방법 논문

CRISPR/Cas12a 멀티플렉스 게놈 편집 사카로미세세세레비시아와 이스트 픽셀 아트의 창조

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DOI:

10.3791/59350

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2019년 5월 28일

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1DSM Biotechnology Center, 2Biochemistry and Molecular Biology, Department of Chemistry, University of Hamburg, 3BrisSynBio, University of Bristol, Life Sciences Building, 4School of Biological Sciences, University of Bristol, Life Sciences Building

이 논문에서

요약

단일 crRNA 어레이와 결합된 CRISPR/Cas12a 시스템은 여러 로시에서 동시에 S. 세레비시아 게놈의 효율적인 멀티플렉스 편집을 가능하게 합니다. 이것은 이후에 효모 픽셀 예술을 만드는 데 사용되는 효모 균주를 생산하는 카로티노이드를 구성하여 입증됩니다.

초록

고효율, 사용 편의성 및 클러스터된 정기적인 간격짧은 palindromic 반복/CRISPR 관련 단백질 9 (CRISPR/Cas9) 시스템은 사카로마이스 세레비시아의고급 유전자 변형을 촉진시켰습니다. 산업 생명 공학의 유기체 및 주력. CRISPR 관련 단백질 12a (Cas12a), Cas9와 구별되는 특징을 가진 RNA 유도 엔도뉴클러가 이 작업에 적용되어 게놈 편집을 위한 분자 도구 상자를 더욱 확장합니다. CRISPR/Cas12a 시스템의 장점은 단일 전사 유닛(단일 CRISPR RNA(crRNA) 어레이로부터 발현되는 다중 가이드 RNA를 이용한 멀티플렉스 게놈 편집에 사용될 수 있다는 것이다. 우리는 단일 crRNA 어레이 구조에서 발현된 다중 crRNA를 가진 CRISPR/Cas12a 시스템을 사용하여 S. 세레비시아 게놈의 독립적인 궤체로 다중 이종 유전자의 다중 통합을 위한 프로토콜을 제시합니다. 제안된 방법은 S. cerevisiae가 DNA 단편의 생체 내 재조합을 수행하여 단일 crRNA 어레이를 변형제 선택뿐만 아니라 기증자 DNA의 조립에 사용할 수 있는 플라스미드로 조립하는 능력을 이용합니다. 의도된 위치에서 게놈에 통합되는 서열. Cas12a는 단일 crRNA 어레이의 발현 시 의도된 위치에서 S. 세레비시아 게놈의 절단을 용이하게 구성적으로 미리 발현된다. 이 프로토콜은 단일 crRNA 어레이 및 공여자 DNA 발현 카세트의 설계 및 시공을 포함하고 있으며, 고유한 50bp DNA 커넥터 서열과 별도의 통합 측면 DNA 서열을 사용하여 단순화하는 통합 접근 방식을 활용합니다. 표준화 및 모듈화를 통한 실험 설계및 적용 범위를 확장합니다. 마지막으로, 우리는 구성 된 효모 균주를 생산하는 다른 색깔의 카로티노이드를 사용하여 음향 액체 처리기로 효모 픽셀 아트를 만드는 간단한 기술을 보여줍니다.

서론

CRISPR/Cas 효소는 의심할 여지없이 분자 생물학에 혁명을 일으켰으며 이전에는 실현 불가능한 속도로게놈공학 도구로 널리 채택되었습니다 1. CRISPR/Cas9 게놈 편집 시스템에 의한 사카로마이세스 세레비시아 게놈의 첫 번째 변형은 디카를로 외에 의해 보고되었다. 2,성공적인 유전자 녹아웃을 시연하고 외부적으로 도입 된 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 포인트 돌연변이를 만듭니다. 추가 효모 CRISPR 툴박스 개발 포함: 촉매 비활성 죽은 Cas9 (dCas9)와 전사 이펙터 도메인의 융합에 의한 전사조절 3, 둘 다에 대한 응용 프로그램 동시 활성화, 억압 및 결실에 의한 대사 경로 공학을 위한게놈 편집 및 규제 기능 4, S. cerevisiae 게놈5,다중 염색체 융합에서 큰 파편의 삭제6 .

CRISPR/Cas 게놈 편집 시스템은 박테리아와 고고학의 적응형 면역 계통에서 기원을 발견하며, 이러한 시스템은 게놈 편집을 위해 분자 생물학자에 의해 조정되었습니다. 그들의 기능은 외국 DNA 또는 RNA및 RNA 유도를 인코딩하는 CRISPR 관련 유전자 (Cas)의 인식에 책임 있는 RNA를 인코딩하는 군집된 정규 간격 짧은 Palindromic 반복 (CRISPR) DNA 지구에 근거를 두었습니다 endonucleases1,7,8,9. CRISPR/Cas 시스템의 최근 게놈 분석을 기반으로 CRISPR/Cas 시스템을 두 가지 클래스, 5가지 유형 및 16개의 아류형10으로나눌 것을 제안했습니다. 두 클래스는 대상 분열에 관련된 이펙터 복합체의 조직에 따라 구별된다. 전형적으로, 다중 소단위 조직을 가진 CRISPR/Cas 시스템은 클래스 1로 분류되는 반면, 단일 서브유닛 이펙터 컴플렉스는 클래스 210,11에속한다. 이 문서에서는 클래스 2 유형 II Cas9에 대한 대안인 Cpf110,12라고불리는 클래스 2 형식 V Cas12a를 살펴봅습니다. Cas9는 잘 특성화되어 널리 연구에 사용되지만 Cas12a는 추가 기능12를제공합니다. 첫째로, Cas12a는 추가적인 트랜스 활성화 CRISPR RNA(tracrRNA)를 요구하지 않고 42~44개의 뉴클레오티드의 CRISPR RNA(crRNA)를 가진 복합체를 형성한다. 따라서, 더 짧은 가이드 RNA는 CRISPR/Cas9에 비해 CRISPR/Cas12a 시스템을 사용하여 게놈 편집에 사용될 수 있다. 둘째, Cas12a의 독특한 엔도뉴클리스 및 엔도리보뉴클리스 활성은 프리 crRNA13의성숙을 가능하게 한다. 이 RNase 활동은 단일 CRISPR crRNA 배열상에 다중 crRNA의 인코딩을 허용하는 반면, Cas9는 각각의 소위 단일 가이드 RNA(sgRNA) 또는 대안적으로 추가엔도뉴클러의 발현을 필요로 한다( 예를들어, Csy4)는 각 sgRNA14,15를둘러싸는 Csy4에 대한 인식 모티프와 함께 한다. 셋째, Cas12a 대상 사이트 인식은 대상에서 5' 끝에서 protospacer 인접 모티프 (PAM)를 필요로하고 고정 된 끝으로 절단 된 DNA를 초래하는 PAM에서 +18 /+23 위치 후 갈라진 반면 Cas9는 3 '끝에서 PAM을 필요로합니다. DNA12에서무딘 끝 절단을 만드는 -3 위치 후에 표적 및 절단. 넷째, PAM의 합의 뉴클레오티드 서열은 Cas12a(((T)TTV)와 Cas9(NGG) 사이에서 다르며, 이는 Cas12a를 T-풍부 프로모터 및 터미네이터 서열을 표적으로 하는 유망한 후보(16)를 만든다. 마지막으로, 최근 연구는 네이티브 Cas917에대 한 보다 Cas12a에 대 한 더 큰 대상 특이성을 보고.

