 마십시오.
4. 최소 3 시간 (inguinal dLN) 및 12 h (popliteal dLN) 포스트 주사를 기다려 장기를 제거합니다.
5. LN 세포 표지가 화려한 보라색 또는 화려한 청색과 같은 큰 폴리머 형광 염료를 사용하여 완전히 관찰되지 않는 경우, 대안으로 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), PE 및 알로피코시아닌 (APC)을 포함한 더 작은 형광을 사용하십시오.

3. 인구 배수 림프절을 제거하는 수술 절차

1. CO2 질식을 이용한 안락사 마우스와 자궁 경부 탈구.
2. 접착제 테이프로 아크릴 단계에 마우스를 고정하고 절개 주위의 모피 침착을 방지하기 위해 복부 피부에 면봉으로 미네랄오일을 적용합니다 (그림 1B). 모피 제거는 필요하지 않습니다.
3. 치골에서 xiphoid 과정까지 복부에 미세 수술 곡선 가위 (11.5 cm) 및 미세 수술 곡선 집게 (12.5 cm)를 사용하여중간 선 절개를 수행합니다 (그림 1C).
4. 피부에서 복부 근육을 해리 (그림1D).
5. 수직 절개선의 위쪽과 아래쪽에 수평 피부 절개를 만들어 관심 있는 측면에 피부 플랩을 만들고(항체 혼합 주입의 측면에 따라) 피부를 플랩하여 림프절을 시각화합니다(그림1E).
6. 아크릴 플레이트에 피부 플랩테이프 (그림1F).
7. 미세 수술 곡면 집게를 사용하여 환각 배수 림프절을 제거 (그림1F). 림프절은 투명, 일반적으로 담즙, 피부 아래 구로 나타납니다.

4. 수술 절차는 popliteal 배수 림프절을 제거하는

1. CO2 질식을 이용한 안락사 마우스와 자궁 경부 탈구.
2. 접착제 테이프로 아크릴 단계에 경향이 위치에 마우스를 고정하고 종아리와 무릎에 면봉으로 미네랄 오일을 적용 (그림2A-D).
3. 발 뒤꿈치에서 무릎까지 종아리에 중간 선 절개를 수행합니다 (그림2E,F).
4. 피부에서 종아리 근육을 해리 (그림2F,G).
5. 포퓰럴 포사(그림2G)를노출한다. 포물성 림프절은 포물엽 fossa에서 반투명 구체로 나타납니다.
6. 미세 수술 곡면 집게를 사용하여 포피라이트 림프절을 제거 (그림 2G).
7. 또는, 척추 위치에 마우스를 뒤집어, 이두근 femoris와 popliteal LN 제거를위한 반텐디노스 사이의 popliteal fossa에 접근 발 뒤꿈치에서 무릎에 종아리에 중간 절개를 수행한 후 종아리의 해리에 의해 피부에서 근육.
   참고 : Popliteal fossa는 무릎 관절의 뒤쪽에있는 얕은 우울증입니다. 조심스럽게 열어 서 포피 라이트 림프절을 볼 수 있습니다.

5. 림프절 준비

1. 전체 장기를 유리 바닥(35 mm x 10 mm)으로 배양 접시에 넣고 미세 수술 곡면 집게를 사용하여 장기를 둘러싸는 지방을 제거합니다(그림1G-I 및 그림 2H).
2. 접시 중간에 오르간을 중앙 집중화합니다(그림1J 및 그림 2H).
3. 섬세한 작업 와이퍼의 조각으로 기관을 덮고 실온 식염수 0.9 % 또는 인산완충액으로 담근 상태로 유지하십시오 (그림1K-M 및 그림 2H).
   참고 : 제거 후 림프절을 씻거나 후드에서 림프절 추출을 수행 할 필요가 없습니다.

6. 생체 내 공초점 현미경 검사법 (이미징)

