여기서, 우리는 KDM1A 억제물로 처리된 인간 또는 동물 세포, 조직 또는 혈액 샘플에서 KDM1A 표적 결합을 측정하는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 무료 KDM1A 효소의 화학 프로브 태깅및 화학 프로브 기반 면역 검술을 사용하여 표적 직업의 직접 정량화를 채택하고 전임상 및 임상 연구에서 사용될 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
표적 참여의 평가는, 그것이 디자인된 단백질과 약의 상호 작용으로 정의되고, 약 개발 또는 기초 연구 프로젝트에서 어떤 화합물든지의 생물학 활동의 해석을 위한 기본적인 필요조건입니다. 후성 유전학에서, 표적 약혼은 표적에 화합물의 결합을 측정하는 대신 프록시 마커의 분석에 의해 가장 수시로 평가됩니다. 분석된 다운스트림 생물학적 판독은 히스톤 마크 변조 또는 유전자 발현 변화를 포함한다. KDM1A는 유전자 발현의 침묵과 관련된 변형인 모노-및 디메틸화된 H3K4로부터 메틸기를 제거하는 리신 데메틸라제이다. 프록시 마커의 변조는 조사된 세포의 유전적 구성의 세포 유형 및 기능에 의존하며, 이는 해석 및 교차 사례 비교를 매우 어렵게 만들 수 있다. 이러한 문제를 회피하기 위해, 직접 KDM1A 표적 참여의 투여 량 효과 및 역학을 평가하기 위한 다목적 프로토콜이 제시된다. 기재된 분석시험은 KDM1A 화학프로브를 사용하여 억제되지 않은 효소를 포착하고 정량화하고, 유전자 변형없이 세포 또는 조직 샘플에 광범위하게 적용될 수 있으며, 우수한 검출 창을 가지며, 기초 연구에 모두 사용될 수 있습니다. 임상 샘플의 분석.
서론
리신 특이적 데메틸라제 1(KDM1A)은 유전자 전사의 조절에 관여하는 데메틸라제이다. 이 단백질은 종양학에서 후보 약리학적 표적 2로 나타났다; 급성 골수성 백혈병을 포함3 (AML), 골수 형성증 증후군 (MDS)4,골수 섬유증 (MF)5,6,소세포 폐암 (SCLC)7; 겸상적혈구 (SCD)8,9,및 알츠하이머 병 (AD), 다발성 경화증 (MS)을 포함한 중추 신경계 질환에서; 그리고 침략10.
임상 개발에서 KDM1A 억제 화합물의 대부분은 사이클로프로필라민 유도체이며 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(FAD) 보조인자(FAD)에 공유 결합함으로써 단백질을 억제한다. KDM1A의 억제는 유전자 발현 변경을 유도합니다, 그러나 이 변경은 조....
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프로토콜
혈액 샘플은 스페인 법률 (Real Decreto de Biobancos 1716/2011)에 따라 인스티투토 드 Investigación Biomédica Sant Pau Biobank에서 얻어졌으며 지역 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 동물 조직을 사용한 연구는 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 제도적 지침에 따라 수행되었습니다(유럽 공동체 위원회 지침 86/609/EEC)에서 동물 실험 윤리위원회가 수립했습니다. PRAAL-PCB.
1. 분석에 대한 생물학적 샘플의 제조.
주의: 이 프로토콜은 산업 안전 보건 국 (OSHA) 혈액 매개 병원균 표준 (29 CFR 1910.1030), 유럽 의회의 지침 2000 / 54 / EC를 실시 할 수있는 생물학적 샘플의 조작을 포함합니다. 2000년 9월 18일 협의회 또는 이에 상응하는 규정. 또한, 생물학적 샘플은 생물학적활성 연구적 화학 화합물의 흔적을 포함할 수 있으며 프로토콜은 이러한 화합물의 추가 조작을 수반할 수 있다. 실험 개시 전에 사용된 화합물의 안전 데이터 시트(SDS)를 검토하고 적절한 개인 보호 장비(PPE)의 사용을 포함하여 연구 센터에 수립된 모든 적용 가능한 안전 조치를 엄격히 준수하십시오. 적절한 보호....
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결과
총 및 자유 KDM1A 결정의 선형성.
표준 시리즈는 5.3.2.단계에서 기재된 바와 같이, 0~2500 pg의 전길이 인간 재조합 KDM1A 효소를 사용하여 제조하였다. 총 및 자유 rKDM1A의 RLU 값을 평가하여 선형도를 검증하였다(도2A 및 2B). 데이터는 3개의 기술적 복제(n) ± SD를 가진 3개의 실험으로부터 평균으로 표현된다. 3명의 독립적인 자원봉사자의 혈액으로부터 인간 PBMC에서 검출된 총 및 자유 KDM1A의 RLU 값은 도 2C 및 2D의표준 곡선상에 중첩된다. 혈액 샘플은 스페인 법률 (Real Decreto de Biobancos 171.......