우리는 독립적 인 게놈 로시에 여러 DNA 발현 카세트를 동시에 도입에 특히 초점을 맞춘 S. cerevisiae의 게놈 편집을위한 CRISPR / Cas12a 시스템을 사용하기위한 프로토콜을 제시합니다 (멀티 플렉스 게놈 편집)을 사용하여 단일 crRNA 배열. 프로토콜의 주요 단계는 그림 1에설명되어 있습니다. 개념의 증명으로, CRISPR/Cas12a 시스템은 도2에 도시된 바와 같이 β-카로틴18의 생산을 가능하게 하는 S. cerevisiae의 게놈내로 3개의 발현 카세트를 도입하기 위해 적용되었다. β-카로틴의 생산은 S. 세레비시아의표현형에 영향을 미칩니다 : 즉, 카로티노이드 생합성에 필요한 세 가지 이종 유전자를 성공적으로 도입하면 백색 S. 세레비시아 세포가 노란색 또는 주황색으로 변합니다. 각 유전자의 발기인의 발현 강도에 따라 달라집니다. 이 통로의 간단한 시각적 판독으로 인해, 그것은 게놈 편집을위한 고급 CRISPR 기반 시스템 및 방법을 개발하기 위해 도입되었다19,20. 이 작품에서, 카로티노이드 유전자 crtE, crtYB 및 crtI를 코딩하는 발현 카세트는 이종 프로모터 및 상동성 종기를 이용한 골든 게이트 클로닝(GGC) 접근법21을 사용하여 제작되었습니다. 유전자의 발현을 유도하는 데 사용됩니다. 발현 카세트는 커넥터라고 불리는 고유한 50-base 쌍(bp) 서열로 둘러싸여 있으며, 동일한 50bp 서열과 동일한 50bp 서열과 통합 측면 DNA 서열(flanking regions)을 사용하여 생체 내 조립을 허용합니다. 측면 부위에 의해 결정된 위치에서 효모의 게놈 DNA로 들어갑니다. 상이한 프로모터 강도를 사용하여, 카로티노이드 생산의 상이한 수준을 가진 균주는 세포의 색깔에 있는 변이의 결과로 얻어졌다. "효모 예술 프로젝트"22에서 영감을 얻은 이 균주는 로잘린드 프랭클린의 4색 고해상도 "효모 사진"을 만들기 위해 음향 액체 핸들러와 함께 스포팅 셋업에 사용되었습니다. 프랭클린 (Franklin, 1920-1958)은 사진 5123,24,25에의해 DNA 구조의 발견에 그녀의 기여로 잘 알려진 영어 화학자 및 X 선 결정기.

프로토콜

1. Cas12a 플라스미드의 준비

참고: 라크노스피플라과 박테리아 ND2006 Cas12a(LbCpf1, pCSN067)를 함유하는 플라스미드는 S. 세레비시아에발현에최적화된 코돈, 이전에 19개 시공되었으며, 플라스미드 저장소에 증착되었다(표 참조 재료)를 참조하십시오. 이는 칸MX 저항 마커 유전자를 함유하는 단일 카피 에피소말 S. 세레비시아/E.대장균 셔틀 플라스미드로, 유전학에 대한 S. 세레비시아형 형질전환제의 선택을 허용한다(G418).

  1. pCSN067 플라스미드를 구하십시오(재료 표참조).
  2. pCSN067 플라스미드를 증폭하여 높은 양을 얻었다.
    1. 제조업체의 프로토콜에 따라 플라스미드 pCSN067로 구입한 화학적으로 유능한 대장균 세포의 25 μL을 변환합니다. 2x 펩톤 효모 (PY)에 변형 혼합을 10 및 50 회 희석하십시오. 암피실린 (0.1 g / L)을 함유 한 2 x PY 한천 플레이트에 10 x 및 50 x 희석을 플레이트하고 37 °C에서 밤새 배양하십시오.
    2. 2~3개의 콜로니를 선택하고 각 콜로니를 2x PY의 3 mL로 접종하고 180 rpm에서 흔들리는 인큐베이터에서 37°C에서 밤새 자랍니다.
    3. 제조업체의 지침에 따라 플라스미드 정제 키트를 사용하여 플라스미드를 정화합니다.

2. 단일 crRNA 배열 발현 카세트의 제조

  1. 단일 crRNA 배열을 준비합니다.
    참고: 단일 crRNA 어레이는 S. 세레비시아2로부터의 SNR52 RNA 폴리머라제 III 프로모터를 포함하며, LbCas12a 및 스페이서(게놈 표적 서열)에 대해 특이적으로 반복되며, 각 표적19 및 말단에 대해 함께 반복된다. S. cerevisiae2에서 SUP4 종기와 함께 . 단일 crRNA 어레이는 선형화된 플라스미드 pRN1120으로 생체 내 재조합하여 원형 플라스미드를 생성하여 조립되므로, 따라서 플라스미드pRN1120에 상동성 영역은 단일 crRNA 어레이의 시작과 끝에 존재해야 합니다(도 2A 참조) ). 설계crRNA의 수의 기능을 별도로19로미리 평가하는 것이 좋습니다. 이 정보는 이후에 다중화 목적을 위한 단일 crRNA 배열을 생성하기 위해 직접 반복 및 스페이서 서열로 이들을 결합하기 위해 대부분의 기능적인 crRNA를 선택하는 데 사용된다.
    1. 멀티플렉스 게놈 편집 실험을 위한 단일 crRNA 어레이를 합성 DNA로 주문합니다(보충 표1에서 단일 crRNA 어레이의 DNA 서열을 참조하십시오).
    2. 정렬된 단일 crRNA 어레이(예: 프라이머 KC-101 및 KC-102(보충표2)를 사용하여 증폭합니다. 함유 된 PCR 증폭 믹스를 준비하십시오 : DNA 폴리머라제 0.5 μL, DNA 폴리머라제에 필요한 5x 버퍼의 10 μL, 10 mM dNTP의 1 μL, 10 μM 포워드 프라이머의 2.5 μL, 10 μM 역프라이머의 2.5 μL, 5 ng/μl의 농도에서 DNA 템플릿 2 μL 2개 O 최대 50 μL의 총 부피.
      1. 다음 프로그램을 사용하여 열사이클러에서 반응을 수행합니다: (i) 3분 동안 98°C, 10초 동안 98°C, (iii) 20초동안 60°C, (iv) 15초동안 72°C – 반복 단계 (ii) 내지 (iv) 30회, (v) 5분 동안 72°C(vi) 12°C에서 유지한다.
    3. 100 내지 10,000 bp의 범위에서 DNA 로딩 염료 및 DNA 사다리를 사용하여 40 분 동안 5 V /cm에서 0.8 % 아가로즈 겔에서 샘플을 실행하여 전기 동공에 의한 PCR 제품을 분석합니다.
    4. 제조업체의 지침에 따라 PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 제품을 정화합니다.
  2. 단일 crRNA 어레이 수신자 플라스미드를 준비합니다.
    참고: 단일 crRNA 어레이는 S. 세레비시아/대장균셔틀 플라스미드 pRN112019로부터 발현된다(재료표 참조). 이러한 다중 카피 플라스미드는 Nourseothricin (NTC)에 S. 세레비시아형 형질전환제의 선택을 허용하는 NatMX 저항 마커 유전자를 함유하고 있다.
    1. pRN1120 플라스미드를 구한다.
    2. pRN1120 플라스미드를 증폭하여 높은 양을 얻었다.
      1. 제조업체의 프로토콜에 따라 플라스미드 pRN1120으로 구입한 화학적으로 유능한 대장균 세포의 25 μL을 변환합니다. 2x PY에서 변환 혼합물을 10 번 및 50 회 희석하십시오. 암피실린 (0.1 g / L)을 함유 한 2 x PY 한천 플레이트에 10 x 및 50 x 희석을 플레이트하고 37 °C에서 밤새 배양하십시오.
      2. 2~3개의 콜로니를 선택하고 각 콜로니를 2x PY의 3 mL로 접종하고 180 rpm에서 흔들리는 인큐베이터에서 37°C에서 밤새 자랍니다.
      3. 제조업체의 지침에 따라 플라스미드 정제 키트를 사용하여 플라스미드를 정화합니다.
    3. 에코RI-HF 및 XhoI로 플라스미드 pRN1120을 선형화합니다. 이를 위해, pRN1120, 10x 버퍼의 5 μL(1x 버퍼에는 50mMM아세테이트, 20mMM 트리스 아세테이트, 10 mM 마그네슘 아세테이트, 100 μg/mL 소 혈청 알부민[BSA]; pH 7.9)로 구성된 소화 혼합물을 준비한다. , XhoI(20 U)와 초순수H2O의 1 μL은 총 부피 50 μL까지. 소화 혼합을 37°C에서 2시간 동안 인큐베이션하고 65°C에서 20분 동안 비활성화한다.
    4. 100 내지 10,000 bp의 범위에서 DNA 로딩 염료 및 DNA 사다리를 사용하여 아가로즈 겔(0.8%, 40분, 5V/cm)에 전기 동공에 의해 선형화된 플라스미드를 분석한다. 대조군으로서 분석에 원형 플라스미드를 포함한다.
    5. 제조업체의 지침에 따라 PCR 정제 키트를 사용하여 선형화된 플라스미드를 정화합니다.

