방법 논문

용매 클리어 뇌 조직에서 광견병 바이러스 감염의 고해상도 3D 이미징

DOI:

10.3791/59402

⸱

2019년 4월 30일

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular Virology and Cell Biology, Friedrich-Loeffler-Institut, Federal Research Institute for Animal Health

이 논문에서

요약

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용매 정리 된 장기의 궁극적 인 3D 이미징과 같은 새로운 면역 염색 호환 조직 지우기 기술은 광견병 바이러스 뇌 감염및 복잡한 세포 환경의 3D 시각화를 허용합니다. 두꺼운 항체 표지 된 뇌 조직 조각은 이미징 깊이를 높이고 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 3D 분석을 가능하게하기 위해 광학적으로 투명하게 만들어집니다.

초록

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면역 표지에 의한 조직 및 기관의 감염 과정의 시각화는 현대 감염 생물학의 핵심 방법입니다. 장기 조직의 내부 병원체의 분포, 트로피즘 및 풍부를 관찰하고 연구하는 능력은 질병 발달과 진행에 대한 중추적 인 데이터를 제공합니다. 기존의 현미경 검사법을 사용하여, 면역 표지는 주로 파라핀 임베디드 또는 냉동 샘플에서 얻은 얇은 단면으로 제한됩니다. 그러나, 이 얇은 단면도의 한정된 2D 심상 평면은 감염한 기관의 복잡한 구조 및 감염의 세포 문맥에 중요한 정보의 손실로 이끌어 낼 수 있습니다. 현대다색, 면역염색 호환 조직 청산 기술은 이제 바이러스에 감염된 장기 조직의 대용량 3D 이미지 스택을 연구하는 비교적 빠르고 저렴한 방법을 제공합니다. 유기 용매에 조직을 노출시킴으로써 광학적으로 투명해집니다. 이는 샘플의 굴절 지수와 일치하며 결국 광 산란이 크게 감소합니다. 따라서, 긴 자유 작동 거리 목표와 함께, 최대 1mm 크기의 큰 조직 섹션은 고해상도에서 기존의 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사법(CLSM)에 의해 이미지화될 수 있습니다. 여기에서, 우리는 바이러스 병인, 퍼짐, 트로피즘 및 신경 침략 같이 주제를 공부하기 위하여 감염된 두뇌에 있는 광견병 바이러스 분포를 구상하기 위하여 조직 정리 후에 심층 조직 화상 진찰을 적용하는 프로토콜을 기술합니다.

서론

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전통적인 조직학 기술은 주로 복잡한 3D 환경에 대한 2D 통찰력만 제공할 수 있는 장기 조직의 얇은 부분에 의존합니다. 원칙적으로 가능하지만, 직렬 얇은 섹션에서 3D 재구성은 획득 한 이미지의 실리코 정렬에슬라이스 및 후속 모두 까다로운 기술 파이프 라인을 필요로1 . 또한, 마이크로토임 슬라이싱 후 z-volumes의 원활한 재구성은 비오버랩 이미지 평면, 염색 변형 및 물리적으로 인한 최적이 아닌 이미지 등록으로 인해 기계적 및 계산 적 아티팩트가 모두 남아 있기 때문에 매우 중요합니다. 예를 들어, 마이크로토메 블레이드에 의해 조직의 파괴. 대조적으로, 그대로 두꺼운 조직 샘플의 순수한 광학 슬라이스는 중첩 이미지 평면 (오버 샘플링)의 수집을 허용하고, 따라서, 3D 재구성을 용이하게한다. 이것은, 차례로, 복잡한 세포 집단에 있는 감염 프로세스의 분석을 위해 높게 유리합니다 (예를 들면, 주변 신경교 및 면역 세포의 맥락에서 신경 세포). 그러나, 두꺼운 조직 단면도의 내재된 장애물은 조직으로 광 산란 및 제한된 항체 침투를 포함합니다. 최근에는이러한문제를 극복하기 위해 다양한 기술이 개발되고 최적화되어 2, 3,4,

