단일 분자 추적 현미경 검사법 - 세포화 분자의 확산 상태를 결정하는 도구

Summary

3D 단일 분자 국소화 현미경 검사법은 살아있는 세균 세포에서 형광표지된 단백질의 공간 위치 및 운동 궤적을 조사하는 데 사용됩니다. 본원에 기재된 실험 및 데이터 분석 프로토콜은 풀화된 단일 분자 궤적에 기초하여 세포성 단백질의 널리 퍼진 확산 거동을 결정한다.

Abstract

단 하나 분자 현지화 현미경 검사법은 수십 나노미터 공간 및 밀리초 측두력 해결책으로 살아있는 세포에 있는 개별 분자의 위치 그리고 운동을 조사합니다. 이러한 기능은 생리학적으로 관련된 환경에서 분자 수준의 생물학적 기능을 연구하는 데 이상적으로 적합한 단일 분자 국소화 현미경 검사법을 만듭니다. 여기서, 우리는 관심 있는 단백질이 나타낼 수 있는 상이한 확산 상태를 추출하기 위해 단일 분자 추적 데이터의 획득 및 처리/분석을 위한 통합 프로토콜을 입증한다. 이 정보는 살아있는 세포에 있는 분자 복합체 대형을 정량화하기 위하여 이용될 수 있습니다. 우리는 카메라 기반의 3D 단일 분자 국소화 실험뿐만 아니라 개별 분자의 궤적을 산출하는 후속 데이터 처리 단계에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 이 궤적은 형광표지된 분자및 이 상태의 상대적인 풍부의 널리 퍼진 확산 상태를 추출하기 위하여 수치 분석 프레임워크를 사용하여 분석됩니다. 분석 프레임워크는 임의의 셀 기하학에 의해 공간적으로 제한된 세포 내 브라우니안 확산 궤적의 스토시 시뮬레이션을 기반으로 합니다. 시뮬레이션된 궤적을 기반으로 원시 단일 분자 이미지가 실험 이미지와 동일한 방식으로 생성되고 분석됩니다. 이러한 방식으로 실험적으로 교정하기 어려운 실험 정밀도와 정확도 제한은 해석 워크플로우에 명시적으로 통합됩니다. 널리 사용되는 확산 상태의 확산 계수 및 상대 모집단 분율은 시뮬레이션된 분포의 선형 조합을 사용하여 실험 값의 분포를 피팅하여 결정됩니다. 우리는 세균성 병원체의 시토솔에서 호모- 및 이종 올리고머 복합체를 형성할 때 다른 확산 상태를 나타내는 단백질의 확산 상태를 해결함으로써 프로토콜의 유용성을 입증합니다.

Introduction

생체 분자의 확산 거동을 검사하면 생물학적 기능에 대한 통찰력을 제공합니다. 형광 현미경 검사법 기반 기술은 그들의 모국적인 세포 환경에서 생체 분자를 관찰하기위한 귀중한 도구가되었습니다. 광표백(FRAP) 및 형광 상관분광법(FCS)¹ 후형광 회복은 앙상블 평균 확산 거동을 제공합니다. 반대로, 단 하나 분자 현지화 현미경 검사법은 높은 공간 및 시간^분해능을가진 개별형질 표를 붙인 분자의 관찰을 가능하게 합니다^2,3,4. 관심 있는 단백질이 다른 확산 상태에 존재할 수 있기 때문에 개별 분자를 관찰하는 것은 유리합니다. 예를 들어, 대장균의CueR과 같은 전사 조절기가 시토솔에서 자유롭게 확산되거나 DNA 서열에 결합하여 측정 시간 척도에 고정될 때 두 가지 쉽게 구별할 수 있는 확산 상태가^{발생합니다 5} . 단일 분자 추적은 이러한 서로 다른 상태를 직접 관찰하기 위한 도구를 제공하며 이를 해결하기 위해 정교한 분석이 필요하지 않습니다. 그러나, 그들의 확산 비율이 더 유사한 경우에 다중 확산 상태 및 그들의 인구 분수를 해....

Protocol

1. 이중 나선 점 확산 기능 교정

참고: 이에 기재된 이미지 및 이하의 섹션은 Rocha 등^23에기재된 바와 같이 맞춤형 거꾸로 된 형광 현미경을 사용하여 획득된다. 동일한 절차는 단일 분자 국소화 및 추적 현미경 검사법^2,3,4를 위해 설계된 다른 현미경 구현에 적용 할 수^{있습니다.} 이 문서에 설명된 이미지 수집 및 데이터 처리를 위한 모든 소프트웨어를 사용할 수 있습니다(https://github.com/GahlmannLab2014/Single-Molecule-Tracking-Analysis.git).