3. 프로모터-ORF-터미네이터(POT) 기증자 DNA 구성물의 준비

  1. 각 원소가 BsaI 사이트에 의해 측면에 있는 표준화된 4-bp 인식 서열을 포함하는 합성 DNA로서 상이한 강도의 프로모터(P) 세트를 주문하고, 개방 판독 프레임(O) 및 터미네이터(T) 서열을 합성 DNA로 주문하여 골든 게이트 클로닝(Golden Gate Cloning) GGC) 어셈블리(26)는 (보충표 3 및 보충표 4의시퀀스에서 상세한 설계 를 참조한다).
  2. GGC반응(21)을사용하여 4개 부품 어셈블리를 통해 프로모터, 개방 판독 프레임, 터미네이터 및 커넥터 서열로 구성된 POT 식 카세트를 이미 미리 지정된 50-bp 커넥터 서열을 포함하는 대상 벡터로 조립합니다. 보충 표 4 및 참조26,27)을참조하십시오.
    1. 분광광도계를 사용하여 DNA 부품의 농도를 측정합니다. 각 DNA 부분을 초순수H2 O에서 15 fmol/μL의 최종 농도로 희석합니다.
    2. DNA 단편으로 구성된 반응 혼합을 준비하십시오: 프로모터 2 μL, 오픈 리딩 프레임 2 μL, 터미네이터 2 μL 및 2 μL 백본(26에 기재된 레벨 1 대상 벡터), 5x T4 DNA 리가제 완충제 4μL, 1 U/μL T4 DNA 리가제 2.5 μL , 20 U/μL BsaI-HF 및 초순수 H2O의 1.5 μL은 총 부피 20 μL입니다.
    3. 다음 프로그램을 사용하여 열자전거에서 GGC 반응을 수행합니다: (i) 2분 동안 37°C, (ii) 5분 동안 16°C – 반복 단계(i) 및 (ii) 50회, (iii) 50°C에서 60분 동안, (iv) 80°C에서 45분 동안, (v) 추가 분석까지 12°C에서 유지한다.
  3. 제조자의 프로토콜에 따라 GGC 반응 혼합물의 3 μL로 구입한 화학적으로 유능한 대장균28 세포의 25 μL을 변환합니다. 2x PY에서 변환 혼합물을 10 번 및 50 회 희석하십시오. 암피실린 (0.1 g / L)을 함유 한 2 x PY 한천 플레이트에 10 x 및 50 x 희석을 플레이트하고 37 °C에서 밤새 배양하십시오.
  4. 2~3개의 콜로니를 선택하고 각 콜로니를 2x PY의 3 mL로 접종하고 180 rpm에서 흔들리는 인큐베이터에서 37°C에서 밤새 자랍니다.
  5. 제조업체의 지침에 따라 플라스미드 정제 키트를 사용하여 플라스미드를 정화합니다.
  6. POT 식 카세트가 PCR에 의한 GGC 반응에서 올바르게 조립되었는지 확인합니다.
    1. 각 표현식 카세트의 시작 및 끝에 존재하는 커넥터 서열에 상보적인 설계 프라이머(도 2B참조). 이 프로토콜에서 선택한 커넥터의 경우 KC-108에 프라이머 KC-103을 사용합니다(보충 표 2참조).
    2. 함유 된 각 플라스미드에 대한 PCR 증폭 믹스를 준비하십시오 : 교정 DNA 폴리머라제 0.5 μL, DNA 폴리머라제에 필요한 5x 버퍼의 10 μL, 10 mM dNTP의 1 μL, 10 μM 포워드 프라이머의 2.5 μL, 10 μM 역 프라이머의 2.5 μL, DNA 템플릿을 농축한 2 μL 5 ng/μL의 이온, 및초순수 H2 O 최대 50 μL의 총 부피.
    3. 다음 프로그램을 사용하여 열자전거에서 PCR 반응을 수행: (i) 98 °C 3 분, (ii) 98 °C 10 s에 대 한, (iii) 60 °C 20 s에 대 한, (iv) 2 분 30 초에 대 한 72 °C – 반복 단계 (ii) 30 배, (v) 5 분 동안 72 °C , (vi) 추가 분석이 될 때까지 12°C에서 유지한다.
      참고: 결과 PCR 제품은 5' 커넥터, 프로모터, 개방 판독 프레임, 터미네이터 및 3' 커넥터의 50-bp로 구성됩니다.
  7. 100 내지 10,000 bp의 범위에서 DNA 로딩 염료 및 DNA 사다리를 사용하여 40 분 동안 5 V / cm에서 0.8 % 아가로즈 젤에 샘플을 실행하여 전기 동거의 PCR 제품을 분석합니다.

4. 커넥터 서열을 포함하는 통합 측면 DNA 서열의 준비

  1. 야생형 S. 세레비시아에서 유전체 DNA를 정화한다.
    1. 효모 추출물 100 mL로 채워진 500 mL 쉐이크 플라스크에서 균주를 30°C에서 펩톤 덱스트로스(YEPD, 2% 포도당) 배지로 채우고 48시간 동안 250 rpm에서 흔들어 줍니다.
    2. 1분 동안 16,000 x g에서 2 mL의 국물을 원심분리하여 세포를 수확하고 상한액을 버립니다.
    3. RNase (10 μL, 10 mg / mL) 및 효모 용액 효소 (4 μL)로 생리적 염 (200 μL; 0.85 % NaCl 용액)에서 세포를 다시 중단하십시오. 세포 현탁액을 37°C에서 15분 동안 배양합니다.
    4. 300 μL의 세포 용해액을 추가하십시오 (재료 표참조) 및 소용돌이.
    5. 단백질 침전 액 168 μL(재료 표참조)과 와류를 20초 동안 힘차게 추가합니다.
    6. 단백질 분획을 16,000 x g 및 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 분리합니다.
    7. 실온에서 16,000 x g으로 10 분 동안 회전하여 DNA를 회복하십시오.
    8. 에탄올 200 μL (70 %)으로 펠릿을 씻으십시오. 실온에서 16,000 x g의 원심분리기를 10분 간 제거하고 상급기를 제거합니다. 뚜껑을 열고 10 분 동안 실온에서 튜브를 인큐베이션하여 에탄올을 증발시.
      참고: 튜브의 액체가 여전히 보이는 경우 4.1.8 단계를 반복합니다. DNA의 용해도 감소를 방지하기 위해 펠렛을 10 분 이상 건조시키지 마십시오.
    9. DNA를 TE 완충제 의 50 μL에 용해시다. 정제된 DNA를 4°C에 저장합니다.
  2. 각 통합 부위에 대해, 설계 통합 측면 DNA 서열(약 500bp)은 기증자 DNA의 도입 시 약 1000bp의 게놈 DNA를 제거할 수 있도록 합니다(도 2B의 회로도 설계 및 보충시퀀스 참조) 표4).
  3. PCR에 의해 측면 영역을 생성하는 프라이머를 설계합니다.
    1. 좌측 측면영역의 경우, 관심 있는 통합 부위의 5' 위치(왼쪽)에 위치된 게놈 DNA 영역의 약 500 bp를 증폭하기 위해 전진 및 역프라이머를 설계한다.
      참고: 정방향 프라이머에는 의도된 측면 영역이 있는 20 bp의 상동성이 포함되어 있습니다. 역방향 프라이머는 의도된 측면 영역을 가진 상동성을 가진 20 bp를 포함하고 나중에 게놈에 대한 Cas12a 편집에서 생체 내 조립을 가능하게 하는 원하는 50-bp 커넥터 서열을 포함한다.
    2. 오른쪽 측면영역의 경우, 관심 있는 통합 부위의 3' 위치(오른쪽)에 위치된 게놈 DNA 영역의 약 500 bp를 증폭하기 위해 전진 및 역프라이머를 설계한다.
      참고: 순방향 프라이머는 의도된 측면 영역을 가진 상동성을 가진 20 bp를 포함하고 나중에 게놈에 대한 Cas12a 편집에서 생체 내 조립을 가능하게 하는 원하는 50-bp 커넥터 서열을 포함한다. 역방향 프라이머는 의도된 측면 영역과 20 bp의 상동성을 포함한다.
  4. 디자인된 프라이머로 측면 영역을 증폭합니다(예: 보충 표2에 동봉된 KC-109에서 KC-120까지).
    1. PCR에서 템플릿역할을 할 정제된 게놈 DNA의 농도를 측정한다. DNA 농도를 50 ng/μL로 조정합니다.
    2. 게놈 DNA(1 ~ 4 μL 의 50 ng/μl 게놈 DNA 희석)로 구성된 PCR 증폭 혼합물을 4.1단계에서 정제하고, 전진 및 역프라이머(각각 10 μM), 10 μL의 10μL, DNA 폴리머아제에 필요한 5x 완충액의 10μL, DNA 폴리머아제0.5μl(DNA 폴리머아제 0.5μl) , 총 부피 50 μL까지 초순수H2O.
    3. 다음 프로그램을 사용하여 열자전거에서 PcR을 수행하십시오: (i) 3분 동안 98°C, (ii) 20초98°C, (iii) 20초의 경우 60°C, (iv) 15초의 경우 72°C, 반복 단계(ii) ~30회, (v) 5분 동안 72°C , (vi) 추가 분석이 될 때까지 12°C에서 유지한다.
  5. 100 내지 10,000 bp의 범위에서 DNA 로딩 염료 및 DNA 사다리를 사용하여 40 분 동안 5 V / cm에서 0.8 % 아가로즈 겔에서 전기 동거의 PCR 제품을 분석합니다.
  6. 제조업체의 지침에 따라 PCR 정제 키트를 사용하여 올바른 PCR 제품을 정화합니다.

