Method Article

iPSC 유래 내피 선조의 혈관 전위를 정량화하는 체외 3D 모델 및 전산 파이프라인

DOI:

10.3791/59342

⸱

May 13th, 2019

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Texas at Austin

In This Article

Summary

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유도 된 만능 줄기 세포에서 파생 된 내피 전구체 (iPSC-EP)는 심혈관 질환 치료에 혁명을 일으킬 잠재력을 가지고 있으며 보다 충실한 심혈관 질환 모델을 생성 할 수 있습니다. 본 명세서에서, 3차원(3D) 콜라겐 미세환경에서 iPSC-EP의 캡슐화 및 이들 세포의 혈관전위액의 정량적 분석이 기재되어 있다.

Abstract

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유도된 만능 줄기 세포(iPSCs)는 임의의 체세포 유형으로 분화할 수 있는 환자 특이적, 증식성 세포 공급원이다. 성숙하고 기능적인 혈관을 조립하는 데 필요한 세포 유형으로 분화할 수 있는 이중내피 전구체(EP)는 배아 및 유도 만능 줄기 세포 모두에서 유래되었습니다. 그러나, 이 세포는 3차원 환경에서 엄격하게 평가되지 않았고, 그들의 혈관 전위도의 양적 측정은 애매하게 남아 있습니다. 여기서, 형광 활성화 세포 선별을 통한 iPSC-EP의 생성 및 격리가 먼저 설명되고, 그 다음에 콜라겐 하이드로겔에서 iPSC-EP의 캡슐화 및 배양에 대한 설명이 뒤따랐다. 이 세포외 매트릭스 (ECM)모방 미세 환경은 강력한 혈관 반응을 장려합니다. 혈관 네트워크는 배양의 주 후에 형성됩니다. 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 이러한 혈관 반응을 정량화하는 계산 파이프라인의 생성이 설명됩니다. 이 파이프라인은 모세관 신경총의 3D 아키텍처를 보존하여 최소한의 사용자 입력으로 분기, 분기 점 및 전체 네트워크 길이를 강력하게 식별하도록 설계되었습니다.

Introduction

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인간 배꼽 정맥 내피 세포(HUVECs) 및 기타 1차 내피 세포 유형은 2년 동안 시험관내 혈관 발아및 발달을 모델링하기 위해 활용되어 왔다. 이러한 혈관 플랫폼은 심혈관 질환의 분자 및 조직 수준 메커니즘을 조명할 것을 약속하고 원시 혈관네트워크의 발달에 대한 생리학적 통찰력을 제시할 수 있다 2,3. 혈관 모델링 분야는 상당한 발전을 목격했지만 생리학적 혈관 발달을 정량적으로 모델링하고 평가할 수 있는 "금 본위제" 분석은 여전히 애매합니다. 대부분의 출판된 프로토콜은 성숙하고 기능적인 혈관의 형성을 장려하기 위해 혈관 틈새 시장을 적절히 회수하지 못하거나 평가된 세포 유형의 혈관 전위를 3차원으로 정량적으로 비교하는 방법이 없는 경우( 3D).

많은 현재 혈관 모형은 생리적인 혈관 틈새시장을 모방하는 그들의 기능에 있는 제한됩니다. 시험관내 에서 가장 일반적으로 사용되는 것 중 하나는 젤라틴 단백질 혼합물 계 튜브 형성 분석이다. 간략하게, HUVECs는 뮤린 육종 세포 외 매트릭스 (ECM)에서 수확 한 단백질로 구성된 겔의 얇은 층에 단일 세포로 시드된다; 1 ~ 2 일 이내에 HUVE....

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Protocol

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1. 배양 배지 및 코팅 솔루션 의 준비

  1. 비트로넥틴 코팅 용액을 준비하려면, 덜베코의 인산완충식염수(DPBS)에서 비트로넥틴 1:100을 희석합니다.
    주의: 희석후에는 나중에 사용할 수 있도록 이 솔루션을 보관하지 않는 것이 좋습니다.
  2. 페놀을 적색으로 받으면, 성장 인자 감소 젤라틴 단백질 혼합물(재료 표참조)을 제조업체로부터 받은 후, 혼합물이 투명하고 유체가 될 때까지 4°C에서 얼음을 해동한다. 혼합물을 층류 후드에 얼음 위에 유지시키고, 혼합물의 피펫 75 μL을 1.8 mL 마이크로원심지 튜브에 넣고 즉시 -20°C에서 동결한다. 이 알리쿼트는 최대 1년 동안 보관할 수 있습니다.
    주의: 이 젤라틴 단백질 혼합물은 실온에서 보관할 때 매우 점성이 있으며 더 높은 온도에서 굳어질 것입니다. 이 용액을 얼음으로 차갑게 유지하십시오.
  3. 코팅을 위해 이 혼합물을 준비하려면 얼음 에 75 μL aliquot를 녹이고 얼음 차가운 덜베코의 변형 된 독수리 매체 6 mL로 희석하십시오 : 영양소 혼합물 F-12 (DMEM / F12). 이 준비된 부피는 12개의 웰 플레이트를 코팅하기에 충분하다.
  4. 아스코르브산 마그네슘-2-인산염(백색 호색애 분말)의 100 mg/mL 스톡 용액을 10 ....