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프로토콜

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RABV-감염, PFA 고정 보관 된 뇌 물질을 사용 하 고 있습니다. 각각의 동물 실험 연구는 메클렌부르크 서부 포메라니아(LALFF M-V)의 농업, 식품 안전 및 어업관리국의 책임있는 동물 관리, 사용 및 윤리 위원회에 의해 평가되었으며 허가를 받았습니다. 7221.3-2.1-002/11(마우스) 및 7221.3-1-068/16(페렛). 동물 실험에 사용된 일반적인 관리 및 방법은 승인된 지침에 따라 수행되었다.

주의: 이 프로토콜은 PFA, 메탄올(MeOH), 과산화수소(H2 O2),아지드 나트륨(NaN3),TBA, BA, BB 및 DPE를 포함한 다양한 독성 및/또는 유해 물질을 사용합니다. MeOH 및 TBA는 매우 가연성입니다. 적절한 개인 보호 장비(실험실 코트, 장갑 및 눈 보호)를 착용하고 연기 후드에서 실험을 수행하여 노출을 피하십시오. 폐기물을 적절한 용기에 따로 수거하여 현지 규정에 따라 폐기하십시오. 광견병 바이러스는 생물 안전 성 수준 (BSL)-2 병원 체로 분류 하 고 수 있습니다., 따라서, 일반적으로 BSL-2 조건 하에서 처리 될 수 있습니다. 에어로졸을 생성하거나, 바이러스 농도가 높거나, 새로운 lyssaviruses로 작업할 수 있는 절차를 포....

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결과

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iDISCO14와 uDISCO13의 고해상도 CLSM 조합은 뇌 조직의 RABV 감염과 주변 세포 맥락의 시공간적 분해능과 가소성에 대한 깊은 통찰력을 제공합니다.

RABV 인단백질(P)의 면역염색을 사용하여, 감염된 뉴런 세포의 복잡한 층은 마우스 뇌의 두꺼운단면에서 가시화될 수 있다(그림 3). 이어서, 획득한 이미지 스택의 원활한 3D 프로젝션을 재구성할 수 있다(도3A, B,우측 패널; 애니메이션 그림1). 기관 물자에서 유래한 종에 대하여 1 차적인 항체 및 이차 항체를 사용할 때 주의가 취해져야 합니다. 마우스 뇌 조직에 항 마우스 IgG 항체의 사용은 혈관 시스템의 뚜렷한 염색을 초래했다 (그림

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토론

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최근 몇 년 동안 조직 정리 기술의부활과 추가 개발 2, 3,4,5,6,7,8, 9개 , 10개 , 11세 , 12세 , 13세 , 14는 장기 조.......

