용매 정리 된 장기의 궁극적 인 3D 이미징과 같은 새로운 면역 염색 호환 조직 지우기 기술은 광견병 바이러스 뇌 감염및 복잡한 세포 환경의 3D 시각화를 허용합니다. 두꺼운 항체 표지 된 뇌 조직 조각은 이미징 깊이를 높이고 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 3D 분석을 가능하게하기 위해 광학적으로 투명하게 만들어집니다.
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이 논문에서
요약
초록
면역 표지에 의한 조직 및 기관의 감염 과정의 시각화는 현대 감염 생물학의 핵심 방법입니다. 장기 조직의 내부 병원체의 분포, 트로피즘 및 풍부를 관찰하고 연구하는 능력은 질병 발달과 진행에 대한 중추적 인 데이터를 제공합니다. 기존의 현미경 검사법을 사용하여, 면역 표지는 주로 파라핀 임베디드 또는 냉동 샘플에서 얻은 얇은 단면으로 제한됩니다. 그러나, 이 얇은 단면도의 한정된 2D 심상 평면은 감염한 기관의 복잡한 구조 및 감염의 세포 문맥에 중요한 정보의 손실로 이끌어 낼 수 있습니다. 현대다색, 면역염색 호환 조직 청산 기술은 이제 바이러스에 감염된 장기 조직의 대용량 3D 이미지 스택을 연구하는 비교적 빠르고 저렴한 방법을 제공합니다. 유기 용매에 조직을 노출시킴으로써 광학적으로 투명해집니다. 이는 샘플의 굴절 지수와 일치하며 결국 광 산란이 크게 감소합니다. 따라서, 긴 자유 작동 거리 목표와 함께, 최대 1mm 크기의 큰 조직 섹션은 고해상도에서 기존의 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사법(CLSM)에 의해 이미지화될 수 있습니다. 여기에서, 우리는 바이러스 병인, 퍼짐, 트로피즘 및 신경 침략 같이 주제를 공부하기 위하여 감염된 두뇌에 있는 광견병 바이러스 분포를 구상하기 위하여 조직 정리 후에 심층 조직 화상 진찰을 적용하는 프로토콜을 기술합니다.
서론
전통적인 조직학 기술은 주로 복잡한 3D 환경에 대한 2D 통찰력만 제공할 수 있는 장기 조직의 얇은 부분에 의존합니다. 원칙적으로 가능하지만, 직렬 얇은 섹션에서 3D 재구성은 획득 한 이미지의 실리코 정렬에슬라이스 및 후속 모두 까다로운 기술 파이프 라인을 필요로1 . 또한, 마이크로토임 슬라이싱 후 z-volumes의 원활한 재구성은 비오버랩 이미지 평면, 염색 변형 및 물리적으로 인한 최적이 아닌 이미지 등록으로 인해 기계적 및 계산 적 아티팩트가 모두 남아 있기 때문에 매우 중요합니다. 예를 들어, 마이크로토메 블레이드에 의해 조직의 파괴. 대조적으로, 그대로 두꺼운 조직 샘플의 순수한 광학 슬라이스는 중첩 이미지 평면 (오버 샘플링)의 수집을 허용하고, 따라서, 3D 재구성을 용이하게한다. 이것은, 차례로, 복잡한 세포 집단에 있는 감염 프로세스의 분석을 위해 높게 유리합니다 (예를 들면, 주변 신경교 및 면역 세포의 맥락에서 신경 세포). 그러나, 두꺼운 조직 단면도의 내재된 장애물은 조직으로 광 산란 및 제한된 항체 침투를 포함합니다. 최근에는이러한문제를 극복하기 위해 다양한 기술이 개발되고 최적화되어 2, 3,4,
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프로토콜
RABV-감염, PFA 고정 보관 된 뇌 물질을 사용 하 고 있습니다. 각각의 동물 실험 연구는 메클렌부르크 서부 포메라니아(LALFF M-V)의 농업, 식품 안전 및 어업관리국의 책임있는 동물 관리, 사용 및 윤리 위원회에 의해 평가되었으며 허가를 받았습니다. 7221.3-2.1-002/11(마우스) 및 7221.3-1-068/16(페렛). 동물 실험에 사용된 일반적인 관리 및 방법은 승인된 지침에 따라 수행되었다.
