쥐에서 외상성 뇌 손상 후 Caecum Microbiota에서 변경 을 조사

요약

여기에 제시된 프로토콜은 직감 미생물군유전체 분석을 위한 케이쿰 함량의 수집에 이어 측면 유체 타악기 장치를 사용하여 확산 외상성 뇌 손상을 유도하는 프로토콜이다.

초록

증가하는 기록은 microbiota 창자 두뇌 축이 뇌 질환의 병인에 있는 중요한 역할을 한다는 것을 보여줍니다. 여러 연구는 또한 외상성 뇌 손상 창 자 microbiota에 변화를 일으킬 보여줍니다. 그러나, 두뇌 창 자 축의 양방향 조절 기본 메커니즘 알 수 없는 남아. 현재, 몇몇 모형은 외상성 두뇌 상해 후에 창자 microbiota에 있는 변경을 공부를 위해 존재합니다. 따라서, 제시된 연구 결과는 직감 microbiome에 있는 변경을 조사하기 위한 상해 다음 의 외액 타악기 장치 및 caecum 견본의 분석을 사용하여 외상성 뇌 손상을 유도하기 위한 프로토콜을 결합합니다. 외상성 뇌 손상 후 창 자 microbiota 조성물의 변경 16S-rDNA 시퀀싱을 사용 하 여 결정 됩니다. 이 프로토콜은 장내 미생물과 외상성 뇌 손상 사이의 관계를 연구하기위한 효과적인 방법을 제공합니다.

서론

외상성 뇌 손상 (TBI)은 글로벌 공중 보건 문제이며 젊은 성인의 사망과 장애의 주요 원인^1,2. TBI는 매년 많은 죽음을 일으키고, 생존자는 신체적, 정신적, 정서적, 인지 적 장애의 다양한 경험. 따라서 TBI는 환자의 가족 및 사회 자원에 무거운 부담입니다. TBI는 외상의 시간에 발생하는 기본 뇌 손상과 초기 부상 다음 달에 시간을 개발하는 보조 뇌 손상을 모두 포함한다. 이차 뇌 손상은 여러 생화학 적 캐스케이드에 의해 매개되며, 이는 뇌에 해로울뿐만 아니라 위장 시스템을 포함한 다양한 장기 시스템에 상당한 부정적인 영향을 미칩니다^3.

현재 동물 실험에서 TBI를 유도하는 세 가지 모델이 있습니다: 유체 타악기 손상, 대조피질 충격(CCI), 체중 감소 가속. 측면 유체 타악기 손상 (LFPI)은 확산 뇌 손상 (DAI)를 확립하기 위해 가장 일반적으로 사용되는^모델4. 이 장치는 손상되지 않은 경도에 짧은 유체 압력 펄스를 적용하여 두개골 절제술을 통해 뇌 손상을 일으킵니다. 이 펄스는 진자의 파업에 의해 생성됩니다. LFPI는 TBI 연구를 위한 재현 가능하고 제어 가능한 모델링 방법입니다.

미생물군유전체는 인체에 있는 모든 미생물의 집단 게놈으로 정의됩니다. 특히 장내 미생물은 장 항상성 및 기능에 중요한 역할을 할뿐만 아니라 숙주 생리학및 다른 장기의 기능의 많은 측면을 조절합니다^5. 최근 몇 년 동안, 창 자 microbiota 뇌-창 자 축을 통해 뇌 개발 및 기능을 조절 하는 것을 나타내는 증가 증거가 있다⁶. 창 자 microbiota의 중단 파 킨 슨 병을 포함 하 여 여러 뇌 기능 장애에 연결 되었습니다., 기분 장애, 그리고 자폐증⁷. 최근, 전임상 연구는 또한 급성 뇌 손상이 장내 미생물의 변화를 유도할 수 있다고^보고8,9.

