전 생체 내 공초점 현미경을 사용하여 림프절 구조 및 세포 국소화 시각화

Summary

이 프로토콜은 장기 구조의 변화없이 림프절을 배출하는 다른 세포 집단을 이미지화하는 기술을 설명합니다.

Abstract

림프절 (LN)은 타고난 면역 반응이 적응 면역과 연결할 수있는 신체 내에서 퍼지는 기관입니다. 사실, LN은 전략적으로 림프관의 경로에 개입되어 LN의 모든 상주 면역 세포와 조직 항원과 친밀한 접촉을 허용합니다. 따라서, 전 생체 내 LN 이미징을 사용하여 세포 조성, 분포, 위치 및 상호 작용을 이해하는 것은 신체가 국소 및 전신 면역 반응을 어떻게 조정시키는지에 대한 지식을 추가할 것이다. 이 프로토콜은 기존의 공초점 현미경 및 재고 시약을 사용하여 매우 재현 가능하고 수행하기 쉬운 방법론을 허용하는 형광 표지 항체의 생체 내 투여 에 따른 생체 내 이미징 전략을 보여줍니다. 항체의 피하 주입을 통해, 기존의 면역 형광 현미경 기술에 의해 잠재적으로 손상될 수 있는 조직 구조에 영향을 미치지 않고 배수 LN에 있는 다른 세포 인구를 표지하는 것이 가능합니다.

Introduction

림프절 (LN)은 선천적이고 적응성 면역 반응을 연결하는 중요한 기능을 가진 몸 전체에 널리 존재하는 난형 형 기관입니다. LN은 이물질과 암세포를 식별하기 위해 림프를 걸루어면역 반응을 장착한다 1. 항원 제시 세포(APC), T 세포 및 B 세포는 항원 특이적 항체(체액성 면역) 및 세포독성 림프구(cellular immunity)를생성하여 이물질 및 암세포를 제거하기 위해 함께 작용한다 2. 따라서, 림프계에 존재하는 면역 세포의 역학을 이해하는 것은 백신 개발 및 암 면역 요법에 중요한 영향을 미칠 것이다.

새로운 공초점 및 초고해상도 현미경을 포함한 강력한 현미경의 출현은 다른 면역 세포 집단이 그들의 모국환경에서어떻게 행동하는지 이해하는 특별한 발전을 허용했습니다 3. 이제 특정 표적4,^5의통제하에 형광 단백질을 발현하는 유전자 변형 마우스와 프로브의 조합을 사용하여 여러 동시 세포 아류형을 영상화할 수 있다. 실제로, 질량 세포 분석 및 다중 파라메트릭 흐름 분석을 포함한 고차원 기술은 건강과 질병의....

Protocol

이 프로토콜은 하버드 의과 대학과 브리검 여성 병원의 동물 상임위원회에 의해 승인되었다, 프로토콜 2016N000230.

1. 실험에 사용되는 마우스

1. 항체 혼합을 투여하기 위한 B6 배경에 8주 된 수컷 및 암컷 마우스를 사용한다.
2. CX3CR1^GFP/WTCCR2^RFP/WT 마우스를 사용하여 항체 혼합을 투여하지 않고 리포터 마우스에 전 생체 전체 LN 이미징을 적용할 수 있는지 여부를 결정하고 항원 제시를 포함한 단핵 세포의 존재를 조사할 수 있습니다. 세포와 식세포, 그리고 LN에서의 분포.
   참고: CX3CR1^GFP/WTCCR2^RFP/WT 리포터 마우스는 각각 CX3CR1 및 CCR2 프로모터의 제어 하에 삽입된 녹색 형광 단백질(GFP) 및 적색 형광 단백질(RFP)을 가지고 있습니다. 리포터 마우스는 항체 혼합물의 주입 유무에 관계없이 사용할 수 있다. 리포터 마우스에서 항체 혼합 주입에 대한 참조^4를 참조하십시오. 항체가 주입되지 않을 경우 수술을 진행하십시오.

2. 항체 혼합 준비 및 주입

Results

이 원고는 이러한 장기의 특정 세포 집단을 염색하기 위해 형광 표지 된 항체를 주입 한 후 구조를 손상시키지 않고 인과 성 림프절을 제거하는 기술을 보여줍니다 (그림1 및 그림 2 ).

LN 세포의 면역 라벨링과 BV421 항 CD4 및 BB515 항 CD19 및 공초점 이미징 분석의 강력한 조합은 인과 및 포퓰리터 LN에서 T 세포 (CD4+) 및 B 세포 (CD19+)의 국소화를 정의했습니다. 두 기관 모두에서, B 세포 여포는 T세포 집단에 의해 포위되었다 (도 3, 도 4 및 비디오1), LN 구조의 특징^1. 림프부 내막의 식세포가 주입된 형광 항체를 포착하고 세포 마커의 비특이적 라벨링을.......

Discussion

분자 생물학 및 고차원 면역 phenotyping를 포함하여 그밖 기술과 화상 진찰의 조합은 그들의 본래 문맥에 있는 면역 세포를 조사하는 우리의 기능을 강화했습니다. 사실, 다른 접근법은 조직 소화와 세포 분리를 요구할 수 있지만 - 조직 무결성의 손실로 이어질 수 있습니다 - 생체 내 또는 생체 내 이미징의 사용은 지리적 방식으로 다른 세포 아류형을 조사하는 데 큰 이점을 부여합니다^{3 , 16}. 세포가 특별히 다른 형광체를 발현하도록 표적으로 하는 유전자 변형 마우스 균주의 가용성이 급속히 증가하고 있다는 것은 놀라운 일이 아니다. 중요한 것은, 리포터 마우스와 항체 혼합물의 주사의 조합은 동일한 장기 4에서 생체 내 상이한세포 집단을 염색하는 강력한 도구이다. 더욱이, CRISPR/Cas9 같이 유전자 편집 공구의 대중화는 거의 모든 세포 모형이 그들의 선의의 위치

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BV421 항-CD4	BD 호라이즌	562891	GK1.5; 0.2 mg mL-1
BB515 항-CD19	BD 호라이즌	564509	1D3; 0.2 mg mL-1
BB515 쥐 IgG2a, κ Isotype Control	BD Horizon	564418	R35-95; 0.2 mg mL-1
BV421 Mouse IgG2b, K Isotype Control	BD Horizon	562603	R35-38 0.2 mg mL-1
Cellview 배양 접시	Greiner-Bio	627861	35x10 mm with glass bottom
Insulin syringes	BD Plastipak-Insulin		U-100
Kimwipes	Kimtech Science Brand	7557	크기 21 x 20 cm / 상자당 100 장
미세 수술 곡선 집게	WEP 수술 기구	맞춤 제작	12.5 cm
미세 수술 곡선 가위	WEP 수술 기구	맞춤 제작	11.5 cm
바늘	BD PrecisionGlide-30		게이지 × ½ 인치
Nikon Eclipse Te + A1R 컨포칼 헤드	Nikon	-	메인 4 레이저 라인 (405, 488, 543 및 647 nm)
PE anti-F4/80	BD Pharmigen	565410	T45-2342; 0.2 mg mL-1
PE 쥐 IgG2a, κ Isotype Control	BD Pharmigen	553930	R35-95; 0.2 mg mL-1
Zeiss LSM 710 컨포칼 현미경		Zeiss-4	레이저 라인(405, 488, 543 및 647 nm)