Murine Oocytes에 계량 및 방화 mRNAs 단일 분자 형광에서 제자리 교 잡 (SM-물고기)의 사용

요약

Reproducibly 개별 oocytes, 단일 분자 RNA 형광 제자리에서 mRNAs의 숫자를 카운트를 교 잡 (RNA-물고기) 비 부착 한 세포에 대 한 최적화 되었다. Oocytes 수집 했다, 대 본 특정 프로브 때 교배 하 고 이미지 정량화 소프트웨어를 사용 하 여 계량.

초록

정기적으로 oocytes에서 배아 mRNA를 측정 하는 데 사용 하는 현재 방법 디지털 역 전사 연쇄 반응 (dPCR), 양적, 실시간 RT-PCR (RT-정량) 및 RNA 시퀀싱 포함 됩니다. 이러한 기술은 단일 oocyte 또는 배아를 사용 하 여 수행 됩니다, 낮은 복사 mRNAs 안정적으로 검색 되지 않습니다. 이 문제를 해결 하려면 oocytes 또는 배아 수 수 풀링된 함께 분석; 그러나,이 종종 샘플 중 높은 가변성에 이어집니다. 이 프로토콜에서 우리 형광 제자리 교 잡 (물고기) 분기 DNA 화학을 사용 하 여의 사용을 설명 합니다. 이 기술은 개별 셀에서 mRNAs의 공간적 패턴을 식별합니다. 기술은 자리 찾아서 추적 컴퓨터 소프트웨어와 결합 되어 때 셀에서 mRNAs의 풍부도 측정할 수 수 있습니다. 이 기술을 사용 하 여, 실험적인 그룹에서 감소 변화 이며 적은 oocytes 및 배아 실험 그룹 간의 중요 한 차이 검출 해야. 상업적으로 사용 가능한 분기 DNA SM-물고기 키트 sectioned 조직 또는 슬라이드에 부착 세포 mRNAs를 검색에 최적화 되었습니다. 그러나, oocytes 효과적으로 슬라이드에 고착 하지 않는다 고 일부 시 약 키트에 oocyte 세포의 결과로 너무 가혹 했다. 이 세포의 용이 해를 방지 하기 위해, 물고기 키트 여러 수정 되었다. 특히, oocyte permeabilization 및 워시 버퍼를 oocytes와 태아의 면역 형광을 위한 독점 버퍼를 교체 했습니다. Permeabilization, 세척, 그리고 프로브와 앰프 외피 6 잘 플레이트에서 수행한 고 oocytes 슬라이드 설치 미디어를 사용 하 여 프로토콜의 끝에 배치 했다. 이러한 수정 상용 키트, 특히, oocyte 세포의 한계를 극복할 수 있었다. 정확 하 게 그리고 reproducibly 개별 oocytes에서 mRNAs의 수를 계산, 컴퓨터 소프트웨어 사용 되었다. 함께,이 프로토콜 PCR 및 시퀀싱을 비교할 단일 셀에 특정 성적 표현 하는 대안을 나타냅니다.

서론

역전사 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) mRNA 정량에 대 한 황금 표준 되었습니다. 2 분석 실험, 디지털 PCR (dPCR)¹ 과 양적, 리얼 타임 PCR (정량)² 현재 사용 됩니다. 두 개의 PCR 기법, dPCR 그것은 단일 세포에서 mRNA 풍부를 측정 하는 데 사용할 수 제안 하는 정량 보다 더 큰 감도 있다. 그러나, 우리 손에 각 실험 샘플 당 5 ~ 10 oocytes의 수영장에서 낮은 풍부 mRNAs의 dPCR 분석은 생산 데이터 낮은 재현성 및 높은 변화³. 이 RNA 추출 및 반전 녹음 방송 효율성과 관련 된 실험적인 오류로 인해 높습니다. RNA 시퀀싱도 하나의 마우스와 인간의 oocytes^4,5를 사용 하 여 수행 되었습니다. 이 기술은 가능성이 실험적인 그룹 내의 다양성을 증가 하는 라이브러리 생성에 필요한 cDNA 증폭 단계를 해야 합니다. 또한, 낮은 풍부 성적표 감지 하지 않을 수 있습니다. 시퀀싱 가격은 지난 몇 년 동안 추락, 비록 그것은 여전히 비용 생물 정보학 분석의 높은 비용 때문에 금지 수 있습니다. 마지막으로, m....