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

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저자들은 토마스 C. 메텐라이터와 베레나 테 캄프가 원고를 비판적으로 읽어 준 것에 대해 감사를 표한다. 이 작품은 메클렌부르크 서부 포메라니아의 연방 우수 이니셔티브와 유럽 사회 기금 (ESF) 그랜트 KoInfekt (ESF/ 14-BM-A55-0002/16)와 에서 Lyssaviruses에 대한 교내 공동 연구 보조금에 의해 지원되었다 프리드리히 로플러 연구소 (리-0372).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
<강>시약
벤질 알코올Alfa Aesar41218투명화 시약
벤질벤조에이Sigma-AldrichBB6630-500ML투명화 시약
디메틸 설폭사이드Carl Roth4720.2다양한 완충액
디페닐 에테르Sigma-Aldrich240834-100G클리어링 시약
DL-&알파;-토코페롤Alfa AesarA17039항산화
당나귀 세럼Bio-RadC06SBZ차단 시약
글리신Carl Roth3908.2배경 감소
염소 혈청MerckS26-100ML차단 시약
헤파린 나트륨 염Carl Roth7692.1배경 환원
과산화수소 용액 (30 %)Carl Roth8070.2샘플 표백
메탄올Carl Roth4627.4샘플 전처리
파라 포름 알데히드Carl Roth0335.3고정 용액을 만들기위한 결정질 분말
지드 나트륨Carl RothK305.1원액
의 미생물 성장 방지tert-ButanolAlfa Aesar33278조직 세정을 위한 시료 탈수
TO-PRO-3Thermo FisherT3605핵산 염색
Triton X-100Carl Roth3051.2세제
트윈 20AppliChemA4974,0500세제
<강력한>기타
5 mL 반응 튜브Eppendorf0030119401Sample tubes
Coverslip, 원형 (직경: 22 mm)Marienfeld0111620이미징 챔버의 일부
Coverslip, 원형 (직경: 30 mm)Marienfeld0111700이미징 챔버 부분
피하 주사 바늘 (27 G x ¾ ” [0.40mm x 20mm])B. Braun4657705이미징 챔버
RTV-1 실리콘 고무챔버 조립용
Ultimaker CPE 2.85mm 투명Ultimaker8718836374869코폴리에스터 필라멘트 이미징 챔버 부품 인쇄를 위한 3D 프린터용 Ultimaker 코폴리에스터 필라멘트
<강력>기술 장비 및 소프트웨어
3D 프린터UltimakerUltimaker 2+이미징 챔버 인쇄
자동 침수 시스템Leica15640019소프트웨어 제어 워터 펌프
벤치탑 오비탈 쉐이커ElmiDOS-20M실온(~ 150rpm)에서 샘플 배양벤치
탑 오비탈 쉐이커, 가열New Brunswick ScientificG24 37 °에서 환경 셰이커샘플 배양; C (~ 150 rpm)
컨포칼 레이저 스캐닝 현미경LeicaDMI 6000 TCS SP5샘플 이미징용 도립 컨포칼 현미경
FijiNIH (ImageJ)오픈 소스 소프트웨어 (v1.52h)ImageJ 기반 이미지 처리 패키지
, 긴 작동 거리 침수 대물렌즈Leica15506360HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2
VibratomeLeicaVT1200S샘플 슬라이싱
워크스테이션DellPrecision 7920CPU: Intel Xeon Gold 5118
GPU: Nvidia Quadro P5000
RAM: 128GB 2666MHz DDR4
SSD: 2TB
Primary antibodies
Goat anti-RABV NFriedrich-Loeffler-Institut바큘로바이러스 발현 및 His-태그 정제 RABV 핵단백질 N
희석: 1:400
토끼 항-GFAPDakoZ0334다클론 항체 (RRID:AB_10013382)
희석: 1:100
토끼 항-MAP2Abcamab32454다클론 항체 (RRID:AB_776174)
희석: 1:250
토끼 항-RABV P 160-5Friedrich-Loeffler-Institut바큘로바이러스 발현 및 His-태그 정제 RABV 인단백질 P를 사용한 토끼 면역에 의해 생성된 단일특이성 다클론 토끼 항-RABV P 혈청(참고 문헌 23: Orbanz et al., 2010 참조)
희석: 1:1,000
Secondary antibodies
Donkey anti-goat IgGThermo Fisher Scientificconjugated에 따라 형광단높은 교차 흡수
희석: 1:500
당나귀 안티 마우스 IgGThermo Fisher Scientific공액 형광단에 따라높은 교차 흡수
희석: 1:500
당나귀 안티 토끼 IgGThermo Fisher Scientific공액 형광단에 따라교차 흡수
희석: 1:500
염소 안티 마우스 IgG ThermoFisher 공액 형광단에 따른높은 교차 흡수
희석: 1:500
염소 안티 토끼 IgGThermo Fisher Scientific은 공액 형광단에 따라교차 흡수
희석: 1:500
트 아로 이미징 챔버 채우기 이미징 높은 과학적 높은

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pichat, J., Iglesias, J. E., Yousry, T., Ourselin, S., Modat, M. A Survey of Methods for 3D Histology Reconstruction. Medical Image Analysis. 46, 73-105 (2018).
  2. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497

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