이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

대변 DNA 무결성 검출에 의한 대장암 위험 및 유병률 평가

6.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/59426

⸱

2020년 6월 8일

 ,  ,  ,  , 
1Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy, 2Diatech Pharmacogenetics srl

이 논문에서

정오 공지

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

요약

제시된 진단 FL-DNA 키트는 대장암 병변의 존재의 신뢰할 수 있는 확률을 결정하는 시간 절약 및 사용자 친화적 인 방법입니다.

초록

요즘 대변 DNA는 여러 가지 방법으로 분리되고 분석 될 수 있습니다. 대변에 있는 DNA의 긴 단편은 사전 신생물 또는 신생물 대고 병변의 존재의 믿을 수 있는 확률을 제공하는 qPCR 분석결과로 검출될 수 있습니다. 형광 긴 DNA에게 불린 이 방법은 (FL-DNA), 1 차적인 예방 시스템에 개선인 빠른, 비침범성 절차입니다. 이 방법은 게놈 DNA의 특정 표적의 정량적 증폭에 의한 배설물 DNA 무결성의 평가에 기초한다. 특히, 200 bp 보다 긴 DNA 단편의 평가는 매우 높은 특이성을 가진 대장 병변을 가진 환자의 검출을 허용합니다. 그러나, 이 시스템 및 현재 유효한 모든 발판 DNA 시험은 해결될 필요가 있는 몇몇 일반적인 문제점을 제출합니다 (예를 들면, 시험을 수행해야 하는 주파수 및 각 개별을 위한 각 시점에서 집합된 대변 견본의 최적 수). 그러나, FL-DNA의 주요 장점은 면역화학성 배설물 혈액 검사(iFOBT)로 알려진 CRC 스크리닝 프로그램에서 현재 사용되는 시험과 관련하여 이를 사용할 수 있는 가능성이다. 실제로, 두 시험은 비용을 감소시키고 대장 병변의 궁극적인 존재의 더 나은 예측을 달성하는 동일 견본에 수행될 수 있습니다.

서론

대장암 (CRC)은 건강한 상피가 천천히 선종 또는 폴립으로 발전하는 다단계 과정에서 파생되며, 이는 시간이 지남에 따라 악성 암으로 진행됩니다1,,2. CRC의 높은 발생률에도 불구하고, 죽음의 비율에 있는 하향 추세는 지난 10 년간 관찰되었습니다3. 실제로, 선별 프로그램에서 채택된 조기 진단 도구는 pre-neoplastic 선종 또는 폴립4의조기 발견 및 제거로 이끌어 냈습니다. 그러나 다른 기술적 한계로 인해 이러한 방법 중 어느 것도 최적입니다. 실제로, 민감도와 특이성을 향상시키기 위하여, 많은 발판 DNA 시험은 단독으로 또는 현재 일상적인 진단시험과조합하여 제안되었습니다5,6.

일반적으로 건강한 점막은 배설물 스트림 apoptotic colonocytes로 흘러 들어가는 반면, 병에 걸린 점막은 비 세포사선 대장세포가 제거됩니다. 길이가 200 bp 이상인 단편은 비-사멸 DNA를 특징짓는다. 이 DNA는 긴 DNA (L-DNA)에게 불리고 CRC 조기 진단을 위한 이용 가능한 biomarker가 되었습니다. L-DNA는 대변 시편으로부터 분리되고 체외 진단 FL-DNA,키트7,8,89,910,,11,,12를사용하여 qPCR에 의해 정량화될 수 있다.

시험은 138 bp에서 339 bp에 구역 수색하는 FL DNA 단편의 검출을 위한 2개의 실험으로 이루어져 있습니다. 각 분석법은 FL-DNA (FAM)뿐만 아니라 스파이크 인 DNA (HEX)의 증폭을 허용합니다. 모든 단편의 최적 증폭을 보장하기 위해, 시험은 두 개의 실험("A" 및 "B")으로 나뉘어져 있다. A 분석은 APC 유전자(NM_001127511)의 엑소14의 2개의 지구 및 TP53 유전자의 엑손 7의 단편 (NM_001276760)를 검출합니다. B 분석은 APC 유전자(NM_001127511)의 엑슨 14의 단편과 TP53 유전자의 엑소5 및 8의 2개의 영역(NM_001276760)을 검출한다. 이 해수반은 검출된 부위를 구별하지 않는다. 스파이크인 DNA는 Oncorhynchus 케타 연어 DNA에 해당하며 절차가 제대로 수행되었는지 확인하고 잘못된 부정적인 결과를 얻을 수있는 억제제의 가능한 존재를 확인합니다. FL-DNA 농도는 표준 곡선 방법을 사용하여 절대 정량화에 의해 평가되고 ng/반응으로 표현됩니다.