프로토콜

동물 절차 검토 하 고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 네브래스카 링컨의 대학에 의해 승인 했다 그리고 모든 방법을 관련 지침 및 규정에 따라 수행 했다. 이 연구에 대 한 CD-1 outbred 쥐 정상적 설치류 차 우와 물; ad libitum 접근 했다 그들은 어두운 12시 12분에 유지 되었다: 빛을 주기.

1입니다. 필요한 미디어의 준비

1. 기본 미디어 (OMM), 살 균 물 100 mL를 100 mM NaCl, KCl 5mm, 0.5 m m KH₂포₄및 1.7 m m CaCl₂-2 H₂O를 추가 합니다.
   참고: OMM 매체는 1 개월까지 저장할 수 있습니다.
2. 완전 한 미디어 (OMOPS)에 대 한 추가 20 m m 3-morpholinopropane-1-sulfonic 산 (MOPS), 1.2 m m MgSO₄-7 H₂O, 포도 당 0.5 m m, 6mm L-젖 산, 1mm ala-gln, 황소자리, 0.1 m m 1 x 비 본질적인 아미노산 (NEAA), 0.01 m m ethylenediaminetetraacetic 산 ( EDTA), 10 µ M 알파 리 포 산, 10 µ ....

결과

프로토콜 완료 되 면 결과 (그림 4A , 그림 5), 맞춘된 이미지 (그림 4C), confocal z 시리즈에서 개별 이미지를 있을 것입니다 그리고 mRNA 계산 (그림 4B). 다중화를 수행 하는 경우 또한 병합 된 이미지를 보여주는 두 개의 다른 mRNAs (그림 5)에 대 한 레이블이 있을 것입니다. MRNA 카운트 피지 (그림 3) 에 의해 생성 된 스티치 이미지와 자리 찾기 및 추적 프로그램 .......