5. S. 세레비시아로의 변신

참고: Gietz 외에서 개발한 방법을 기반으로 프로토콜을 사용하여 변환을 수행합니다. (1995년) 30 및 힐 외. S. 세레비시아의다양한 균주에 사용할 수있는 31 . 아래에 설명된 프로토콜은 1변환에 충분합니다.

  1. 변환에 필요한 솔루션을 준비합니다.
    1. 다음 의 재고 용액 및 필터 살균을 준비 : 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM EDTA, 50 mL의 총 부피를 포함하는 10x TE 버퍼; pH 7.5에서 1 M LiAc, 50 mL의 총 부피; 50 % PEG 4000, 100 mL의 총 볼륨.
      참고: PEG 4000 재고가 pH 5에 있는지 항상 확인하십시오. 이 주식은 1 개월 이상 보관해서는 안됩니다.
    2. 재고를 사용하여 다음 솔루션을 준비하십시오: 0.1 M LiAc, 10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA, 총 부피 0.5 mL를 포함하는 LiAc-TE 솔루션을 준비합니다. 40% PEG 4000, 0.1 M LiAc, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 총 부피를 포함하는 PEG-LiAc-TE 용액을 준비합니다.
      참고: PEG-LiAc-TE 및 LiAc-TE 솔루션이 새로 준비되는 성공적인 변환을 위해 매우 중요합니다.
  2. 첫 번째 변환 라운드 (Cas12a를 미리 발현 하는 변형을 준비).
    참고: 모든 변환 단계에서 pH가 5보다 높은 물을 사용하십시오. 변형의 모든 단계에서 탈염수를 사용하는 것이 좋습니다.
    1. 변형CEN을 성장시킴으로써 사전 배양을 준비한다. PK113-7D는 20 mL의 YEPD(2% 포도당) 배지를 함유하는 100 mL 쉐이크 플라스크에서 250 rpm에서 흔들어 30°C에서 밤새 배양한다.
    2. 사전 배양(OD pc)의 OD600을 측정하였다. 사전 배양부량과Cas12a를 미리 발현하는 세포의 제조에 필요한 신선한 배지의 부피 사이의 희석 계수(df)를 계산하여 형질전환(transformation culture)에 사용한다. 계산에서 변환 배양물(ODtc)의광학 밀도를 5.2.3(ti)에 기재된 인큐베이션 단계 후 1.0으로 가정한다.
      figure-protocol-1
      여기서 ti와 θ는 각각 인큐베이션 시간과 두 배의 시간입니다.
      1. 희석 계수에 기초하여 변환 배양(Vtc)의 접종에필요한 사전 배양(V i)의 부피를 계산한다.
        figure-protocol-2
    3. 이전 단계(V i)에서 결정된 사전 배양부량과 함께 20 mL의 YEPD(2% 포도당)(Vtc)의접종에 의해 형질전환 배양을 준비한다. 250 rpm에서 흔들어 30 °C에서 배양.
    4. 1.0의 OD600에 도달할 때까지 변환 배양의 OD600을 측정합니다.
    5. 20 mL 국물을 2,500 x g에서 5 분 동안 원심 분리하여 세포를 수확하십시오. 원심 분리 단계를 반복하고 세포 펠릿을 유지합니다.
    6. LiAc-TE 용액의 100 μL에서 세포를 다시 중단하고 미세 원심 분리튜브로 옮김을 옮김.
    7. 단일 가닥 캐리어 DNA (10 mg / mL 연어 정자 DNA)의 5 μL을 추가하고 파이펫팅으로 혼합하십시오.
    8. 플라스미드 pCSN067의 피펫 1 μg를 미세원심지 튜브에.
      참고: DNA 혼합물의 총 부피는 낮은 형질전환 효율을 방지하기 위해 100 μL을 초과해서는 안 됩니다.
    9. PEG-LiAc-TE 용액 600 μL을 추가하고 파이펫팅으로 혼합합니다. 테이블 상판 열 블록에서 450 rpm에서 흔들면서 30 °C에서 30 분 동안 배양합니다.
    10. 70 μL의 DMSO(100%) 추가 파이펫팅하여 변형 혼합물을 혼합합니다. 수조에서 42°C에서 15분 동안 변형 혼합물을 배양하여 열 충격을 수행합니다.
    11. 혼합물을 15 mL 둥근 바닥 튜브로 옮기고 10 mL의 YEPD (2% 포도당)를 튜브에 첨가하여 세포를 회수합니다. 250 rpm에서 흔들어 30 °C에서 밤새 배양.
    12. 2,500 x g에서 5분 동안 변형 혼합을 원심분리. 상급체를 버리고 나머지 용액의 약 200 μL에서 세포 펠릿을 재중단시켰다.
    13. 0.2 g/L G418로 보충된 한천 플레이트에 150 μL의 변혁 믹스와 YEPD(2% 포도당)의 변질 믹스의 20배 희석을 플레이트. 48 - 72 시간 동안 30 °C에서 플레이트를 배양하십시오.
    14. 단일 콜로니를 얻기 위해 0.2 g/L G418로 보충된 YEPD(2% 포도당) 한천 플레이트에 단일 변형 및 재줄무늬를 선택합니다.
  3. 두 번째 변환 라운드 (CRISPR /Cas12a로 멀티 플렉스 게놈 편집을 수행).
    1. 제1 변형 라운드(단계 5.2)에서 생성된 균주를 미리 발현하는 Cas12a를 성장시킴으로써, 0.2 g/L G418로 보충된 20 mL의 YEPD(2% 포도당) 배지를 함유하는 100 mL 쉐이크 플라스크에 미리 배양한다. 30°C에서 밤새 250 rpm을 흔들어 인큐베이션한다.
      참고: 여러 변환의 경우 사전 배권의 볼륨을 조정합니다.
    2. 첫 번째 변환 라운드의 경우 5.2.2에서 5.2.7 단계따르십시오.
      참고: 여러 변환의 경우 사전 발현되는 Cas12a의 필요한 솔루션 과 배양량을 조정합니다.
    3. 단일 crRNA 어레이의 피펫 1 μg, crRNA 어레이에 대한 선형화된 수용자 플라스미드의 1 μg, 공여자 DNA의 1 μg 및 각 측면 영역의 1 μg(단계 4.3)에서 미세원심분리관.
      참고: DNA 혼합물의 총 부피는 낮은 형질전환 효율을 방지하기 위해 100 μL을 초과해서는 안 됩니다.
    4. 변환에 대한 다음 컨트롤을 준비 :음성 제어 (초순수 H2 O); 변환 효율의 측정을위한 긍정적 인 제어 (원형 pRN1120의 1 μg); CRISPR 편집을 통해 기증자 DNA의 도입이 수행되는지 확인하는 대조군(원형 pRN1120의 1 μg, 모든 공여자 DNA 발현 카세트의 1 μg 및 측면 영역의 1 μg 이지만 단일 crRNA 배열없음); 기증자 DNA가 표적 외부에 통합될 수 있는지 를 확인하는 제어(선형화된 pRN1120의 1 μg, 기증자 DNA 발현 카세트 의 1 μg 및 단일 crRNA 배열의 1 μg 그러나 측면 영역 없음); pRN1120(선형화된 pRN1120의 1 μg)의 전체 선형화를 확인하는 제어.
    5. 첫 번째 변환 라운드의 경우 5.2.9에서 5.2.12 단계따르십시오.
    6. 0.2 g/L G418 및 0.2 g/L NTC로 보충된 한천에 YEPD(2% 포도당)의 형질전환 혼합물 및 20x 희석의 150 μL을 플레이트. 적절한 선택 (G418 및 / 또는 NTC 또는 선택 없음)으로 보충 된 YEPD (2 % 포도당) 한천에 대한 플레이트 아웃 컨트롤. 48 - 72 시간 동안 30 °C에서 플레이트를 배양하십시오.
    7. YEPD (2% 포도당) 한천 접시에 단일 컬러 형질전환제를 선택하고 다시 줄무늬를 선택하여 단일 컬러 콜로니를 얻습니다.

