지속적인 화학 물질의 트랜스 및 다세대 효과는 환경과 인간의 건강에 대한 장기적인 결과를 판단하는 데 필수적입니다. 우리는 자유로운 살아있는 선충 예쁜 꼬마 예쁜꼬마선충을 사용하여 트랜스 및 다세대 효과를 연구하기위한 새로운 상세한 방법을 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
화학 물질의 독성에 대한 정보는 응용 및 폐기물 관리에 필수적입니다. 낮은 농도에서 화학 물질에 대 한, 장기적인 효과 환경및 인간의 건강에 그들의 결과 판단에 매우 중요 하다. 장기적인 영향을 입증할 때, 최근 연구에서 여러 세대에 걸친 화학 물질의 영향은 새로운 통찰력을 제공합니다. 여기에서는 자유로운 살아있는 선충 예쁜꼬마선충을 사용하여 여러 세대에 걸쳐 화학 물질의 효과를 연구하기위한 프로토콜을 설명합니다. 2개의 양상이 제시됩니다: (1) trans-generational (TG) 및 (2) 다세대 효과 연구, 후자는 다세대 노출 (MGE) 및 다세대 잔류 (MGR) 효과 연구로 분리됩니다. TG 효과 연구는 부모에 화학 물질 노출자자식에 어떤 잔여 결과 귀착될 수 있는지 여부를 결정하는 간단한 목적을 가진 강건합니다. 효과에 대한 효과가 부모에 측정 된 후, 나트륨 하이포 염염 용액은 부모를 죽이고 자손을 유지하는 데 사용되어 자손에 대한 효과 측정을 용이하게합니다. TG 효과 연구는 부모가 오염 물질에 노출될 때 자손이 영향을 받는지 여부를 결정하는 데 사용됩니다. MGE 및 MGR 효과 연구는 연속적인 세대 노출이 세대에 걸쳐 자손에 적응 반응을 초래할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 체계적으로 사용됩니다. 각 세대에 대한 효과 측정을 용이하게 하기 위해 세대를 구별하기 위해 신중한 픽업 및 이송이 사용됩니다. 우리는 또한 운동 행동, 재생산, 수명, 생화학 및 유전자 발현 변화를 측정하기 위해 프로토콜을 결합했습니다. 몇 가지 예의 실험은 또한 트랜스-및 다세대 효과 연구를 설명하기 위해 제시된다.
서론
화학 물질의 적용 및 폐기물 관리는 특정 농도에서 그 효과의 정보에 크게 의존한다. 특히, 시간은 효과와 농도 사이 또 다른 필수 요소. 즉, 화학 물질, 특히 실제 환경에서 낮은 농도의 화학 물질은 측정 가능한 효과를 유발할 시간이 필요합니다1. 따라서, 연구원은 동물 실험에 있는 노출 기간의 다른 길이를 배열하고, 심지어 전체 수명 주기를 커버합니다. 예를 들어, 마우스는 니코틴에 30, 90 또는 180일 동안 그 독성 효과를 연구하기 위해 2. 그러나, 이러한 노출 기간은 여전히 환경에서 유기체의 세대에 걸쳐 지속 될 수있는 오염 물질 (예를 들어, 지속적인 유기 오염 물질 [POPs])의 장기적인 효과를 해명하기에 충분하지 않습니다. 따라서, 세대에 걸쳐 효과에 대 한 연구 점점 더 많은 관심을 얻고 있다.
세대 간 효과 연구에는 두 가지 주요 측면이 있습니다. 첫 번째는 부모에게 화학 물질 노출이 자손에 어떤 결과를 초래할 수 있는지 여부를 강력하게 테스트 할수있는 트랜스 세대 (TG) 효과 연구입니다 3. 두 번째는 노출 및 잔류 효과 모두에서 고려 사항으로 보다 체계적인 다세대 효과 연구입니다. 한편으....
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프로토콜
1. 문화 대장균 OP50
- 100 mL 의 물에 4g의 수산화 나트륨을 용해시켜 1M 수산화 나트륨 용액을 준비하십시오.
- 1L 원추형 플라스크에 1L의 초순수 1L와 함께 트립톤 10g, 효모 추출물 5 g, 염화나트륨 10g을 용해시켜 리소제니 육액(LB) 배지를 준비합니다. 1M 수산화 나트륨 용액으로 pH를 7.0으로 조정합니다.
- 1.2단계에서 20개의 원추형 플라스크(최대 허용 부피: 100 mL)로 LB 액상 배지를 각각 50 mL 배지로 Aliquot. 원추형 플라스크를 크래프트 페이퍼로 덮습니다.
- LB 액상 배지를 121°C 및 0.105 MPa에서 20분 동안 살균합니다.
- 박테리아 현탁물로부터 피펫 200 μL(단계 1.8 참조) 또는 접종 루프를 사용하여 한천으로부터 작은 콜로니를 선택(단계 2.14)을 선택하여, LB 배지에 놓는다.
- LB 배지를 37°C에서 150 rpm에서 24-48시간 동안 흔들어 서 배양한다. LB 배지는 갈색 투명 액체에서 탁한 카키 색 서스펜션으로 변경됩니다.
- 총 플라스크의 80%에서 세균 현탁액을 사용하여 대장균 OP50을 2.11단계에서 사용할 선충식품으로 제공한다.
- 세균....