FL-DNA 방법은 면역화학기반 배설물 혈액검사(iFOBT)와 결합하여 현재 CRC 스크리닝 프로그램에 사용되고 CRC 및/또는 고위험 선종 병변의 더 나은 예측을 가능하게 하는 비침습적이고 저렴한 대변 DNA 검사이다12.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

환자는 2013년과 2015년 사이 멜돌라 (FC, 이탈리아)의 로 스튜디오 e la Cura dei Tumori (IRST)당 Istituto Scientifico Romagnolo당에서 모집되었습니다. 등록된 환자는 IRST의 윤리위원회에 의해 승인된 프로토콜 IRSTB002로 - IRCCS AVR (25/10/2012, ver. 1). 모든 방법은 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다. 서면 통보 된 동의는 모든 환자로부터 얻었다.

1. 대변에서 DNA 추출

  1. 키트를 사용하여 대변 샘플을 준비합니다(재료 표참조). 제조업체의 지침에 따라 추출을 수행하여 배설물을 선택하고 처리합니다. 정제된 DNA를 직접 증폭하거나 후속 분석을 위해 -20°C에 저장합니다.

2. 양성 대조군, 표준, 스파이크인 DNA 및 임상 샘플의 준비

  1. 표준 및 시료 준비
    1. 양성 대조군, 표준, 스파이크인 DNA 및 모든 임상 샘플을 준비하려면 양성 대조군, 표준 및 스파이크인 DNA의 알리쿼트를 원심분리한 다음 제공된 물의 정확한 양을 추가하여 각 시약을 다시 일시 중단합니다(아래 참조). 그런 다음 긍정적 인 제어, 표준 및 스파이크 인 DNA를 조심스럽게 소용돌이친 다음 10 초 동안 원심 분리기를 하십시오. 건식 시약의 완전한 재현탁액을 얻으려면 액체 시약을 실온(RT)에 사용 하기 전에 30 분 동안 보관하십시오.
      1. 양성 대조는 건조한 형식의 인간 DNA입니다. 750 μL의 물로 각 알리쿼트에 다시 일시 중단하십시오.
      2. 스파이크인 DNA는연어(Oncorhynchus keta)DNA로, 대변에서 추출된 DNA 샘플에서 억제제의 존재 가능성을 확인하기 위해 외인성 내부 대조군으로 사용된다. 100 μL의 물로 각 알리쿼트에 다시 일시 중단하십시오.
    2. 표준 곡선을 준비하려면 스톡 솔루션에서 시작하여 4개의 1:5 희석을 생성합니다. 표준 점은 10 ng/반응, 2 ng/반응, 0.4 ng/반응 및 0.08 ng/반응이어야 합니다.
  2. 1x 스파이크인 DNA의 준비
    1. 사용하기 전에 스파이크인 DNA 대조군을 직접 준비하십시오.
    2. FL-DNa 스파이크 5 μL을 멸균수 20 μL과 혼합하여 1x 스파이크인 DNA 제어를 준비합니다. 분석할 샘플의 수와 양성 대조군에 따라 1x 스파이크인 DNA 대조군 샘플의 개수가 제조될 것이다.
  3. 샘플 의 준비
    1. 샘플(임상 샘플 또는 양성 대조군)의 75 μL을 1x 스파이크인 DNA의 25 μL과 혼합하여 총 부피를 100 μL로 산출합니다.

3. qPCR 쉬운 PGX를 사용하여 FL-DNA 값의 증폭 및 측정

참고: 인간 DNA와 내부 대조군을 대상으로 하는 특정 프라이머와 프로브를 포함하는 완전한 증폭 혼합물은 FL-DNA 혼합 A 및 FL-DNA 혼합 B. 표준, 양성 및 음성 대조군, 및 시료를 모두 혼수성 혼합물로 증폭해야 하는 8개의 웰 스트립에서 동열화 형식으로 제공됩니다. 임상 샘플은 두 가지 혼신 혼합체와 중복하여 만 증폭되어야합니다.

