우리는 실리콘 고무 (PDMS)로 제작 된 높은 처리량 견인력 분석방법을 제시한다. 이 새로운 분석은 다양한 생물학적 및 생물 의학 적 과정 및 질병 동안 세포 수축성의 물리적 변화를 연구하는 데 적합합니다. 우리는 상피-중간엽 전이 동안 수축성의 TGF-β 의존적 증가를 측정함으로써 이 방법의 유용성을 입증한다.
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방법 논문
PDMS를 이용한 높은 처리량 견인력 현미경 검사법은 상피-중간엽 전이에 대한 성장 인자-β 변환의 용량 의존적 효과를 밝혀냅니다.
이 논문에서
요약
초록
세포 수축은 생물학의 다양한 측면에서 필수적이며, 운동성과 분열에서 부터 조직 수축 및 기계적 안정성에 이르기까지 다양한 과정을 유도하며 다세포 동물 생명의 핵심 요소를 나타냅니다. 부착 된 세포에서 acto-myosin 수축은 세포가 기판에 발휘하는 견인력에서 보입니다. 세포 수축의 dysregulation는 무수한 병리학에서 나타나며, 수축은 생물 물리학을 지표로 사용하는 다양한 진단 접근법에서 유망한 표적으로 만듭니다. 더욱이, 새로운 치료 전략은 세포 수축의 명백한 오작동을 교정에 기초할 수 있다. 그러나 이러한 응용 프로그램에는 이러한 힘의 직접 정량화가 필요합니다.
당사는 실리콘 엘라스토머 기반 견인력 현미경(TFM)을 병렬화된 다중 웰 형식으로 개발했습니다. 실리콘 고무, 특히 폴리디메틸실록산(PDMS)을 사용하여 일반적으로 사용되는 하이드로겔 폴리아크릴아미드(PAA)보다 특수 한 보관 조건이 필요하지 않은 무기한 유통 기한으로 견고하고 불활성 기판을 만들 수 있습니다. GPa 범위에 계수가 있는 기둥-PDMS 기반 접근법과 달리 여기에서 사용되는 PDMS는 약 0.4 kPa에서 100kPa에 이르는 매우 규정을 준수합니다. 우리는 이러한 대형 모놀리식 기판을 생화학적으로 독립적인 웰로 공간적으로 분할하여 TFM용 고처리량 플랫폼을 만들고, 기존 멀티웰 시스템과 호환되는 견인력 스크리닝을 위한 멀티 웰 플랫폼을 만들었습니다.
이 원고에서는 이 다중 웰 견인력 시스템을 사용하여 중형 전이(EMT)에 대한 상피를 검사합니다. 우리는 TGF-β에 노출시킴으로써 NMuMG 세포에서 EMT를 유도하고 EMT 동안 생물물리학적 변화를 정량화합니다. 우리는 TGF-β 노출의 농도 및 지속 시간의 함수로서 수축성을 측정합니다. 여기에서 우리의 사실 인정은 질병 생물물리학의 맥락에서 병렬화된 TFM의 유용성을 보여줍니다.
서론
Acto-myosin 수축은 활성 세포 역학의 필수 요소, 줄기 세포 분화운동성 및 증식에서 세포 행동에 영향을 미치는. 조직에서 수축성은 배아 발생의 극성 분리에서 기도 수축 및 심장 활동으로 의 활동을 유도합니다. 비판적으로, 긴장을 생성하기 위하여는, 세포는 첫째로 그들의 세포외 환경에 부착해야 합니다. 이 과정에서 이 수축은 주변 환경에 견인력을 생성합니다. 견인력 현미경 검사법 (TFM)은 다른 조건하에서 다양한 세포에서 이 힘을 정량화하는 쪽으로 양식의 다수에서 나타났습니다.
TFM 분야는 혁신과 응용의 뛰어난 폭을 보았다, 그 결과는 역학과 물리적 힘을 통합 생물학의 새로운 관점에 대한 길을 열었습니다. 주름 실리콘 기판 1을시작으로 연구자들은 세포 견인력을 측정하기 위해 다양한 기술을 적용했습니다. 이러한 접근법은 지속적으로 개선되었으며 이제 몇 미크론2의순서로 해상도 수준에 도달했습니다. 그러나, 한 가지 주요 문제점이 대두되고 있는데, 이는 사용 가능한 실리콘을 이용하여 적당히 낮은 변계의 기판을 만드는 데 어려움이 있다. 이러한 문제점을 회피하기 위해, 폴리아크릴아미드는 1-20 kPa 3의 순서로 기판을 쉽게
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프로토콜
참고: 다음 프로토콜은 그림1에 표시된 다중 웰 TFM 접시를 제작하고 사용하는 연구원을 안내합니다.