1. 페트리 접시를 역공초점 현미경 슬롯에 위치(그림1N 및 도 2H).
2. 공초점 현미경 하에서 의 이미지 LN(그림1O 및 도 2H).
3. 먼저, 공초점 현미경의 종래의 빛을 4x 또는 10x 객점으로 이용하여 정확한 초점을 얻는다. 그런 다음 광 기능에서 레이저 모드로 변경합니다.
   참고: 공초점 현미경에 4x 목표가 없는 경우 10x 대물렌즈를 사용하여 포커스를 완벽하게 얻을 수 있습니다.
4. 이소타입 염색, 비염색 또는 비형광 시료를 이용하여 레이저 파워, 오프셋 및이득을 조절하여 자가형광및 비특이적 염색을 제거하는 등 이미지에 사용된 항체와 같은 형광 표지 항체로부터의 비특이적 염색을 이것으로 나타났다. 원고 (BV-421 안티 CD4, BB515 안티 CD19 및 PE 안티 F4 / 80).
5. 림프절의 관심 영역에서 각각 마이크로 메트릭 및 전차를 사용하여 Z 및 XY 위치를 조정합니다.
6. LN 구조 및 셀룰러 분포에 초점을 맞춘 4x, 10x 및 20x 목표 에서 이미지를 수집합니다. 1024 x 1024 픽셀 정의를 사용합니다.
   참고: 동물당 목표당 다른 필드에서 최소 5개의 이미지를 획득합니다.
7. 이미지 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석하여 채널을 분리하고, 관심 있는 배율과 색상을 추가하고, 3D 뷰를 재구성합니다.

Results

이 원고는 이러한 장기의 특정 세포 집단을 염색하기 위해 형광 표지 된 항체를 주입 한 후 구조를 손상시키지 않고 인과 성 림프절을 제거하는 기술을 보여줍니다 (그림1 및 그림 2 ).

LN 세포의 면역 라벨링과 BV421 항 CD4 및 BB515 항 CD19 및 공초점 이미징 분석의 강력한 조합은 인과 및 포퓰리터 LN에서 T 세포 (CD4+) 및 B 세포 (CD19+)의 국소화를 정의했습니다. 두 기관 모두에서, B 세포 여포는 T세포 집단에 의해 포위되었다 (도 3, 도 4 및 비디오1), LN 구조의 특징^1. 림프부 내막의 식세포가 주입된 형광 항체를 포착하고 세포 마커의 비특이적 라벨링을...

Discussion

분자 생물학 및 고차원 면역 phenotyping를 포함하여 그밖 기술과 화상 진찰의 조합은 그들의 본래 문맥에 있는 면역 세포를 조사하는 우리의 기능을 강화했습니다. 사실, 다른 접근법은 조직 소화와 세포 분리를 요구할 수 있지만 - 조직 무결성의 손실로 이어질 수 있습니다 - 생체 내 또는 생체 내 이미징의 사용은 지리적 방식으로 다른 세포 아류형을 조사하는 데 큰 이점을 부여합니다^{3 , 16}. 세포가 특별히 다른 형광체를 발현하도록 표적으로 하는 유전자 변형 마우스 균주의 가용성이 급속히 증가하고 있다는 것은 놀라운 일이 아니다. 중요한 것은, 리포터 마우스와 항체 혼합물의 주사의 조합은 동일한 장기 4에서 생체 내 상이한세포 집단을 염색하는 강력한 도구이다. 더욱이, CRISPR/Cas9 같이 유전자 편집 공구의 대중화는 거의 모든 세포 모형이 그들의 선의의 위치

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BV421 항-CD4	BD 호라이즌	562891	GK1.5; 0.2 mg mL-1
BB515 항-CD19	BD 호라이즌	564509	1D3; 0.2 mg mL-1
BB515 쥐 IgG2a, κ Isotype Control	BD Horizon	564418	R35-95; 0.2 mg mL-1
BV421 Mouse IgG2b, K Isotype Control	BD Horizon	562603	R35-38 0.2 mg mL-1
Cellview 배양 접시	Greiner-Bio	627861	35x10 mm with glass bottom
Insulin syringes	BD Plastipak-Insulin		U-100
Kimwipes	Kimtech Science Brand	7557	크기 21 x 20 cm / 상자당 100 장
미세 수술 곡선 집게	WEP 수술 기구	맞춤 제작	12.5 cm
미세 수술 곡선 가위	WEP 수술 기구	맞춤 제작	11.5 cm
바늘	BD PrecisionGlide-30		게이지 × ½ 인치
Nikon Eclipse Te + A1R 컨포칼 헤드	Nikon	-	메인 4 레이저 라인 (405, 488, 543 및 647 nm)
PE anti-F4/80	BD Pharmigen	565410	T45-2342; 0.2 mg mL-1
PE 쥐 IgG2a, κ Isotype Control	BD Pharmigen	553930	R35-95; 0.2 mg mL-1
Zeiss LSM 710 컨포칼 현미경		Zeiss-4	레이저 라인(405, 488, 543 및 647 nm)