  1. qPCR 계측기 및 운영 소프트웨어는 재료 표를 참조하십시오.
    1. 작동 소프트웨어를 열고 플레이트 및 열 프로파일을 설정합니다.
      1. 표 1과같이 플레이트를 설정합니다.
        1. 열 1의 모든 8개 위치에 대해 웰 유형을 표준으로설정합니다.
        2. NTC로A2 및 B2 우물에 대한 웰 유형을 설정합니다.
        3. C2 및 D2(양수 컨트롤)에 대한 웰 유형을 알 수 없음으로설정합니다.
        4. 다른 모든 위치에 대한 웰 유형을 알 수 없음으로 설정합니다.
        5. 모든 96 위치를 선택하고 염료 FAM 및 HEX를추가합니다. 동기화 플레이트를 클릭합니다.
      2. 표 2에따라 열 프로파일을 설정합니다.
    2. 튜브의 바닥에 내용을 가지고 10 s에 대한 스트립의 필요한 수를 원심 분리.
    3. 부드럽게 내용물을 유지하는 주의를 기울이면서 스트립에서 씰을 제거하고 각 스트립에 추가하십시오 : 부정적인 제어 : 물 20 μL; 샘플: DNA의 20 μL; 표준 곡선: 표준 1, 2, 3 또는 4의 20 μL; 양성 대조군: 20 μL의 양성 대조군.
    4. 몇 초 동안 8 스트립 플랫 광학 캡과 소용돌이를 사용하여 조심스럽게 모든 스트립을 닫습니다.
    5. 스트립을 10초 동안 원심분리하고 악기에 적재합니다. 그런 다음 실행을 시작합니다.

4. 데이터 분석

참고: 소프트웨어에 따라 데이터 분석을 자동으로 또는 수동으로 수행할 수 있습니다(재료 표 참조).

  1. 실행의 끝에서, 선택 열 A, C, E, G 에 대한"FAM: FL-DNA-A"와"HEX : IC",및 열 B, D, F, H에 대한"FAM: FL-DNA-B"와"HEX : IC".
  2. 표준 수량 시작 량에대해 다음을 설정합니다: A1 및 B1 웰에 대한 10 ng/반응, C1 및 D1에 대한 2 ng/반응, E1 및 F1의 경우 0.4 ng/반응, G1 및 H1의 0.08 ng/반응.
  3. FAM(FL-DNA A 및 FL-DNA B) 및 HEX(IC) 채널 모두에 대해 임계값 형광 값을 150으로 설정합니다.
  4. 상자에서 결과 표에서 열 옵션을 클릭합니다 . 모두 선택 | 각 Cq (́R) 및 ́R 마지막 값으로 두 채널모두에서 결과를 얻으려면 확인합니다.
    참고: 이러한 값은 실시간 PCR 계측기 소프트웨어에서 제공됩니다. ΔR 은 마지막 증폭 주기에 정규화된 형광 값에 마지막으로 해당합니다.
  5. 결과 표 상자에서 테이블을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 컨텍스트 메뉴를 열고 Excel로 보내기를 클릭하여 원시 데이터를 내보냅니다.
  6. 표준 값을 확인하여 표준 곡선의 적합성을 확인합니다.
  7. 각 FL-DNA 혼합물에 대해 R2 ["R²(R²)" 열 및 효율성["효율성(%)"""효율(%)""""효율"을 확인하십시오. 열] 값을 지정합니다. 허용 가능한 범위에 있는 경우 제조업체의 지침에 따라 분석을 진행할 수있습니다(표 3).
  8. FAM 채널의 결과가 예상 범위에 없는 경우 표준 곡선의 한 점을 생략하고 실행을 다시 분석합니다.
  9. "Cq 없음" 값을 0으로 고려하여 다음 수식을 사용하여 음수 및 양수 컨트롤값을 결정합니다.
    figure-protocol-1
    figure-protocol-2
  10. 가져온 값을 표 4에보고된 값과 비교합니다.
  11. 반응 컨트롤이 예상 값 범위에 있는 경우 샘플 분석을 진행합니다.
    참고: 얻어진 Cq 값이 아티팩트(선형 형광 곡선)가 아닌 실제 증폭 반응(sigmoidal 형광 곡선)에서 생성되는지 확인합니다.
  12. 각 FL-DNA 혼합에 대한 샘플의 적합성을 분석하려면 HEX 채널의 Cq 값을 비교합니다. 값이 ≥16이면 샘플 분석을 진행합니다. 값이 <16이거나 Cq가 없는 경우 FL-DNA 스파이크의 디스펜싱 오류로 인한 것일 수 있습니다. 따라서 샘플을 분석할 수 없습니다.
  13. 다음 수식을 사용하여 양수 제어의 "HEX" 채널에서 Cq 값의 평균을 계산합니다.
    figure-protocol-3
  14. 다음 수식을 사용하여 샘플 복제의 "HEX" 채널에서 Cq 값의 평균을 계산합니다.
    figure-protocol-4
  15. 다음 수식에 따라 ́CqHEX 값을 계산합니다.
    figure-protocol-5
  16. 샘플의 ́CqHEX 값을 표 5에보고된 값과 비교합니다.
  17. 각 믹스(혼합 A 및 혼합 B)에 대해 FAM 채널의 Cq 값을 표 6에 보고된 값과 비교합니다.
  18. 각 적합한 샘플의 FL-DNA 값을 확인하려면 "Cq 없음" 값을 0으로 고려하여 다음 수식을 사용합니다.
    figure-protocol-6
    figure-protocol-7
    참고: 대장암 위험 및 유병률은 Rengucci et al.12 (표 7)에의해 얻어진 Fagan 노모그램 결과에 따른 iFOBT 및 FL-DNA 평가의 기능이다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