6. 게놈 편집 효율 평가

  1. 변환 플레이트에서 유색 콜로니와 흰색 식민지 수를 계산합니다.
  2. 표1과 같이 유색 식민지 수를 총 콜로니 수(흰색과 색 모두)로 나누어 게놈 편집 효율성을 계산합니다.

7. 의도된 로시에서 기증자 DNA의 통합 확인

  1. G418 및 NTC 선택없이 YEPD(2% 포도당) 한천 플레이트상에서 변혁 플레이트로부터 착색된 단일 콜로니를 재줄무하고 30°C에서 48시간 동안 배양한다.
  2. 단일 콜로니를 선택하고 YEPD (2% 포도당) 배지 100 mL로 채워진 500 mL 쉐이크 플라스크를 접종합니다. 30°C에서 48시간 동안 배양하고 250 rpm에서 흔들어.
  3. 섹션 4.1에 기재된 바와 같이 게놈 DNA를 분리한다.
    참고 : 또는, 이전에 Looke 등에서제안 한 식민지 PCR에 대한 효모의 제조를위한 프로토콜을 사용합니다. 32. 이 경우 액체 매체 (섹션 7.2)의 성장을 건너 뛸 수 있습니다.
  4. 통합 식 카세트당 두 개의 조각을 증폭하여 올바른 통합을 확인합니다.
    1. 설계 프라이머는 변형된 측면 영역 및 관심 유전자 외부에 게놈 DNA를 어닐링하는 것을 디자인한다(보충표 2,KC-121 에서 KC-132 참조). 프라이머 KC-121을 KC-132로 사용하는 경우, PCR 프로그램의 어닐링 온도를 62°C로 설정합니다.
    2. 섹션 4.4.2에 설명된 대로 관심 영역을 증폭합니다. PCR 프로그램을 적응시키고, 특히 DNA 폴리머라제에 대한 템플릿 및 제조업체의 권장 사항에 따라 PCR에서연장 단계의 시간을 조정한다.
  5. 100 내지 10,000 bp의 범위에서 DNA 로딩 염료 및 DNA 사다리를 사용하여 아가로즈 겔 (0.8 %, 40 분, 5 V / cm)에 전기 동거의 PCR 제품의 크기를 확인하십시오.

8. 음향 액체 핸들러를 이용한 효모 픽셀 아트 제작

  1. 효모 픽셀 아트에 대한 그림 템플릿을 준비합니다.
    1. 원래 RGB 사진의 크기 조정(220 × 280 픽셀, 대표 결과 참조) 예를 들어 ImageJ를 사용하여 최종 64 × 96 픽셀 (너비 × 높이) 회색 스케일 이미지를 의도 한 색상으로 시각화 (대표 결과).
    2. 이 수식을 사용하여 RGB 그림을 회색 배율로 변환합니다.
      figure-protocol-3
      내가gr, Ir, Ig, 나는b가 각각 회색, 빨간색, 녹색 및 파란색 강도입니다.
    3. 픽셀을 분류하려면 다음 규칙을 적용하는 ImageJ 플러그인을 개발합니다. (b) 64 < 나는gr ≤ 128인 경우, 이 픽셀에 대해 오렌지 효모(변형률 2, 보충 표3)를 사용한다. (c) 128 < Igr ≤ 192인 경우, 이 픽셀에 대해 노란색 효모(변형률 3, 보충 표3)를 사용한다. (d) gr > 192의 경우, 백색 효모 (CEN)를 사용하십시오. 이 픽셀에 대한 PK113-7D)를 참조하십시오.
  2. 효모 세포를 발견하여 효모 픽셀 아트를 만듭니다.
    1. 3개의 상이한 착색된 카로티노이드를 생산하는 3개의 상이한 색의 카로티노이드및 야생형 CEN을 함유한 100 mL의 YEPD(2% 포도당) 배지를 함유하는 500 mL 쉐이크 플라스크를 접종하였다. PK113-7D. 30°C에서 밤새 배양배양하고 250 rpm에서 흔들어.
    2. 1박 배양의 0.5 mL을 멸균 비이온 밀도 그라데이션 배지0.5 mL로 채워진 튜브로 이송한다(재료 표참조). 잠시 소용돌이로 섞으세요.
    3. 셀 현탁액을 정규화된 저장소, 2 x 3 웰로 옮니다. 자격을 갖춘 저수지 소스 플레이트에서 마이크로 플레이트(재료 표참조)에 한천 50mL(2% 포도당)를 함유한 음향 액체 핸들러 장비를 사용하여 스포팅을 수행합니다. 도금을 단순화하려면 플레이트에 우물을 정의합니다( 예:. 마이크로 플레이트를 6144 웰 플레이트(64 × 96)로 사용하십시오.
    4. 2x 3 웰 저수지 소스 플레이트로부터 의 각 S. 세레비시아 균주의 자리 25 nL은 유체 보정 설정6RES_AQ_GPSA2를 목적지 마이크로플레이트 상에 .csv 파일을 사용하여. 이러한 25nL 액적 각각을 웰 위치(A01, B01, C01 등)로 변환되는 64 x 96 그리드의 픽셀로 정의합니다.
    5. 마이크로플레이트를 30°C에서 48시간 동안 배양한다. 균주의 색상을 강화하기 위해 한천 판을 적어도 72시간 동안 4°C에서 저장한다.

결과

CRISRP/Cas12a를 이용한 멀티플렉스 게놈 편집프로토콜은 이종프로모터를 사용하여 crtE, crtYB 및 crtI 유전자를 발현하는 세레비시아균을 생산하는 3개의 카로티노이드를 생성함으로써 입증되었다. 높음, 중간 강도 및 낮은 강도: 변형 1, 2 및 3 각각 (보충표3). 이러한 균주의 구성은 게놈 DNA에서 3개의 상이한 궤체를 표적으로 하기 위한 균주당 3개의 공여자 DNA 발현 카세트 및 6개의 측면 영역의 생성을 요구했다(그림 2B에도시됨). 본 명세서에 기재된 바와 같이, 프로모터, 개방 판독 프레임, 터미네이터 및 2개의 연속50-bp 커넥터 서열은 골든 게이트 클로닝 반응을 통해 발현 카세트로 조립되었고 조립체는 PCR에 의해 확인되었다(도3A). 단일 crRNA 어레이는 합성 DNA 단편으로서 주문되었고 PCR에 의해 증폭되었다(도3B). 단일 crRNA 어레이(plasmid pRN1120)에 대한 수용자 플라스미드를 에코RI-HF 및 XhoI로 선형화하고 선형화하여 전기영동에 의해 확인하였다(도3C). 도입된 공여자 DNA 발현 카세트 및 측면 영역의 설계 및 뉴클레오티드 서열은 보충표 3 및 보충표4에 도시되어 있다. 단일 crRNA 배열 발현 카세트의 서열은 보충 표1에 제공된다. 단일 crRNA 어레이에 포함된 스페이서의 기능은 개별 crRNA19를통한 단일 플렉스 게놈 편집에 의해 사전에 테스트되었다.