Treangen^{외. 10} 에 의해 연구 발견 3 미생물 종에서 상당한 감소를 발견 하 고 CCI 유도 된 TBI 후 두 개의 미생물 종에서 증가. 이 증거는 창 자 microbiota의 변조 TBI 관리에 치료 방법 수 있습니다 나타냅니다. 그러나, 뇌 손상 유도 창 자 microbiota 변경 기본 메커니즘 알 수 없는 남아. 이러한 이유로, TBI 가 필요한 후 창 자 microbiota에 변화를 공부의 상대적으로 간단 하 고 효율적인 모델. 따라서, 본 연구는 마우스에서 TBI 후 창 자 microbiota에 변화를 검사 하는 프로토콜을 제시 한다.

프로토콜

수행 된 모든 절차는 절강 대학의 실험 동물 윤리위원회에 의해 승인되었다. 수술에 사용되는 모든 기기와 재료는 멸균됩니다. TBI 프로세드에는 약 20분이 소요됩니다.

1. 동물 관리

1. 이 실험에서 5-6주 령 남성 C57BL/6J 마우스(체중 20-25 g)를 사용하십시오.
2. 12 h/12 h의 빛/어두운 주기에 마우스를 유지 하 고 그들은 음식과 물 광고 리비툼을 받을 수 있는지 확인. 연구 기간 내내 샴과 TBI 그룹 모두에게 동일한 양의 음식과 물을 제공합니다.
3. 동물의 고통과 불편함을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울인다.

2. 외상성 뇌 손상의 유도

1. 마취를 위해 케타민 (80-100 mg/kg)/자일라진(10 mg/kg) IP를 주입하십시오. 눈 반사 또는 통증 반사를 사용하여 마취의 깊이를 테스트합니다. 인공 눈물이나 윤활유 눈 연고를 사용하여 눈이 마르지 않도록 하십시오.
2. 마취 후, 마우스를 경향이있는 위치에 놓습니다. 온도 조절 식 가열 패드를 사용하여 수술 중 37 °C에서 온도를 유지하고 TBI 후 30 분 동안 유지하십시오.
3. 절개 부위의 모발을 면도합니다.
4. 세 번의 교대 스크럽을 사용하여 70 % 에탄올로 두피를 소독 한 다음 시상 면에서 두피를 절개하십시오.
5. 집게를 사용하여 양쪽절개를 철회하고 섬막을 약간 분리합니다.
6. 마커를 사용하여 중간선에서 2mm 떨어진 두개골의 오른쪽 정수리 영역에 원(직경 3mm)을 그립니다.
7. 전기 드릴로 두개골을 드릴. 이 단계가 손상되지 않도록 조심스럽게 작동해야 합니다.
8. 뼈 플랩을 제거하고 작은 뼈 창 (직경 3mm)을 노출합니다.
9. 플라스틱 손상 캐뉼라 (내부 직경 = 2.5 mm, 길이 = 8mm)를 개두술 위에 놓고 치과 아크릴을 사용하여 두개골에 캐뉼러를 시멘트하십시오.
10. 캐뉼라에 거품이 없는지 확인하기 위해 주사기(5mL)를 사용하여 멸균 0.9% NaCl(일반 식염수)으로 캐뉼라를 채웁니다.
11. 오실로스코프와 앰프를 켜고 측면 유체 타악기 손상(LFPI) 장치의 고압 튜브에 기포가 없는지 확인합니다. 일정한 신호가 공급될 때까지 약 10펄스를 전달하여 장치를 테스트합니다. 진자 시작 위치의 각도를 조정하여 약 2.0 atm의 펄스 강도에 도달합니다.
12. 부상 캐뉼라를 LFPI 장치에 연결합니다. 방아쇠를 당기고 진자 방출을 통해 뇌 손상을 유발합니다. 그런 다음, 펄스를 얻어 전체 폐쇄 된 유체 충전 튜브 시스템을 통해 듀라로 전송합니다.
13. 동일한 외과 적 시술로 가짜 그룹에서 마우스를 수술하십시오. LFPI를 수행하지 마십시오.

