우리는 에틸 또는 메틸 이오페노산과 함께 포로 몽구스 위약 경용 광견병 백신 미끼를 바이오마커로 제공하고 탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS) 방법을 사용한 새로운 액체 크로마토그래피를 사용하여 미끼 섭취를 검증했습니다.
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방법 논문
작은 인도 몽구스(헤르페스 오로 punctatus)에서이오페녹산 유사체의 분석은 구강 광견병 예방 접종 생물학적 마커로 사용하기위한 세라
이 논문에서
요약
초록
작은 인도 몽구스(Herpestes auropunctatus)는푸에르토리코에서 광견병 바이러스 (RABV)의 저수지이며 매년보고되는 동물 광견병 사례의 70 % 이상을 포함합니다. 야생 동물 저수지에서 RABV 순환의 제어는 일반적으로 구강 광견병 예방 접종 (ORV)의 전략에 의해 수행됩니다. 현재 푸에르토리코에는 야생 동물 ORV 프로그램이 없습니다. 구강 광견병 백신 및 몽구스를 위한 각종 미끼 모형에 대한 연구는 유망한 결과로 실시되었습니다. ORV의 성공을 모니터링하는 것은 일반적으로 RABV 중화 항체 (RVNA) 포스트 예방 접종의 변화를 평가하는 것을 포함하는 표적 종에 의하여 미끼 섭취를 추정에 의존합니다. 이 전략은 활성 야생 동물 ORV 프로그램을 가진 지역 또는 RABV가 Enzootic 및 RVNA의 배경 수준이 저수지 종에 존재하는 지역에서 해석하기 어려울 수 있습니다. 이러한 상황에서, 백신 또는 미끼 매트릭스와 통합된 바이오마커가 유용할 수 있다. 우리는 미끼 내부0.4 %와 1 %의 농도에서 에틸 이오페노산 (et-IPA)을 함유 한 16 개의 포로 몽구스 위약 ORV 미끼를 외부 미끼 매트릭스에서 제공했습니다. 우리는 또한 외부 미끼 매트릭스에서 0.035 %, 0.07 %, 0.14 %의 농도로 메틸 - 이오페노산 (me-IPA)을 함유 한 12 개의 포로 몽구스 ORV 미끼를 제공했습니다. 우리는 미끼 제공 하기 전에 혈 청 샘플을 수집 하 고 최대 8 주 포스트 제공에 대 한 다음 매주. 우리는 혈청에서 아세토니트릴로 이오페노산산을 추출하고 액체 크로마토그래피/질량 분석법을 사용하여 정량화했습니다. 우리는 액체 크로마토그래피 질량 분광법에 의해 et-IPA 또는 me-IPA에 대한 세라를 분석했습니다. 우리는 et-me-IPA에 대해 적어도 8 주와 4 주 동안 적절한 마킹 능력을 발견했습니다. 두 IPA 유도체 모두 몽구스에서 ORV 미끼 섭취량의 현장 평가에 적합할 수 있다. 몽구스 세라에서 마커의 수명으로 인해 연속 평가 중에 동일한 IPA 유도체를 사용하여 결과를 혼동하지 않도록 주의해야 합니다.
서론
광견병 바이러스(RABV)는 부정적 감각의 단일 좌초 된 lyssavirus이며, 카니보라와 치옵테라 의 주문 내에서 다양한 야생 동물 저수지 종 들 사이에서 순환한다. 몽구스의 여러 종은 RABV의 저수지이며, 작은 인도 몽구스(Herpestes auropunctatus)는푸에르토리코와 서반구 1,2,3의 다른 카리브 해 제도에서 유일한 저수지입니다 . 야생 동물 저수지에서 RABV 순환의 제어는 일반적으로 구강 광견병 예방 접종 (ORV)의 전략을 통해 수행됩니다. 미국(미국)에서는 이 관리 활동이 USDA/APHIS/야생 동물 서비스 국립 광견병 관리프로그램(NRMP) 4에 의해 조정됩니다. 현재 푸에르토리코에는 야생 동물 ORV 프로그램이 없습니다. 광견병 백신및 몽구스를 위한 다양한 미끼 종류에 대한 연구는 몽구스를 위한 ORV 프로그램이가능하다는 것을 시사하는 유망한 결과로 실시되어 5,6,7,
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프로토콜
모든 절차는 승인 된 연구 프로토콜 QA-2597에 따라 USDA 국립 야생 동물 연구 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
참고: 다음 프로토콜은 몽구스 혈청에서 메틸-이오페노산검출분석 절차를 기술한다. 이 방법은 몽구스 혈청에서 에틸 이오페노산의 분석으로 시작된 반복 과정의 최종 버전입니다. 에틸-이오페노산의 초기 평가 동안 사소한 변형이 이 방법들을 수정하였고, 그 결과 아래에 제시된 최종 프로토콜이 생성되었다. 대표적인 결과에는 두 반복 모두에서 얻은 결과가 포함됩니다.
1. 솔루션 및 표준 준비
- me-IPA 및 ET-IPA를 구입하십시오.
- 이월 A의 경우, 1 mL의 포름산과 1L의 초순수(≥ 18 MΩ)를 결합하여 물에 0.1%(v/v) 포름산 1L을 준비합니다. 이월 B의 경우, 1mL의 포름산을 ACN 1L과 결합하여 아세토니트릴(ACN)에 0.1% (v/v) 포름산 1L을 준비합니다.