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토론
여기에 제시된 프로토콜은 새로운 KDM1A 화학프로브 포획 기반 ELISA를 사용하여 KDM1A 표적 참여를 직접 측정하기 위해 개발되었다. 이 방법은 인간, 쥐 및 마우스 및 개코원숭이(PBMC, 폐, 뇌, 피부, 종양 포함)에서 배양된 인간 세포주 및 생체 내 샘플에서 검증되었지만, KDM1A 항체 표적 에피토프 및 촉매가 있는 다른 종에 쉽게 적용할 수 있습니다. 센터가 보존됩니다. OG-881은 활성 기반 의 화학 프로브이기 때문에, 샘플 품질이 중요하고 샘플의 적절한 조작 및 보존은 특히 프로토콜의 초기 단계에서 추구되어야하며, KDM1A 활성이 보존되도록해야합니다.
현재의 실험 프로토콜은 공유 FAD 표적 억제제에 의한 KDM1A 표적 참여를 분석하도록 최적화되었다. 또한 KDM1A의 FAD 보조인자에 대한 액세스를 차단하는 가역적 억제제와 함께 사용될 수 있다. 체류 시간이 긴 강력한 가역 억제제는 수정되지 않은 프로토콜을 채택할 수 있다.
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공개 사항
저자 타마라 메이스는 전무 이사 및 주주이며, 저자 크리스티나 마스카로와 라켈 루이스 로드리게스는 오리존 유전체학 S.A. 오리존 유전체학 S.A.의 직원이며, KDM1A 억제제 개발 및 사용되는 화합물과 방법을 포함하는 특허를 보유하고 이 문서에서.
감사의 글
이 연구는 오리존 유전체학에 의해 융자되었다. S.A., 호프만 라 로슈, 부분적으로 CIIP-20152001 및 RETOS 협력 프로그램 RTC-2015-3332-1에 의해 지원.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0,05% Trypsin-EDTA (1X) | Thermo Scientific | #25300-062 | |
| 10 X 프로테아제 억제제 정제 | Roche | #11836153001 | |
| 96 딥 웰 저장 블록 | VWR | #734-1679 | |
| 96 웰 ELISA 플레이트 | Nunc | #436110 | |
| 접착제 검은색 필름 | Perkin Elmer | #6050173 | |
| 접착제 투명 필름 | VWR | #60941-062 | |
| 비오틴화 KDM1A 프로브 OG-881 | Oryzon Genomics SA | ||
| 소 혈청 알부민 | 시그마 | # 3117057001 | |
| 소 혈청 알부민 표준 | Thermo Scientific | #23208) | |
| Bradford Protein Assay | BioRad | #500-0001 | |
| 세포 용해 완충액 10X | 세포 신호# | 9803 | |
| 96웰 플레이트용 원심분리기 | Hettich | Rotina 420R | |
| Flask | Thermo Scientific | #156499 | |
| 전장, 효소 활성 인간 재조합 LSD1 / KDM1A | Active Motif | #31426 | |
| GraphPad Prism 5 Project | GraphPad Software | NA | |
| Luminol-Enhacer and Peroxide Solution (Chemiluminescent Substrate) | Thermo Scientific | #37074 | |
| Micro Centrifuge | Eppendorf | 5415 R | |
| 마이크로플레이트 리더 인피니트 200-테칸 | 테칸 | 인피니트 200 | |
| 마우스 단클론 캡처 항체 안티-KDM1A (N-말단 에피토프) | Abcam | #ab53269 | |
| 바늘 G18 게이지 무딘 | BD# | 303129 | |
| ORY-1001 (iadademstat) | Oryzon Genomics S.A. | ||
| PBMC 분리 튜브 10 ml | Greiner bio-one | #163288 | |
| PBMC 분리 튜브 50 ml | Greiner bio-one | #227288 | |
| PBS 1x | Sigma | #D8537 | |
| 플레이트 쉐이커 | Heidolph Instruments | Rotamax 120 | |
| Polysorbate 20 | Sigma | #P7949 | |
| 토끼 단클론 검출 항체 Anti-KDM1A (C-terminal epitope) | Cell Signaling | #672184BF-100 | |
| 2차 항체 과산화효소 접합 당나귀 Anti-rabbit IgG Thermo | Scientific | # 31458 | |
| 분광 광도계 큐벳 1.5 | Deltalab | # 302100 | |
| 큐벳 용 분광 광도계 | GE Healthcare | GeneQuant 1300 | |
| Streptavidin | Promega | #Z704A | |
| 주사기 | BD# | 303172 | |
| 유형 1 초순수 | Millipore | Milli-Q Advantage A10 | |
| 초음파 세척기 | VWR | USC200T |
참고문헌
- Shi, Y. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell. 119 (7), 941-953 (2004).
- Maiques-Diaz, A., Somervaille, T. C. LSD1: biologic roles and therapeutic targeting. Epigenomics. 8 (8), 1103-1116 (2016).
- Maes, T.
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