1. 현미경으로 볼 수있는 유리 커버 전표에 샘플을 장착하기위한 아가로즈 패드의 준비.
   1. M2G 완충액의 5 mL에 1.5-2 중량 % 낮은 융점을 첨가하십시오 (4.9 mM Na₂HPO_4,3.1 mM KH₂PO_4,7.5 mM NH₄Cl, 0.5 mM MgSO_4,

Results

여기에 설명된 실험 조건(20,000프레임, 최소 4개의 국소화)과 형광 표지된 융합 단백질의 발현 수준에 따라 약 200-3,000개의 국소화가 10-150개 궤적은 셀당 생성될 수있습니다(그림 2a,b). 명백한 확산 계수의 잘 샘플링된 분포를 생성하려면 많은 수의 궤적이 필요합니다. 여기서 수집된 FOV의 크기는 ~55 x 55 μm이며, 실험당 10개의 FOV가 수집됩니다. 따라서, 실험당 >5,000 궤적을 얻으려면 각 FOV는 적어도 50개의 세포를 포함해야 한다. 이상적으로, 세포 집단은 세포가 서로 접촉하지 않고 가능한 한 조밀하게 만들어져야 합니다. 셀 밀도가 너무 높으면 만지거나 겹치는 셀이 있으면 데이터 후처리에설명된 대로 OUFTI(28)를 사용하여 성공적으로 분할하기가 어려워집니다. 분할이 불량하면 세.......

Discussion

제시된 프로토콜의 성공적인 적용을 위한 중요한 요소는 단일 분자 신호가 서로 잘 분리되도록 하는 것입니다(즉, 공간과 시간에 희소해야합니다(보충 Mov.1)). 세포에 동시에 하나 이상의 형광 분자가 있는 경우, 국소화는 다른 분자의 궤적에 잘못 할당될 수 있습니다. 이를 링크 문제^30이라고합니다. 단백질 발현 수준 및 여기 레이저 강도와 같은 실험 조건은 연결 문제를 피하기 위해 선택될 수 있다. 그러나, 대표적인 결과 보장 하기 위해 야생 형 단백질 발현 수준을 얻기 위해 주의 해야 한다. 여기서, 우리는 표지된 단백질의 네이티브 발현 수준을 보장하기 위해 화학적으로 유도성 발현 대신 에네이티브 프로모터의 통제 하에 모든 것을 대체했습니다. 따라서, 여기 레이저 강도(eYFP 깜박임) 또는 활성화 레이저 강도(광-활성 형광 프로브의 경우)는 활성 방출기의 농도를 제 시간에 제어하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 화학염료 표지가 HALO 및 SNAP

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,6-diaminopimelic acid	Chem Impex International	5411	Y. enterocolitica 세포의 성장에 필요합니다.
4f 렌즈	Thorlabs	AC508-080-A	f = 80mm, 2"
514 nm 레이저	Coherent	Genesis MX514 MTM	형광 여기
아가로스	Inivtrogen	16520100	현미경에 액체 박테리아 샘플을 장착하기 위한 젤 패드를 만드는 데 사용됩니다.
염화 암모늄	시그마 Aldrich	A9434	M2G 성분.
대역통과 필터	Chroma	ET510/bp	여기 경로.
뇌 심장 주입	Sigma Aldrich	53286	Y. enterocolitica용 성장 매체.
염화칼슘	시그마 알드리치	223506	M2G 성분.
카메라	이미징 소스	DMK 23UP031	위상차 이미징용 카메라.
유전체 위상 마스크	Double Helix, LLC	N/A	DHPSF 신호를 생성합니다.
인산이나트륨	시그마 알드리치	795410	M2G 성분.
에틸렌디아민테트라아세트산	Fisher Scientific	S311-100	킬레이트 Ca2+. T3SS에서 분비를 유도합니다.
플립 미러	Newport	8892-K	형광과 위상차 경로 사이를 전환할 수 있습니다.
fluospheres	Invitrogen	F8792	형광 비드. 540/560 exication 및 emission 파장. 직경 40nm.
유리 커버 슬립	VWR	16004-302	#1.5, 22mmx22mm
포도	Chem Impex International	811	M2G 성분.
이머젼 오일	Olympus	Z-81025	대물 렌즈에 장착했습니다.
철 (II) 황산염	시그마 Aldrich	F0518	M2G 성분.
긴 패스 필터	Semrock	LP02-514RU-25	방출 경로.
황산 마그네슘	Fisher Scientific	S25414A	M2G 성분.
도립 현미경을 위한	현미경 플랫폼	Mad City Labs	맞춤형
날리딕산	Sigma Aldrich	N4382	Y. enterocolitica 세포는 날리딕산에 내성이 있습니다.
대물 렌즈	Olympus	1-U2B991	60X, 1.4 NA
오존 클리너	Novascan	PSD-UV4	유리 커버 슬립의 배경 형광을 제거하는 데 사용됩니다.
인산칼	시그마 알드리치	795488	M2G 성분.
적색 LED	Thorlabs	M625L3	위상차 이미징을 위한 샘플을 비춥니다.625nm입니다.
sCMOS 카메라	형광 이미징을 위한	Hamamatsu	ORCA-Flash 4.0 V2
단역 통과 필터	Chroma	ET700SP-2P8	방출 경로.
튜브 렌즈	Thorlabs	AC508-180-A	f=180 mm, 2"
Yersinia enterocolitica dHOPEMTasd	N/A	N/A	균주 AD4442, eYFP-YscQ
0차 1/4 파장 플레이트	Thorlabs	WPQ05M-514	여기 경로.