Cas12a를 이용한 게놈 편집의 효율은 먼저 변형 후 얻어진 유색 콜로니의 수에 기초하여 평가되었다(표1, 도4). 3개의 구성된 균주의 편집 효율은 50%에서 94%까지 다양했습니다. 특히, 균주 1을 생성하는 데 사용되는 발현 카세트의 도입은 가장 낮은 편집효율을 표시, 아마도 기증자 DNA의 특성에 의해 발생 (즉, 이러한 발현 카세트 는 crtE, crtYB 및 crtI를 인코딩 3개의 고강도 프로모터)에서) 둘째, 게놈 DNA상에서 의도된 자위부에서 3개의 공여자 DNA 발현 카세트를정확하게 통합하여 PCR에 의해 확인되었다(도 5). 프라이머는 의도된 궤적에서 공여자 DNA의 정확한 통합이 발생했을 때 PCR 제품을 수득하는 방식으로 설계되었다. 각 변환 실험에 대해, 8개의 콜로니를 변형 플레이트로부터 선택하여 시험하였다(그림 5에는 3개만 제시된다). 일반적으로, 기증자 DNA당 시험된 8개의 콜로니 중, INT1 궤적에서 crtE 기증자 DNA의 정확한 통합, INT2 궤적에서의 crtYB 및 INT3 궤적의 crtI는 형질전환제의 >90%에서 확인되었다. 이러한 결과는 단일 crRNA 어레이와 결합된 CRISPR/Cas12a 시스템을 입증하여 여러 로시에서 S. 세레비시아 게놈의 효율적인 멀티플렉스 편집을 동시에 가능하게 합니다.

또한, 우리는 비 착색 야생 형 균주와 함께 건설 된 세 개의 카로 티노이드 생산 균주를 사용하여 "효모 픽셀 아트"의 생성을 보여줍니다. 로잘린드 프랭클린 (그림6A)의 흑백 그림에서 시작하여 4 색 그림 (그림6B)과 스포팅 리스트가 작성되어 한천 마이크로 플레이트에서 4 개의 다른 효모 균주를 발견하는 데 사용되었습니다. 로잘린드 프랭클린 (그림6C, D,E)의 고해상도 "효모 페인팅"의 결과로 음향 액체 처리기.

figure-results-1
그림 1 : CRISPR/Cas12a 멀티플렉스 게놈 편집을 위한 프로토콜 워크플로우 워크플로에는 제시된 메서드의 중요한 단계가 포함됩니다. 자세한 내용은 프로토콜을 참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2 : 단일 crRNA 어레이를 이용한 CRISPR/Cas12a 멀티플렉스 게놈 편집 방식. (A) 단일 crRNA 어레이는 성숙한 형태의 3개의 crRNA 단위로 구성되며, 23-bp 가이드 시퀀스(컬러 다이아몬드)를 가진 LbCas12a(회색 사각형)에 대해 20-bp 직접 반복된다. crRNA 어레이의 발현은 SNR52 프로모터 및 SUP4 터미네이터에 의해 활성화된다. s. 세레비시아의 선형화된 pRN1120 및 pRN1120(대각선 줄무늬)을 함유하는 단일 crRNA 배열 발현 카세트를 사용하여 세포에서 원형 플라스미드로 재조합을 미리 발현할 수 있다. LbCas12a. 단일 crRNA 어레이는 이후 Cas12a에 의해 처리된다. (B) Cas12a는 의도된 INT1, INT2 및 INT3 게놈 표적 부위로 향하고 이중 연선 브레이크를 생성한다. 형질전환 혼합물에서, 측면 영역 및 카로티노이드 유전자 발현 카세트로 구성된 공여자 DNA가 포함되었다. 공여자 DNA 어셈블리는 50-bp 상동성 커넥터 서열의 존재로 인하여 생체 내 재조합에 의한 INT1(crtE), INT2(crtYB) 및 INT3(crtI) 주위의 게놈 DNA에서 1개의 스트레칭을 표적으로 하였다. 5, A, B, C, D 또는 E. P1-P3, 상이한 프로모터로 표시; T1-T3, 다른 종기. 이 수치는 Verwaal 외. 201819에서수정되었습니다. 합성 생물학 개방 언어 (SBOL) 시각적 기호를 사용하여 표시된 유전 구조40. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3 : 게놈 편집 실험을 검증하는 PCR. (A) 조립된 기증자 DNA 카세트의 골든 게이트 복제 반응 검증. 얻은 결과는 예상 길이와 일치합니다. (B) 단일 crRNA 어레이의 PCR. (C) 플라스미드 pRN1120의 선형화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-4
그림 4 : 멀티플렉스 게놈 편집 방식을 이용한 S. 세레비시아 형형판. (A) 3개의 강한 프로모터(다크 오렌지 콜로니)로부터 crtE, crtYB 및 crtI를 발현하는 균주 1. (B) 3개의 중간 강도 프로모터(주황색 콜로니)로부터 crtE, crtYB 및 crtI를 발현하는 균주 2. (C) 3개의 저강도 프로모터(노란 콜로니)로부터 crtE, crtYB 및 crtI를 발현하는 균주 3. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-5
그림 5 : PCR은 게놈 DNA 내의 의도된 궤체에서 공여자 DNA 발현 카세트의 통합을 확인한다. (A) 균주 1의 3 개의 콜로니의 확인. (B) 균주 2의 3 개의 콜로니의 확인. (C) 균주 3의 3 개의 콜로니의 확인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-6
그림 6 : 로잘린드 프랭클린의 효모 픽셀 아트. (A) 템플릿으로 사용 된 로잘린드 프랭클린의 220 × 280 픽셀의 흑백 RGB 사진. (B) 로잘린드 프랭클린의 흑백 사진을 4색 64 × 96 픽셀 목록으로 컴퓨터 변환. (C) 64 × 96 효모 콜로니가있는 효모 픽셀 아트의 사진 확대 섹션. (D) 두 개의 전체 재배 플레이트가있는 음향 액체 핸들러의 사진. (E) 64 × 96 효모 콜로니가있는 전체 재배 마이크로 플레이트 의 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

변형 변형 1변형 변형 2스트레인 3
유색 식민지16세279220개
백색 식민지16세18세18세
총 식민지32세297238
효율성50%94%92%

표 1: 멀티플렉스 게놈 편집 접근법의 편집 효율.

crRNA 배열 시퀀스a, b, c, d, e, f
CATGTTTGACAGCATATATATATATATCCGGTTAGCATGCGCTTTAGAACTAGTGGGCCCCGGCGCGCGCAGAACTAGTGGATCCCCGGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGC TCTTTGAAAA
가타트가타트GCTTTATAT타타카가가가가가가가가가가가가트는TTTCT가그타타타카그
TGATTACATGTACTTGAAGTACAACTAACTACTAGATTTTTGCGCTTTGCTGCTGCTGCTGCTGCTTGCTTGCTTGCTTGCTTGCTAAAAGAAAGA
TTTTCACACCACCATTTTTTTTTCAAAGATTTTCAAACTTTTTTGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGAAAGGAAAGTTGGCGCGCGCGC
ATGTTTCGGCTCGAAACTTCTCCGCAGAAAATAtCAtATCTACTAGTGTAGATAT
CTGGGGGGAGAAGCTATATGAATTTCTACTAGTGTAGATGTGCCGTAC
GCCGGAGGACGG아타타타가트TGCCTCTTATACtGATTATTTT
TtTTTTTTTTTTTTTTGGGGGGGGGGGGCCCCGCACCTTTTTTTTAGTGAGG
GTTAATTCCGTGTTTTTTTTTTGTG
a. pRN1120 (굵게)에 대한 상동성.
b. SNR52 프로모터 (기울임꼴).
c. 게놈 표적 서열(밑줄이 그어진).
d. LbCas12a(기울임꼴, 굵게)에 특정한 직접 반복을 안내합니다.
e. SUP4 터미네이터(기울임꼴).
f. pRN1120 (굵게)에 대한 상동성.

보충 표 1: 플라스미드 pRN1120을 함유하는 상동성을 함유하는 LbCas12a에 대한 단일 crRNA 어레이.