1. PDMS 실리콘 기판의 제조
- 시판되는 두 키트의 복합 혼합물에 기초한 PDMS 실리콘 고무 혼합물의 제조.
- PDMS 키트의 파트 A 및 파트 B(예: GEL-8100, 재료 표참조)를 50mL 튜브에 1:1 중량 비로 추가합니다.
참고: 혼합물은 회전하는 동안 혼합물이 앞뒤로 흐를 정도로 느린 속도로 회전자 위에 혼합되어 완전한 혼합을 보장합니다. - 기판의 원하는 계수에 필요한 경화제양을 첨가한다.
참고: 혼합물에 첨가되는 경화제의 양은 기판의 원하는 계수에 따라 달라지며 전형적으로 0.1%에서 1.8%까지 다양할 수 있다. 특정 크로스링커 농도 및 결과 모듈리에 대한 가이드는 표 1 및 그림 3을 참조하십시오. - 30-45 분 동안 회전자 상에 제형을 혼합; 철저한 혼합을 위해 회전이 충분히 느려지는지 확인하십시오.
- PDMS 키트의 파트 A 및 파트 B(예: GEL-8100, 재료 표참조)를 50mL 튜브에 1:1 중량 비로 추가합니다.
- 하단 층 : 유리 슬라이드에 PDMS ....
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결과
TGF-β를 첨가하기 전에, 세포의 결합 된 단층은 모양과 같은 조약돌을 가지고 단단히 포장된다. TGF-β 처리시, 세포는 세포 영역을 확대하고 더 중간 엽 표현형을 취득, 형태학에서 더 길쭉해진다. 연약한 PDMS 엘라스토머로 제조된 다중 웰 디바이스를 활용하여, 총 17개의 상이한 조건에서 세포의 물성을 연구하였다. 세포를 4개의 상이한 TGF-β 농도(0.5, 1, 2 및 4 ng/mL)와 4개의 상이한 인큐베이션 시간(12, 24, 48, 96 h)으로 처리하였고, 이들 결과는 도5에 요약된다. TGF-β로 처리된 세포는 TGF-β 없이 배양된 세포보다 더 큰 견인 응력 및 변형 에너지를 적용하였다. 96h에 대한 TGF-β로 배양된 세포는 가장 큰 견인 응력 및 변형 에너지를 보였다. 세포는 TGF-β의 더 높은 농도로 취급될 때 더 큰 응력 및 긴장 에너지를 적용했습니다. 견인력과 스트레인 에너지의 차이는.......
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토론
이 방법의 성공을 위해 약 100 μm의 일정한 두께의 균일하게 코팅된 샘플을 사용하는 것이 중요합니다. 계수는 관심있는 생물학적 시스템의 물리적 중요성을 검사하기 위해 신중하게 선택해야합니다. 최상위 층을 제작할 때, 변위 및 견인 응력의 정확한 분석을 위해 피소형 입자의 농도를 최적화해야 합니다. 단리된 단일 세포를 분석하려면 최대 단일 층을 측정하는 것보다 밀도가 높은 신탁 층이 필요합니다. 부가적으로, 기판의 표면은 기질 표면에 세포의 적당한 부착을 보장하기 위하여 콜라겐, 섬유넥틴 및 라미닌과 같은 접착 분자의 안정적이고 균일한 코팅이 있어야 한다. 멀티 웰 디바이더를 부착할 때는 각별한 주의를 기울여야 합니다. 그것은 배양 표면에 얼룩에서 밀봉 PDMS 접착제를 방지하기 위해 슬라이딩하지 않고 배치해야하며, 외부 가장자리는 조심스럽게 국경 우물에 누출을 방지하기 위해 유리 치수와 정렬해야합니다.
우물이 새는 것을 방지하기 위해 적절한 양의 PDMS 접착제를 잘 분배기위.......
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공개 사항
AJE와 RK는 이 문서에서 설명하는 자료를 제작하는 회사인 라이브 셀 테크놀로지스(Live Cell Technologies)에 관심을 가지고 있습니다.