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결과
여기서는 트랜스 제너레이션(TG), 다세대 노출(MGE) 및 다세대 잔류(MGR) 효과 연구에서 C. elegans를 사용하여 세대에 걸쳐 화학 물질의 효과를 연구하는 프로토콜을 설명합니다. 우리 자신의 연구 결과는 예로 제시된다. 한 연구는 운동 행동에 중금속의 TG 효과를 제시3. 다른 두 연구는 재생 및 생화학 및 유전 지수 측정에 설포메톡사졸과 린딘의 MGE 및 MGR 효과를 제시4,14.
중금속의 운동 거동에 대한 TG 효과 C. 예쁜꼬마선충
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토론
설명된 프로토콜을 성공적으로 수행하려면 다음 제안을 고려해야 합니다. 멸균 환경에서 전체 실험 작업을 수행합니다. 부적절한 작동은 대장균 균주의 오염을 초래할 수 있습니다, 예를 들어, 곰팡이와 계귀는 C. 예쁜 꼬마의 정상적인 성장을 방해하고 따라서 실험 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. C. 예쁜꼬마선충을 기르는 것을 설명하는 섹션에서는 육안이나 현미경으로 NGM 한천에서 C. 예쁜 꼬마의 성장 규모를 관찰하십시오. 한천에 있는 C. 예쁜꼬마선충의 규모가 지역에서 75%를 초과하거나 배양 시간이 1주를 초과하면, C. 예쁜꼬마선충의과잉 성장 또는 인구 감소를 피하기 위해 새로운 접종을 수행한다. 동기화 과정 전에 현미경을 사용하여 C. elegans의성장을 관찰하고 선충 알이 한천에 널리 분포될 때 과정을 계속합니다. 또한, 용매(예: 디메틸 설폭사이드[DMSO])가 사용되는 경우, 최종 농도가 용매 자체의 부작용.......
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공개 사항
저자는 국가 과학 기술 주요 수질 오염 제어 및 처리 프로젝트 (2017ZX07201004) 및 중국의 국제 과학 기술 협력 프로그램 (No. 2016YFE0123700)의 재정 지원에 감사드립니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아가 파우더 | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 9002-18-0 | |
| 79nnHT 빠른 실시간 PCR 시스템 | 어플라이드 바이오시스템 | ||
| 96웰 멸균 마이크로플레이트 | Costar? 코 닝? 미국 | ||
| 오토클레이브 살균기 | Tomy, Tomy Digital Biology, 일본 | ||
| 생물안전 캐비닛 | LongYue, Shanghai longyue instrument equipment co. Ltd, 중국 | ||
| 염화칼슘 | Sinopharm 화학 시약 회사 Ltd, 중국 | 10043-52-4 | |
| 원심분리기 5417R | Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, 독일 | ||
| 원심 분리기 튜브 | Axygen, Aixjin 생명 공학 (항저우) 주식 회사, 미국 | ||
| 콜레스테롤 | Sinopharm 화학 시약 회사 주식 회사, 중국 | 57-88-5 | |
| 디메틸 설폭 | VETEC, Sigmar aldrich (상하이) 무역 유한 회사, 미국 | 67-68-5 | |
| 인산 수소 | 나트륨 Sinopharm 화학 시약 회사 주식 회사, 중국 | 7558-79-4 | |
| 에탄올 | Sinopharm 화학 시약 회사 Ltd, 중국 | 64-17-5 | |
| 필터 | 열, Thermo Fisher Scientific, 미국 | ||
| 인큐베이터 | YiHeng17, 상하이 yiheng 과학 기기 co. Ltd, 중국 | ||
| 접종 루프 | |||
| K2HPO4• 3H2O | Sinopharm 화학 시약 회사 주식 회사, 중국 | 16788-57-1 | |
| kraft 종이 | |||
| Mcroplate Reader | Boitek, Boten apparatus co. Ltd, America | ||
| MgSO4• 7H2O | Sinopharm 화학 시약 회사 Ltd, 중국 | 10034-99-8 | |
| 현미경 XTL-BM-9TD | BM, 상하이 BM 광학 기기 제조 co. Ltd, 중국 | ||
| 페트리 접시 | |||
| 피펫 | Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, 독일 | ||
| 염화칼 | Sinopharm 화학 시약 회사 Ltd, 중국 | 7447-40-7 | |
| 인산이수소 칼륨 | Sinopharm 화학 시약 회사 회사 Ltd, 중국 | 7778-77-0 | |
| Qiagen RNeasy 키트 | Qiagen Inc., Valencia, CA, United States | ||
| QuantiTect SYBR Green RT-PCR 키트 | Qiagen Inc., Valencia, CA, United States | ||
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Scientific, Wilmington, DE, United States | ||
| chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7647-14-5 | |
| sodium hydroxide | Sinopharm 화학 시약 회사 주식 회사, 중국 | 1310-73-2 | |
| 차아 염소산 나트륨 용액 | 알라딘, 상하이 알라딘 생화학 기술 유한 공사, 중국 | 7681-52-9 | |
| 트립톤 | OXOID, Thermo Fisher Scientific, 영국 | 73049-73-7 | |
| 효모 추출물 | OXOID, Thermo Fisher Scientific, 영국 | 119-44-8 |
참고문헌
- Yu, Z., Zhang, J., Hou, M. The time-dependent stimulation of sodium halide salts on redox reactants, energy supply and luminescence in Vibrio fischeri. Journal of Hazardous Materials. 342, 429-435 (2018).
- Li, W., et al.
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재인쇄 및 허가