3. 수술 후 치료

1. 뇌 손상을 유발 한 후 플라스틱 캐뉼라를 제거하고 절개를 봉합하십시오. 수술 중 buprenorphine 관리 (2mg/kg) SQ 또는 IP 그리고 그 후 모든 6-12 3 일 동안 시간.
2. 가열 패드에 마우스를 놓고 외래가 될 때까지 놓습니다. 가열 패드의 온도를 37 °C로 설정하여 마취 소생술을 가속화합니다.
3. 케이지에 마우스를 다시 넣고 음식과 물 광고 리비텀을관리합니다.

4. 개복술 및 샘플 수집

1. 마우스를_CO2로 안락사시키고 그 다음에 해당 시점에서 자궁 경부 탈구를 한다.
   참고: 본 실험에서, 선택한 시점은 1시간, 6시간, 1d, 3d, 7d의 외상 후 뇌 손상으로 장내 미생물의 역동적인 진화를 분석하였다.
2. 복부 표면에서 머리카락을 제거하십시오. 70 % 에탄올로 복부를 소독하십시오.
3. 마우스 위에 멸균 드레이프를 놓습니다. 남성 마우스의 prepuce 바로 위에, 하복부 중간선에서 절개를합니다.
4. 창장이 노출 되면 소실을 찾아 다른 장관에서 부드럽게 분리하십시오. 이빨이나 날카로운 집게로 묘지를 잡지 마십시오. 세레이션이 있는 Adson 집게와 같은 외상성 집게를 사용합니다.
5. 날카로운 가위로 케이컴을 잘라냅니다.
6. 멸균 드레싱에 수동으로 케이컴 내용물을 추출하고 1.5 mL 미세 원심 분리튜브에 내용물을 보관하십시오.
7. 미생물군유전체 분석전까지 캐컴 함량을 -80°C에 보관합니다.

5. DNA 추출 및 16S-rDNA 시퀀싱 및 데이터 분석

1. 대변에서 DNA의 격리
   참고: 시판되는 DNA 절연키트(물자 표)를이 실험에 사용하였다.
   1. 메스를 사용하여 2 mL 미세 원심 분리튜브에 300 mg의 대변을 긁어 얼음에 튜브를 놓습니다.
   2. 각 샘플에 1 mL의 억제 버퍼를 추가합니다. 소용돌이는 1 분 동안 또는 대변 샘플이 철저히 균질화 될 때까지 계속합니다.
   3. 배설물 입자를 펠렛하기 위해 1 분 동안 최대 속도로 샘플을 원심 분리합니다.
   4. 피펫 2 μL의 단백질나제 K를 새로운 2 mL 마이크로원지지 튜브에 넣습니다. 피펫 600 μL단계 5.1.3으로부터 단백질나아제 K를 함유하는 2 mL 마이크로원지튜브로 한다. 그런 다음 버퍼 1의 600 μL과 15 s의 와류를 추가합니다.
   5. 샘플을 70°C에서 10분 동안 배양합니다.
   6. 600 μL의 100% 에탄올을 리세이트(1:1 비율)에 넣고 와류로 섞습니다. 튜브 뚜껑 안쪽에서 방울을 제거하기 위해 최대 속도로 잠시 원심 분리기.
   7. 600 μL의 리세이트를 스핀 컬럼에 적용합니다. 원심분리기는 최대 속도로 1분 간 사용하십시오. 이 단계를 한 번 더 반복합니다. 그런 다음 컬럼을 새로운 2mL 수집 튜브로 옮김을 전송합니다.
   8. 스핀 컬럼을 열고 버퍼 2의 500 μL을 추가합니다. 원심분리기는 최대 1분 동안 열을 제거하고 새로운 2mL 수집 튜브에 놓습니다.
   9. 버퍼 3의 500 μL을 열에 추가합니다. 최대 속도3분으로 원심분리기를 사용해 흐름을 폐기합니다. 버퍼 3이 완전히 용출되었는지 확인하기 위해 원심 분리 과정을 한 번 반복합니다.
   10. 스핀 컬럼을 새로운 튜브 2 mL 수집 튜브에 넣고 버퍼 4의 피펫 200 μL을 멤브레인에 직접 놓습니다. 실온 (RT)에서 1 분 동안 배양 한 다음 DNA를 용해시키기 위해 최대 속도로 원심 분리기를 1 분 동안 배양하십시오.
2. 16S-rDNA 시퀀싱 및 데이터 분석
   1. 20-30 ng의 DNA를 사용하여 앰플리곤을 생성하십시오.
   2. 박테리아 16S rDNA의 V3 및 V4 초가변 영역과 접한 비교적 보존된 영역을 위해 설계된 시판되는 프라이머를 사용한다. 서열을 포함하는 순방향 프라이머 "CCTACGRBGCGCASCAKVVGAAT" 및 서열을 포함하는 역프라이머 "GGACTACNVGGGTWCtTCTAATCC"를 본 연구에서 사용하였다.
   3. 완충액 1, dNTP 2 μL, 각 프라이머의 1 μL, 0.5 μL의 DNA 폴리머라제 및 20 ng의 템플릿 DNA를 튜브에 추가하여 PCR 반응 혼합물을 만듭니다. ddH₂O를 사용하여 반응 시스템을 25 μL로 조정합니다.
   4. 다음과 같이 PCR 반응 파라미터를 설정합니다: 3분 동안 94°C에서 사전 변성 수행. 5초동안 94°C에서 변성, 90초동안 57°C에서 어닐을 수행하고, 10초동안 72°C에서 연장하고, 이 것을 24배 반복합니다.
   5. 제조업체의 지침에 따라 PE250/300 페어링 엔드 시퀀싱을 수행하고 16S rRNA 데이터 분석을 위해 QIIME 데이터 분석 패키지를 사용합니다.
      참고: 이 실험에서 DNA 시퀀싱 및 데이터 분석은 주로 전문 시퀀싱 회사에 의해 수행되었습니다.