감사의 글
저자들은 톰 코저, 마이클 랜디, 크리스토퍼 제이 배럿에게 비드 합성에 도움을 준 것에 대해 감사를 표한다. A.J.E.는 자연과학 및 공학 연구 위원회가 RGPIN/05843-2014 및 EQPEQ/472339-2015, 캐나다 보건 연구 기관 보조금 제143327호, 캐나다 암 학회 보조금 703930, 캐나다 혁신 재단을 승인합니다. 프로젝트 #32749. R. 크리슈난은 국립 보건원 보조금 없음을 인정합니다. R21HL123522 및 R01HL136209. H.Y.는 폰드 드 레체쉬 산테 퀘벡, 퐁 드 레쉐 네이처 에 테크놀로지스 퀘벡의 지원을 받았습니다. 저자는 비디오와 원고와 Zixin He가 비디오를 준비하는 데 도움을 준 요한난 이디쿨라에게 감사를 표합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Plate | |||
| GEL-8100 | Nusil Technology | GEL-8100 | 고순도 유전체, 소프트 실리콘 젤 키트 |
| Dow Corning Sylgard 184 실리콘 봉지재 클리어 0.5 kg 키트 | Ellsworth 접착제 | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | 경화제 |
| 맞춤형 컷 글라스 | Hausser Scientific Company | 109.6mm± x 72.8mm± x 1mm 두께 | |
| Target 2TM 나일론 주사기 필터 | ThermoFisher Scientific | F2513-4 | |
| 96-well Stripwell Egg Crate 스트립 홀더 | Corning | 2572 | |
| 폴리스티렌 유니버설 마이크로플레이트 뚜껑 모서리 노치 | Corning | 3099 | |
| 에틸 알코올 | Greenfield Global | P016EA95 | 0.95 |
| 2-프로판올 | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS 시약, ≥ 99.5% |
| 표면 코팅 | |||
| Sulfo-SANPAH Crosslinker | Proteochem | c1111-100mg | |
| Fibronectin 소 혈장 | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | 용액, 멸균 여과, BioReagent, 세포 배양 |
| PBS에 적합, 1X | Wisent | 319-005-CL | pH 7.4, 칼슘 및 마그네슘 없음 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| <강>세포 배양 | |||
| DMEM, 1X | Wisent | 319-005-CL | 4.5g/L 포도당, L-글루타민, 나트륨 피루베이트 및 페놀 레드 |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Wisent | 080-150 | 프리미엄 품질, 내독소 < 1, 헤모글로빈 < 25 |
| HEPES | Wisent | 330-050-EL | 1M, 유리 산 |
| 인간 인슐린 재조합 | Wisent | 511-016-CM | USP 등급 |
| 페니실린-스트렙토마이신 용액 | Wisent | 450-201-EL | 100 X, 세포 배양을 위해 멸균 여과 |
| L-글루타민 용액 | Wisent | 609-065-EL | 200mM 용액, 세포 배양을 |
| 위해 멸균 여과Amphotericine B | Wisent | 450-105-QL | 250μ g/ml, 세포 배양을 위해 여과된 멸균 |
| 재조합 인간 TGF-β 1 | Peprotech | 100-21 | HEK293 파생 |
| 아세트산 | Sigma-Aldrich | 537020 | 빙하, ≥ 99.85% |
| Cictric acid | 시그마-알드리치 | 251275 | ACS 시약, ≥ 99.5% |
| NMuMG | ATCC | CRL-1636 | 마우스 유선세포주 |
| 아지드화나트륨 | 피셔 정신 | AC190385000 | 99%, 초순수, ACROS 유기물 |
| 산화칼 | 시그마-알드리치 | 221473 | ACS 시약, ≥ 85%, 펠릿 |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X100 | 실험실 등급 |
| <강한>비드 합성 | |||
| 1,1&프라임;-디옥타데실-3,3,3&프라임;,3&프라임;-테트라메틸인도카르보시아닌 과염소산염(DiI) | 시그마-알드리치 | 468495-100MG | 97% |
| 메틸 메타크릴레이트 | 시그마-알드리치 | M55909-500ML | 에는 ≤ 30 억제제로서의 ppm MEHQ, 99% |
| 억제제 제거제 | Sigma-Aldrich | 306312-1EA | 하이드로퀴논 및 모노메틸 에테르 하이드로퀴논 제거용 사전 포장 컬럼 |
| Methacryloxylpropyl Terminated Polydimethylsiloxane | Gelest | DMS-R31 (25,000g/mol) | 폴리디메틸실록산 안정제, 25,000g/mol, 1,000 cSt |
| 2,2′-Azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN) | Sigma-Aldrich | 441090-25G | 98% |
| 헥산 | 시그마-알드리치 | 296090-2L | 무수, 95% |
| 헥산, 이성질체 혼합물 | Sigma-Aldrich | 227064-1L | 무수, ≥ 99% |
| 왓맨 품질 여과지, 1등급 | 시그마-알드리치 | WHA1001055 | 원, 직경 55 mm, |
| Equipment | |||
| Laurell WS-650Mz-23NPPB | Laurell Technologies | ||
| UVP 휴대용 UV 램프 모델 UVGL-58 | VWR | 21474-622 | |
| 레오미터 | Anton Paar | MCR 302 WESP |
참고문헌
- Harris, A., Wild, P., Stopak, D. Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion. Science. 208 (4440), 177-179 (1980).
- Oliver, T., Dembo, M., Jacobson, K. Traction forces in locomoting cells. Cell Motil Cytoskeleton. 31 (3), 225-240 (1995). <....
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재인쇄 및 허가