이름시퀀스a설명b점에서 사용
KC-101카트가카카타캣단일 crRNA 어레이의 증폭을 위한 FW 프라이머2.1.4
KC-102카카가아카카GCTATGAC단일 crRNA 어레이의 증폭을 위한 RV 프라이머2.1.4
KC-103아그CGACTTCCAATCTTTGC커넥터를 통해 기증자 DNA증폭을 위한 FW 프라이머 53.6.1
KC-104아아카아가아가가가가가가가가가가가가커넥터 A를 통해 기증자 DNA 증폭을 위한 RV 프라이머3.6.1
KC-105크가트가트타카아카카아크커넥터 B를 통해 기증자 DNA 증폭을 위한 FW 프라이머3.6.1
KC-106카카그그크가트가타타타크커넥터 C를 통해 기증자 DNA 증폭을 위한 RV 프라이머3.6.1
KC-107AACGTTGTCCTTGTATCC커넥터 D를 통해 기증자 DNA 증폭을 위한 FW 프라이머3.6.1
KC-108아그타카아카그카그가카그커넥터 E를 통해 기증자 DNA 증폭을 위한 RV 프라이머3.6.1
KC-109선인장커넥터 5를 갖춘 INT1 5' 증폭을 위한 FW 프라이머4.4
KC-110 아악GCGCGTGTGTGGGGTAC
TGGATATGCAAGC가트가가아
GTCGCTT[GCCGTC]
ATTCC		커넥터 5를 갖춘 INT1 5' 증폭을 위한 RV 프라이머4.4
KC-111 TTGCCCATCGAACGTACAAG
택트CTTCTCTCTCCCCCCTT
TGCTTTAAGCGTTTTGAAGTTTCCTC
TTTG		커넥터 A를 갖춘 INT1 3' 증폭을 위한 FW 프라이머4.4
KC-112TGTCAACTG가가GCTATCG커넥터 A를 갖춘 INT1 3' 증폭을 위한 RV 프라이머4.4
KC-113아가가트CTCTCTCTC커넥터 B를 갖춘 INT2 5'의 증폭을 위한 FW 프라이머4.4
KC-114 TGCTA가트GTTCGTT
TGGGTGCAGTGTGTGTTTTTTACAT
CGATCCGCCCTTATCAAGGATACC
TGGTTG		커넥터 B를 갖춘 INT2 5' 증폭을 위한 RV 프라이머4.4
KC-115 아카트CCGGCTCTTCCA
가카카그타트CCCCCT
CCTGTGGGCGATTACACAAGCG
GTGG		커넥터 C를 갖춘 INT2 3' 증폭을 위한 FW 프라이머4.4
KC-116TCTCTTTCGATGGGG커넥터 C를 갖춘 INT2 3' 증폭을 위한 RV 프라이머4.4
KC-117GGTCGTTTTTTGTGCGCATAtTG커넥터 D를 갖춘 INT3 5' 증폭을 위한 FW 프라이머4.4
KC-118 GCGGATATTGGCGGAACGG
아카카그GT가타아카아아크
가카에그트TTCCAAGGAggTG
아가아CG		커넥터 D를 갖춘 INT3 5' 증폭을 위한 RV 프라이머4.4
KC-119 아타카아카아카아카트CC
CCCATATGCTCGTGCTTT
GTACCT가트그가브크카카그액트
GTAC (주)(주)		커넥터 E를 갖춘 INT3 3' 증폭을 위한 FW 프라이머4.4
KC-120가그CTACTATATATTCatC커넥터 E를 갖춘 INT3 3' 증폭을 위한 RV 프라이머4.4
KC-121GTTACTAACTGAACTGCCGCON5-crtE-conA에서 INT1 5'로 의 통합 검증을 위한 FW 프라이머7.4.1
KC-122선인장타액타그트택트CON5-crtE-conA에서 INT1 3'에 통합검증을 위한 FW 프라이머7.4.1
KC-123선인장CONB-crtYB-conC와 INT2 5'의 통합 검증을 위한 FW 프라이머7.4.1
KC-124GTCTAGCTGAATTCCCONB-crtYB-conC와 INT2 3'의 통합 검증을 위한 FW 프라이머7.4.1
KC-125CTCTCATGAAGCAGTCAAGTCCOND-crtI-conE와 INT3 5'의 통합을 검증하기 위한 FW 프라이머7.4.1
KC-126가트CG트카트타그그가그COND-crtI-conE와 INT3 3'의 통합검증을 위한 FW 프라이머7.4.1
KC-127CCTTGTCCAAGTAGGTCCCON5-crtE-conA에서 INT1 5'로 의 통합 검증을 위한 RV 프라이머7.4.1
KC-128GCTGTCAT가CTGT가타악CON5-crtE-conA에서 INT1 3'에 통합검증을 위한 RV 프라이머7.4.1
KC-129CTGGCAATGTT가가카아츠GCCONB-crtYB-conC와 INT2 5'의 통합 검증을 위한 RV 프라이머7.4.1
KC-130CCAACGTGCCTTAAGTCTGCONB-crtYB-conC와 INT2 3'의 통합 검증을 위한 RV 프라이머7.4.1
KC-131CCTTACCTTTGGAGCAGCAGINT3 5'에 conD-crtI-conE의 통합검증을 위한 RV 프라이머7.4.1
KC-132CTGGACTTCCCTAAGACTGINT3 3'에 conD-crtI-conE의 통합 검증을 위한 RV 프라이머7.4.1
a. 굵은 시퀀스는 커넥터 시퀀스를 나타냅니다.
b. 정방향 및 후진 프라이머는 각각 FW 및 RV로 지정됩니다.

보충 표 2: 프라이머 서열.

figure-results-7
보충 표 3: 건설된 균주의 설계.

figure-results-8
보충 표 4: 기증자 DNA 발현 카세트 및 박리 영역의 서열. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

제공된 프로토콜은 단일 crRNA 어레이 및 공여자 DNA와 조합하여 Lachnospiraceae 박테리아 ND2006으로부터의 Cas12a를 사용하여 S. 세레비시아의 멀티플렉스 게놈 편집을 기술한다. 단일 crRNA 어레이 및 공여자 DNA의 설계는 자세히 설명된다. 잘 확립된 CRISPR/Cas9 시스템과는 달리, CRISPR/Cas12a는 단일 crRNA 어레이13,33에서발현되는 다중 crRNA를 처리하는 독특한 추가 능력을 가지고 있다. 이 기능으로 인해 여러 대상을 동시에 편집하는 것이 더 쉬우며 단일 변환으로 수행할 수 있습니다. 이 단일 crRNA 배열 접근법은 Zetsche 외.에의해 이전에 입증되었습니다. 34명의 동시 는 AsCas12a를 사용하여 포유류 세포에 있는 4개의 유전자까지 편집하고, Swiat 외에의해. FnCas12a를 사용하여 효모 게놈에 4개의 DNA 단편을 도입한 35명. 우리의 지식에, Cas12a 시스템을 사용하여 동시 게놈 수정의 더 높은 수는 보고되지 않았으며 Cas12a를 위한 단일 배열당 표적의 최대 한계는 아직 결정되지 않았습니다. Cas12a와 조합하여 단일 crRNA 어레이를 활용하는 추가 연구는 광범위한 유기체33,36,37에서다중 전사 조절을 포함한다.

제시된 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 특히 새로운 DNA 서열이 도입되는 경우 Cas12a 게놈 편집 실험에 관여하는 모든 DNA 서열을 신중하게 설계합니다. Verwaal et al.에의해 기술된 바와 같이 단일 플렉스 게놈 편집 실험에 의해 예를 들어 crRNA의 새로운 스페이서 서열 부분의 기능을 결정한다. 19를 단일 crRNA 어레이로 결합하기 전에. 효모의 좋은 변환 효율을 달성하기 위해 Cas12a 편집 실험에 사용되는 변환 버퍼 솔루션의 준비에 대한 권장 사항을 따르십시오.