토론

일련의 작은 단계 프로토콜 동안 mRNAs의 성공적인 형광 및 정확한 보장 합니다. 첫째, 프로토콜 수집과 oocytes의 고정 후에 즉시 수행 되어야 합니다. Note PVP oocytes 서로에 집착 하지 않도록 4 %paraformaldehyde 고정 버퍼에 추가 됩니다. 우리 컬렉션은 oocytes의 고정 후 즉시 실험을 수행 하는 데 필요한 발견. 어떤 지연 결과 훨씬 낮은 형광 신호를 녹취 록의 undercounting 귀 착될 것입니다. 이것은 때문에 RNA 저하 부분 이다. 더 이상 20 oocytes 6 잘 플레이트 한 우물을 한 번에 전송 해야 하 고 각 잘만 사용 해야 한 번. 부 화 시간 단축 또는 각 단계의 길이 없이 정확 하 게 따라 합니다 또한. 예외는 워시 버퍼 단계; oocytes 워시 버퍼에 장기간된 시간에 대 한 실험 결과 변경 하지 않고 남아 있을 수 있습니다. SM-물고기 프로브 C1, C2, 및 C3 3 형광 채널에서 사용할 수 있습니다. 다중화, 동일한 채널 태그가 프로브를 혼합 하지 마.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
(&플러스mn;)-&-α-Lipoic acid	Sigma-Aldrich	T1395	Alpha Lipoic Acid
Albumin, Bovine Serum, Low Fatty Acid	MP Biomedicals, LLC	199899	FAF BSA
BD 10mL TB 주사기	Becton, Dickinson and Company	309659	10 mL 주사기
BD PrecisionGlide Needle	Becton, Dickinson and Company	305109	27 1/2 게이지 바늘
염화칼슘 이수화물	시그마-알드리치	C7902	CaCl2-2H2O
구연산	시그마-알드리치	C2404	구연산
D-(+)-포도	시그마-알드리치	G6152	포도
인산			Na2HPO4
쉬운 그립 페트리 접시	팔콘 코닝	351008	35mm 접시
에데테이트 디소듐	아반토르	8994-01	EDTA
엑스트라 파인 본 가위	파인 사이언스 도구	14084-08	스트레이트, 샤프/샤프, 톱니 모양이 아닌 13mm 커팅 엣지 가위
태아 소 혈청	애틀랜타 생물학 제제	S10250	FBS
겐타마이신 시약 용액	gibco	15710-064	겐타마이신
GlutaMAX-I (100X)	gibco	35050-061	글루타맥스
골드 씰 마이크로 슬라이드	골드 씰	3039	25 x 75mm 슬라이드
성선 자극 호르몬, 임산부 암말 세럼	시그마	G4877	eCG
hCG 재조합	NHPP	AFP8456A	hCG
히알루로니다아제, 유형 IV-S: 소 고환에서	시그마-알드리치	H3884	히알루로니다제
보석 세공 스타일 집게	Integra	17-305X	집게 4-3/8", 스타일 5F, 스트레이트, 마이크로 파인 턱
L-(+)-젖산, 유리 산	MP Biomedicals, LLC	190228	L-Lactate
마그네슘 황산염 헵타하이드레이트	Sigma-Aldrich	M2773	MgSO4-7H2O
MEM 비필수 아미노산	Corning	25-025-Cl	NEAA
현미경 커버 유리	Fisher Scientific	12-542-C	25 x 25x 0.15 mm 커버 슬립
Mm-Nanog-O2-C2 RNAscope 프로브	고급 셀 진단	501891-C2	나노 프로브
Mm-Pou5F1-O1-C3 RNAscope 프로브	고급 셀 진단	501611-C3	Pou5F1 프로브
MOPS	시그마-알드리치	M3183
파라포름알데히드	시그마-알드리치	P6148	파라포름알데히드
PES 0.22 um 멤브레인 -sterile	Millex-GP	SLGP033RS	0.22 um 필터
폴리비닐피롤리	돈 시그마-알드리치	P0930	PVP
염화칼	시그마-알드리치	60128	KCl
인산칼륨 일염기	성 시그마-알드리치	60218	KH2PO4
Prolong Gold 안티페이드 시약	invitrogen	P36934	안티페이드 시약 DAPI
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RNAscope FL AMP 1	Advanced Cell Diagnostics	320852	Amplifier 1
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RNAscope FL AMP 3	Advanced 세포 진단	320854	증폭기 3
RNAscope FL AMP 4 ALT A	고급 세포 진단	320855	증폭기 4 ALT A
RNAscope FL AMP 4 ALT B	고급 세포 진단	320856	증폭기 4 ALT B
RNAscope FL AMP 4 ALT C	고급 세포 진단	320857	증폭기 4 ALT C
RNAscope 형광 다중 검출 시약 키트	고급 세포 진단	320851	FISH 시약 키트
RNAscope 프로브 3-plex 음성 대조군 프로브	고급 세포 진단	320871	음성 대조
RNAscope 프로브 3-plex 양성 대조군	고급 세포 진단	320881	양성 대조
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RNAscope 프로테아제 III & IV 시약 키트	, 고급 세포 진단	322340	FISH, 프로테아제 키트
RNAscope, 프로테아제 IV	고급 세포 진단	, 322336	프로테아제 IV
S/S 니들, Luer Hub 30G	Component Supply Co.	NE-301PL-50	무딘 30 게이지 바늘
중탄산 나트륨	시그마 - 알드리치	S6297	NaHCO3
염화나트륨	시그마 - 알드리치	S6191	NaCl
수산화 나트륨	시그마 - 알드리치	306576	NaOH
피루브산 나트륨, > = 99 %	시그마 - 알드리치	P5280	피루브
산 용액 6 웰 디쉬	Agtechinc	D18	6 우물 접시
타우린	시그마 - 알드리치	T8691	타우린
조직 배양 접시	팔콘 코닝	353002	60mm 접시
트리톤 X-100	시그마 - 알드리치	X100	트리톤 X-100

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