- 희석제의 경우, TFA 1mL과 ACN 200 mL을 결합하여 ACN에서 0.5% (v/v) 삼중불소산(TFA)의 200 mL를 준비합니다.
- 약 1,000 μg/mL의 농도로 ACN에서 me-IPA 및 ....
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결과
me-IPA 분석에서 대표적인 이온 크로마토그램은 그림1에 제시되어 있다. 대조군 몽구스 혈청(도1A)은지시된 보존 시간에 et-IPA(대리 analyte)의 보존 시간 및 me-IPA의 부재를 도시한다. 품질 관리 샘플(그림1B)은me-IPA에 대한 정량자 및 한정자 전환뿐만 아니라 et-IPA로부터 의 me-IPA의 기준선 분리를 도시한다. 도 1C는 33.5 μg/mL me-IPA의 관찰된 혈청 농도를 가진 연구에서 대표적인 샘플을 나타낸다.
me-IPA 분석의 대표적인 교정 곡선은 그림2에 나.......
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토론
연구를 위해 개발된 LC-MS/MS 방법은 몽구스 혈청에서 me-IPA 및 et-IPA를 정확하게 정량화하기 위해 다중 반응 모니터링의 선택성을 활용하였다. MS/MS 검출의 선택성은 또한 분석 전에 혈청에서 단백질을 침전시키기 위하여 아세토니트릴에 전적으로 의존하는 간단한 정리 프로토콜을 허용했습니다.
이오페노산은 ACN에서 용해되지만 물에 실질적으로 용해되지 않습니다. ACN 추출로부터 물을 배제하기 위해, 염화나트륨을 첨가하여 맑은 물을 강제로 첨가하였다:ACN 상 분리는 수성(혈청) 상으로부터의 이온 강도를 증가시킴으로써 분리되었다. 휘발성 산 삼류 성 산 (TFA) 또한 iophenoxic 산 추출 하는 동안 protonatated 하 고 ACN 단계에서 더 쉽게 용해 될 것 이다 보장 하기 위해 추가 되었습니다. TFA는 LC-MS/MS 분석 전에 드라이다운 단계 동안 제거된다.
몽구스에서 혈액 무승부는 약 1 mL, .......
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공개 사항
저자 AV 및 SO는 경구 광견병 백신 미끼 제조 업체의 풀 타임 직원입니다.
감사의 글
이 연구는 미국 농무부, 동물 및 식물 건강 검사 서비스, 야생 동물 서비스, 국립 광견병 관리 프로그램 및 IDT 바이오로지카(독일 데사우-로슬라우)의 교내 연구 프로그램에 의해 부분적으로 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아세토니트릴, 옵티마 등급 | Fisher | A996 | |
| 분석 저울 | Mettler Toledo | XS204 | |
| C18 컬럼, 2.1 x 50mm, 2.5-&마이크로; m 입자 크기 | Waters Corp. | ||
| ESI 출처 | Agilent | G1958-65138 | |
| 에틸-이오페녹산, 97 % | Sigma Aldrich | N/A | Lot |
| MKBP5399V름산, LC/MS 등급 | Fisher | A117 | |
| LCMS 소프트웨어 | Agilent | MassHunter 데이터 수집 및 정량 분석 | |
| 메틸-요오페녹산, 97 % (w/w) | PR EuroChem Ltd. | N/A | Lot |
| PR0709514717 미세분석 저울 | Mettler Toledo | XP6U | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415C | |
| MS/MS | Agilent | G6470A | |
| N-Evap | Organomation | 115 | |
| Oral Rabies Vaccine Baits | IDT Biologika, Dessau Rossleau, 독일 | N/A | |
| 프로필-요오페녹산, 99 % (w/w) | PR EuroChem Ltd. | N/A | Lot PR100612108RR |
| Repeat 피펫터 | Eppendorf | M4 | |
| Screw-top autosampler 바이알 캡, PTFE 라이닝 | Agilent | 5190-7024 | |
| 염화나트륨, ACS 등급 인증 | Fisher | S271 | |
| Statistical Software Package | SAS Institute, Cary, North Carolina, USA | N/A | |
| 트리플루오로아세트산, 99 % | Alfa Aesar | L06374 | |
| UPLC | Agilent | 1290 시리즈 | |
| Vortex Mixer | Glas-Col | 099A PV6 | |
| 0.2-mL 피펫터 팁 | Eppendorf | 30089.413 | |
| 0.5-mL 피펫터 팁 | Eppendorf | 30089.421 | |
| 1.5-mL 마이크로 원심분리기 튜브 | Fisher | 14-666-325 | |
| 1250-& 마이크로; L 용량 피펫 팁 | GeneMate | P-1233-1250 | |
| 1-mL 피펫 팁 | Eppendorf | 30089.43 | |
| 2-mL 황색 스크류 탑 자동 시료 주입기 바이알 | Agilent | 5182-0716 | |
| 5-mL 피펫 팁 | Eppendorf | 30089.456 | |
| 80-Position microcentrifuge tube rack | Fisher | 05-541-2 | |
| 8-mL 앰버 바이알 PTFE 라이닝 캡 | Wheaton | 224754 | |
| 70 % (v/v) 이소프로판올 | Fisher | A459 | |
| 100-1000 µ L 공기 변위 피펫 | Eppendorf | ES-100 |
참고문헌
- Nel, L. H., et al. Mongoose rabies in southern Africa: a re-evaluation based on molecular epidemiology. Virus Research. 109 (2), 165-173 (2005).
- Zieger, Z., et al. The phylogeography of rabies in Grenada, W....
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재인쇄 및 허가