결과

TBI의 설립은 그림 1에나와 있습니다. 마취 및 소독 후, 두피를 상각시켰다(도 1A). 개두량(직경 3 mm)을 전동 드릴로 오른쪽 정수리 피질 위에 두개골 내로 트레핀하고, 두라를 그대로 유지하였다(도1B,C). 플라스틱 부상 캐뉼라를 뼈 창 위에 놓고 치과 아크릴을 사용하여 두개골에 시멘트(그림 1D).

측면 유체 타악기의 절차는 도 2에도시되어 있습니다. 장치를 시작하기 전에 꾸준한 신호를 줄 때까지 약 10 펄스를 전달하여 테스트했습니다. 진자의 각도는 약 2...

토론

여기에 제시된 것은 마우스에서 TBI 후에 세칼 미생물의 변화를 결정하는 간단하고 효율적인 프로토콜이다. 뇌 손상의 유도 및 caecum 내용 샘플의 수집은 프로토콜의 중요한 부분입니다.

연구원이 TBI를 따르는 창자 microbiota의 변경을 공부한 에도 불구하고, 이 연구 결과에 사용된 두뇌 상해는 CCI-8 및 무게 투하/충격 유도한 모형^{9이었습니다.} 그러나, CCI 모형은 주로 두뇌 타박상을 복제하고, 무게 투하 모형은 약간 부정확성 때문에 손해를 입을 수 있습니다. 기존의 모든 뇌 손상 모델 중에서, LFPI는 가장 일반적으로 사용되는 모델이며, 이는 초점 및 확산 뇌 손상^11,12를 포함하고 임상 TBI 환자에서 관찰된 많은 중요한 특징을 복제한다. 프로세스 전반에 걸친 주요 단...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DNA 분리 키트	QIAGEN	51604	대변 샘플에서 게놈 DNA의 빠른 정제
를 위해 유전자 분석 서비스	GENEWIZ		유전자 분석 서비스
가열 패드	Shanghai SAFE Biotech Co.	TR-200	가열 패드
인젝터	Zhejiang University		인젝터
LFPI 장치	Virginia Commonwealth University	FP302	LFPI 장치
마이크로 두개골 드릴	RWD 생명 과학	78061	마이크로 두개골 드릴
포비돈 요오드	과 대학 최초의 제휴 병원, Zhejiang University		포비돈 요오드