주의: 이 프로토콜은 PFA, 메탄올(MeOH), 과산화수소(H2 O2),아지드 나트륨(NaN3),TBA, BA, BB 및 DPE를 포함한 다양한 독성 및/또는 유해 물질을 사용합니다. MeOH 및 TBA는 매우 가연성입니다. 적절한 개인 보호 장비(실험실 코트, 장갑 및 눈 보호)를 착용하고 연기 후드에서 실험을 수행하여 노출을 피하십시오. 폐기물을 적절한 용기에 따로 수거하여 현지 규정에 따라 폐기하십시오. 광견병 바이러스는 생물 안전 성 수준 (BSL)-2 병원 체로 분류 하 고 수 있습니다., 따라서, 일반적으로 BSL-2 조건 하에서 처리 될 수 있습니다. 에어로졸을 생성하거나, 바이러스 농도가 높거나, 새로운 lyssaviruses로 작업할 수 있는 절차를 포....
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결과
iDISCO14와 uDISCO13의 고해상도 CLSM 조합은 뇌 조직의 RABV 감염과 주변 세포 맥락의 시공간적 분해능과 가소성에 대한 깊은 통찰력을 제공합니다.
RABV 인단백질(P)의 면역염색을 사용하여, 감염된 뉴런 세포의 복잡한 층은 마우스 뇌의 두꺼운단면에서 가시화될 수 있다(그림 3). 이어서, 획득한 이미지 스택의 원활한 3D 프로젝션을 재구성할 수 있다(도3A, B,우측 패널; 애니메이션 그림1). 기관 물자에서 유래한 종에 대하여 1 차적인 항체 및 이차 항체를 사용할 때 주의가 취해져야 합니다. 마우스 뇌 조직에 항 마우스 IgG 항체의 사용은 혈관 시스템의 뚜렷한 염색을 초래했다 (그림
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토론
최근 몇 년 동안 조직 정리 기술의부활과 추가 개발 2, 3,4,5,6,7,8, 9개 , 10개 , 11세 , 12세 , 13세 , 14는 장기 조.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
저자들은 토마스 C. 메텐라이터와 베레나 테 캄프가 원고를 비판적으로 읽어 준 것에 대해 감사를 표한다. 이 작품은 메클렌부르크 서부 포메라니아의 연방 우수 이니셔티브와 유럽 사회 기금 (ESF) 그랜트 KoInfekt (ESF/ 14-BM-A55-0002/16)와 에서 Lyssaviruses에 대한 교내 공동 연구 보조금에 의해 지원되었다 프리드리히 로플러 연구소 (리-0372).
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재료
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| 디메틸 설폭사이드 | Carl Roth | 4720.2 | 다양한 완충액 |
| 디페닐 에테르 | Sigma-Aldrich | 240834-100G | 클리어링 시약 |
| DL-&알파;-토코페롤 | Alfa Aesar | A17039 | 항산화 |
| 당나귀 세럼 | Bio-Rad | C06SBZ | 차단 시약 |
| 글리신 | Carl Roth | 3908.2 | 배경 감소 |
| 염소 혈청 | Merck | S26-100ML | 차단 시약 |
| 헤파린 나트륨 염 | Carl Roth | 7692.1 | 배경 환원 |
| 과산화수소 용액 (30 %) | Carl Roth | 8070.2 | 샘플 표백 |
| 메탄올 | Carl Roth | 4627.4 | 샘플 전처리 |
| 파라 포름 알데히드 | Carl Roth | 0335.3 | 고정 용액을 만들기위한 결정질 분말 |
| 지드 나트륨 | Carl Roth | K305.1 | 원액 |
| 의 미생물 성장 방지tert-Butanol | Alfa Aesar | 33278 | 조직 세정을 위한 시료 탈수 |
| TO-PRO-3 | Thermo Fisher | T3605 | 핵산 염색 |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.2 | 세제 |
| 트윈 20 | AppliChem | A4974,0500 | 세제 |
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| 당나귀 안티 마우스 IgG | Thermo Fisher Scientific | 공액 형광단에 따라 | 높은 교차 흡수 희석: 1:500 |
| 당나귀 안티 토끼 IgG | Thermo Fisher Scientific | 공액 형광단에 따라 | 교차 흡수 희석: 1:500 |
| 염소 안티 마우스 IgG Thermo | Fisher | 공액 형광단에 따른 | 높은 교차 흡수 희석: 1:500 |
| 염소 안티 토끼 IgG | Thermo Fisher Scientific | 은 공액 형광단에 따라 | 교차 흡수 희석: 1:500 |
참고문헌
- Pichat, J., Iglesias, J. E., Yousry, T., Ourselin, S., Modat, M. A Survey of Methods for 3D Histology Reconstruction. Medical Image Analysis. 46, 73-105 (2018).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497
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