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Results

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분화 후(그림1), FACS 및 콜라겐 하이드로겔에서 iPSC-EP의 캡슐화 후, 세포는 전형적으로 초기 루멘을 마이그레이션하고 형성하기 시작하기 전에 24 시간 동안 반올림된 상태로 유지됩니다. 배양의 대략 6 일 후에, 원시 모세관 신경총은 밝은 필드 현미경 검사법으로 볼때 하이드로겔에서 볼 수 있을 것입니다 (그림 2). 공초점 현미경상에서 고정된 스테인드 셀-라덴 하이드로겔을 이미징한 후(Movie1, 보충 영화1), 사전 처리된 이미지는 네트워크의 전체 길이 및 연결성 분석을 가능하게 하는 골격으로 변환된다. 이러한 정량적 측정은 강력한 혈관 네트워크를 생성하는 데 최적의 조건 집합을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

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Discussion

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이 프로토콜은 E8, LaSR 기저, 및 EGM-2의 세 가지 유형의 세포 배양 배지에서 세포의 장기 배양을 포함한다. 따라서 모든 물질을 적절하게 살균하기 위해 세심한주의를 기울여야합니다. 또한 실험실 코트와 에탄올 세척 장갑은 실험실의 층류 후드에서 작업할 때 항상 착용해야 합니다. 마이코 플라즈마 오염을 자주 테스트하는 것이 좋습니다. iPSC 배양 중에 다량의 파편이 관찰되는 경우 또는 분화 효율의 급격한 하락이 주목된다면, 마이코플라즈마 오염이 원인일 가능성이 높다. 이 프로토콜로 생성된 iPSC-EP는 상당량의 ECM을 증착하는 경향이 있으며, 이는 해리 시간을 연장시키고 단일 세포 현탁액이 작은 덩어리로 분리되도록 한다. 솔루션이 iPSC-EP에서 CD34 에피토프를 방해할 수 있기 때문에 트립신-EDTA(0.25%)를 사용하지 마십시오. 그러나 콜라게나제/디스파제 용액을 사용하면 증착된 ECM을 제거하고 표준 세포 분리 용액으로 해리를 용이하게 할 수 있습니다. 광범위 한 해리 후, 세포와 ECM의 일부 작은 덩어.......

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Disclosures

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저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgements

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이 작품은 미국 심장 협회 (교부금 번호 15SDG25740035, J.Z.에 수여), 국립 보건원의 생물 의학 영상 및 생명 공학 (NIBIB)의 국립 연구소 (보조금 번호 EB007507, C.C.에 수여), 및 재생 재활 연구 및 훈련을위한 연합 (AR3T, 부여 번호 1 P2C HD086843-01, J.Z.에 수여). 우리는 공초점 현미경 검사법에 대한 그녀의 기술적인 조언을 위해 Jeanne Stachowiak 교수 (오스틴텍사스 대학)를 인정하고 싶습니다. 우리는 또한 사무엘 미헬릭 (오스틴 텍사스 대학), 알리시아 알렌 박사 (오스틴 텍사스 대학), 줄리 Rytlewski 박사 (적응 생명 공학), 박사 레온 벨란 (밴더빌트 대학)와 의논에 감사드립니다 3D 네트워크의 계산 분석. 마지막으로, 우리는 박사 샤오 핑 바오 (캘리포니아 대학, 버클리) iPSC-EP로 iPSCs를 차별화에 대한 그의 조언에 감사드립니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
µ-Slide AngiogenesisIbidiN/A측벽이 있는 평평한 유리 바닥 조직 배양 플레이트는 손쉬운 컨포칼 이미징을 가능하게 합니다
96 well, 둥근 바닥, 초저 부착성 마이크로플레이트, 멸균Corning7007세포 배양 접시에 세포가 함유된 콜라겐 하이드로겔의 결합을 방지합니다.
AccutaseSTEMCELL Technologies7920부드러운 세포 분리 솔루션; FACS
Advanced DMEM/F12Thermo Scientific12634010iPSC-EP 분화를 위한 기본 배지
반스테드 젠퓨어 xCAD 플러스 Thermo Fisher Scientific50136165 정수 시스템; 다른 것들은 쉽게 대체 될 수
소 혈청 알부민 용액, 7.5 % DPBS, 멸균 여과, BioXtra, 세포 배양에 적합Fisher ScientificA8412세포 생존력을 보존하기 위해 FACs 분류
CD34-PE, 인간 (클론 : AC136)Miltenyi Biotec130-098-140iPSC-EPs
의 FAC 분리에 사용되는 항체CHIR99021LC LaboratoriesC-6556만능 줄기 세포에서 중배엽 형성 유도
콜라겐 I 쥐 꼬리 고단백 100mgVWR3542493D 미세환경
원추형 원심분리기 튜브(15/50mL)Fisher Scientific14-959-49D/A비교적 많은 양의 시약 및 세포 배양 배지
를 저장하고 혼합하는 데 사용됩니다.DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Thermo Fisher ScientificD1306세포핵 DMEM
/F12 DMEM/F12Thermo Fisher Scientific11320-082만능 줄기세포
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)ThermoFisher14190-250단층 배양
EDTA세척Sigma-AldrichE8008만능 줄기세포 콜로니의 패시징을 위해 그리고 FACs 분류 시 세포 응집을 방지하기 위해
내피 세포 성장 매체 2PromoCellC-22011내피 세포 생존 및 증식을 촉진하는
필수 8 매체Thermo Fisher ScientificA1517001   만능줄기세포의 유지를 위해
Glycine,BioUltra, 분자생물학, >=99.0% (NT)Sigma-Aldrich50046잔류 세제 중화
L-아스코르브산 2-인산 세스키마그네슘 염 수화물,>=95%Sigma-AldrichA8960iPSC-EP 분화 매체의 구성 요소
MATLABMathWorks1.8.0_152다중 패러다임 수치 컴퓨팅 환경(대부분의 교육 기관에서 무료로 제공)
Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 mL (젤라틴 단백질 혼합물)Fisher Scientific356231iPSC-EP 분화를 위해 플레이트를 코팅하기 위해 DMEM/F12로 희석
Medium-199 10XThermo Fisher Scientific1825015최종 하이드로겔 삼투압과 pH
미세 원심분리 튜브(1.7 mL)VWR87003-294소량의 시약을
보관합니다.인산염 완충 식염수(PBS)Sigma-AldrichP3813면역염색 용액의 주성분
페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122FACS 기기에서 가능한 오염을 제거하기 위해 분류 후 사용하는 항생제
재조합 인간 VEGF 165 단백질R& D Systems293-VE내피 세포 증식 및 세뇨관 형성을 자극하는 미토겐
로다민 남근Themo Fisher ScientificR415F-액틴 침착을 식별하고 혈관 네트워크의 경계를 윤곽화하기 위해
Triton X-100 (비이온 성 계면 활성제)Sigma-AldrichX-100세포를 부드럽게 투과시키는 데 사용되는 세제
Tween-20 (유화 시약)Fisher ScientificBP337결합 특이성을 증가시킵니다
.콜라겐 하이드로겔에서 3D 내피 내강을 식별하기 위해
VitronectinThermoFisherA14700만능 줄기세포 유지용
Y-27632Selleck ChemicalsS1049해리 및 재파종 시 만능 줄기세포와 iPSC-EP 생존력 보존
에 필수적인 세포외 에피토프를 분해하지 않습니다. 있습니다 의 주성분의 균형을 맞추는 데 사용됨 형성 은 추가된 항체 VE-Cadherin (F-8)Santa Cruz Biotechnology sc-9989의

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, K., Lin, R. -Z., Melero-Martin, J. M. Bioengineering human vascular networks: trends and directions in endothelial and perivascular cell sources. Cellular and Molecular Life Sciences. , 1-19 (2018).
  2. Kant, R. J., Coulombe, K. L. K.

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iPSC Derived Endothelial ProgenitorsFluorescent Activated Cell SortingCollagen Hydrogel EncapsulationVasculogenic Potential Quantification3D Vascular Network FormationConfocal Microscopy AnalysisOpen Source Computational PipelineEndothelial Growth Medium 2ROCK Inhibitor Y 27632Vascular Endothelial Growth Factor

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