이 기술의 몇 가지 선택적 수정 사항이 있습니다. 각 공여자 DNA의 1 μg, 선형화된 pRN1120 또는 단일 crRNA 배열 발현 카세트를 변형에 사용하는 것이 권장되지만, 더 낮은 DNA 양을 사용하는 것은 또한 만족스러운 형질전환 효율을 초래할 것으로 예상된다. 더 낮은 DNA 양이 사용될 수 있는지 여부를 결정하기 위하여 시험 변환을 능력을 발휘합니다. S. 세레비시아의 변형은 이 프로토콜에 기재된 것과는 다른 방법을 사용하여 수행될 수 있으며, 예를 들어 Gietz et al. (2007년) 38.가이드 RNA 수용자 플라스미드 pRN1120은 상이한 Cas12a 변이체(예를 들어, 산아미노코커스 종으로부터의 단일 crRNA 및 단일 crRNA 어레이의 발현에 적합하다. BV3L6 또는 프란체셀라 노비시다 U112) 뿐만 아니라 Cas919와조합하여 sgRNA의 발현. 공여자 DNA는 유전체 DNA에서 기재된 INT1, INT2 및 INT3 부위에 공여자 DNA를 표적으로 하는 카로티노이드 유전자 발현 카세트 및 측면 영역으로 제한될 필요가 없다. 관심 있는 임의의 DNA는, 멀티플렉스 방식으로, 본 프로토콜에 기재된 설계 원리에 의해 숙주들의 게놈 DNA내로, 또는 대안적으로 공여자 DNA가 숙주 게놈으로부터 DNA를 삭제하는데 사용될 수 있다. 단일 crRNA 어레이의 모듈식 구조는 스페이서 및 직접 반복 서열의 쉬운 조정을 용이하게 합니다. 스페이서 서열의 변형은 게놈 표적 부위의 식별을 위한 도구 중 하나인 GuideScan 소프트웨어 1.039에의해 설계될 수 있는 의도된 통합 궤적의 변화를 허용한다. 커넥터 서열을 포함하는 큰 측면 서열을 사용하는 대신, 50-bp 의 측면 영역은 PCR에 사용되는 프라이머에 이들 50-bp 플랭킹 영역 서열을 통합함으로써 공여자 DNA 서열에 포함될 수 있다. 이 경우, 성공적인 멀티플렉스 게놈 편집 실험을 위해 9개의 공여자 DNA 단편 대신에 총 3개만 이요구된다.

요약하면, 이 프로토콜은 단일 crRNA 어레이 접근법과 조합하여 Cas12a를 사용하여 S. 세레비시아에서 멀티플렉스 게놈 편집을 수행하는 단계별 지침을 제공한다. 이 프로토콜은 3개의 gRNA를 위한 9개의 공여자 DNA 단편 및 단 하나 crRNA 배열 코딩을 사용하여 다중 게놈 편집에 의해 입증되었습니다. 여기에 보고된 세 가지 변형 설계에 대해 전체 편집 주파수가 50%에서 94% 사이로 표시됩니다. 결론적으로, Cas12a의 독특한 특징은 단일 crRNA 어레이를 세포의 개별 crRNA로 처리하는 기능으로, Cas12a는 멀티플렉스 게놈 편집을 가능하게 하고 다중을 대상으로 하는 전사 조절 모듈을 개발하는 훌륭한 도구입니다. 한 번의 방식으로 카세트를 표현할 수 있습니다. 결국, 세 가지 균주는 노란색과 주황색 사이의 음영에서 다른 수준과 색상에서 카로티노이드를 생산을 얻었다. 그 균주와 야생 형 변형으로, 우리는 음향 액체 핸들러가 효모 픽셀 아트를 만들기 위해 간단하게 사용할 수있는 방법을 보여 주었다 - 그녀의 유명한 사진에 의해 DNA 구조의 발견에 기여 로잘린드 프랭클린의 명예에 65 년 전 그녀의 유명한 사진 5123< /c1>.

공개 사항

저자는 이해 상충이 있음을 선언합니다. 저자는 제시 된 방법과 관련된 IP를 제출했습니다.

감사의 글

이 프로젝트는 보조금 협정에 따라 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램(DD-DeCaf) 및 764591(SynCrop)에서 자금을 지원받았으며, 프로젝트 번호 737.016.005를 가진 연구 프로그램 빌딩 블록오브라이프에서 지원받았습니다. 과학 연구를위한 네덜란드 기구 (NWO). T.E.G.는 왕립 학회 (UF160357 부여)와 브리신 바이오, BBSRC / EPSRC 합성 생물학 연구 센터 (부여 BB / L01386X / 1)에 의해 지원되었다. 우리는 효모 픽셀 아트를 만들기위한 효모 발견 실험에 기여한 Zi Di와 Jeffrey van Wijk에게 감사드립니다.

재료

Plasmids
이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Chemicals specific for the protocol
1 Kb Plus DNA LadderThermo Fisher Scientific10787018전기영동
암피실린 나트륨Sigma AldrichA9518E. coli 형질전환체
선택 BsaI-HF (20 U/µ l)New England BioLabsR353LGolden Gate Cloning
Cell Lysis Solution(키트: Puregene Yeast/Bact. Kit B)QIAGEN854016S. cerevisiae에서 게놈 DNA 분리
CutSmart Buffer,New England BioLabsB7204SpRN1120
Deoxyribonucleic acid sodium salt salt SigmaAldrichD1626
S. cerevisiae(운반체 DNA)
dNTPsInvitrogen10297018PCRs
EcoRI-HFNew England BioLabsR3101SpRN1120
에탄올 절대적인Merck100983S. cerevisiae
에틸렌디아민-테트라아세트산Sigma AldrichED형질전환< br/> S. cerevisiae
G418 이황산염Sigma AldrichA1720S. cerevisiae 형질전환체 선택
HistodenzSigma AldrichD2158 이스트 픽셀 아트
이소프로판올머크(Merck100993S. cerevisiae
리튬 아세테이트 이수화물시그마 알드리치(Sigma AldrichL688><3 S. cerevisiae
Nancy-520 DNA Gel StainSigma Aldrich1494전기영동
NEB10 유능한 대장균 세포New England BioLabs C3019H대장균의 형질전환: dx.doi.org/10.17504/protocols.io.nkvdcw6
NourseothricinJena BioscienceAB102S. cerevisiae 형질전환체의 선택
Phusion bufferNew England BioLabsM0530LPCR
Phusion High-Fidelity DNA PolymeraseNew England BioLabsM0530LPCR
폴리에틸렌 글리콜 4000Merck7490Transformation of
S. cerevisiae
Protein Precipitation Solution (10 M NH4AC) (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B)QIAGEN854016Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
Purple loading dyeNew England BioLabsB7024SElectrophoresis
QIAprep Spin Miniprep KitQIAGEN27106Purification of plasmids
RNase coctail enzyme mixThermo Fisher ScientificAM2286S. cerevisiae
T4 DNA 리가제 완충액Invitrogen46300-018Golden Gate Cloning
T4 DNA Ligase (1 U/µ l)Invitrogen1705218Golden Gate Cloning
UltraPure AgaroseInvitrogen16500500Electrophoresis
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System KitPromegaA9282PCR 산물 및 선형화된 pRN1120
XholNew England BioLabsR0146SpRN1120
Zymolyase의 선형화 50 mg/ml (5 units/µ L)Zymo ResearchE1006S. cerevisiae(효모 용해 효소)에서 게놈 DNA 분리
Zymolyase 저장 버퍼Zymo ResearchE1004-BS. cerevisiae에서 게놈 DNA 분리(효모 용해 효소 준비에 필요)
Chemicals of general use
2*Peptone-Yeast extract (PY) 한천플레이트 대장균의 성장
2*PY 배지대장균
탈염수
S. cerevisiae
ELFO 완충액전기영동
MQ다중 단계
생리적 염 용액
S. cerevisiae TE의 변환
완충액DNA 저장, S. cerevisiae 형질전환
효모 추출물-펩톤-덱스트로오스(YEPD; 2% 포도당) 배지S. cerevisiae
YEPD(2% 포도당) 한천배양 플레이트
S. cerevisiae
Consumables
Eppendorf tubes
팔콘 튜브 (50 mL)
마이크로 플레이트 96 웰
페트리 접시
피펫 팁 0.5 - 10 µ L
피펫 팁 10 - 200 &마이크로; L
파이펫 팁 100 - 1000 &마이크로; L
쉐이크 플라스크 (500 mL)
멸균 필터
<강력한>장비
원심분리기 (팔콘 튜브)
Echo 525 acoustic liquid handler
Incubator
https://www.addgene.org/
pRN1120AddgeneID 101750https://www.addgene.org/
Strains
S. cerevisiae strain
CEN. PK113-7D		EUROSCARF 컬렉션http://www.euroscarf.de
염 : : 연어 고환에서 분석을 위한 선형화 에서 게놈 DNA 분리 ) 에서 게놈 DNA의 분리 배양 의 변형 의 플레이트 성장 전기영동 분광광도계용 NanoDrop 세트: Table centrifuge (Eppendorfs tubes)ThermocyclerpCSN067 Addgene ID 101748

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