이 프로토콜의 워크플로는 그림 1에나와 있습니다. 워크플로는 이러한 단계 결과에 따라 두 가지 제어 단계와 서로 다른 작업을 제공합니다. 첫째, 샘플에 부적절한 컨트롤이 있는 경우 증폭을 반복해야 합니다. 둘째, 증폭이 억제되면 시료를 처음부터 재처리하거나 가치가 없는 것으로 분류해야 합니다.

도 2는 양성 및 음수 샘플에 의해 생성된 형광 곡선을 나타낸다. (A)도시된 것은 적합한 양성 샘플의 예이다. HEX 채널의 샘플 신호가 허용 범위 내에 있습니다. 양수 신호가 FAM 채널의 임계값을 초과합니다. (B)표시된 것은 적합한 음수/양수 샘플의 예입니다. 샘플 신호는 HEX 채널의 허용 범위 내에 있습니다. 음의 제어 신호가 FAM 채널의 임계값 보다 낮습니다. (C)도시된 것은 적합하지 않은 샘플의 예이다. 샘플 신호가 HEX...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

이전 연구는 수동 및 반자동 접근법에 의해 추출 된 대변의 DNA 무결성 분석이 대장 병변7,8,89,10,,,11,,12의조기 발견을위한 대체 도구를 나타낼 수 있음을 입증했다.10 분자, 비침습적 선별 검사는 대장암 의 검출을 위해 수년에 걸쳐 개발되었지만, 이러한 방법의 광범위한 확산은 다른 선별 검사에 비해 시간 소모적인 접근법과 비용 효율성 저하로 인해 제한됩니다.

이 방법은 비교적 저렴하고 시간이 많이 걸리지 않습니다. 또한 몇 가지 수동 단계를 필요로하는 새로운 절차로 인해 대장 병변을 검출하는 정확도가 증가했습니다....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

마우라 멘기는 디아텍 약전유전학 스월의 풀타임 직원입니다.

감사의 글

저자는 인정이 없습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1.5 mL 및 2 mL 폴리프로필렌 트위스트-락 튜브 (DNase-, RNase-, DNA-, PCR 억제제 없음)DNA 추출 및 Real Time PCR
절대 에탄올 (분석 정도의 품질)에 필요한 소모품 DNA 추출에 필요한 시약
벤치탑 원심분리기 최대 속도 20000 x g. DNA 추출에 필요한 기기
EasyPGX 분석 소프트웨어 버전 2.0.0Diatech PharmacogeneticsRT800-SW분석 소프트웨어 
EasyPGX 원심분리기/와류 8-웰 스트립Diatech PharmacogeneticsRT803기기는 실시간 PCR 분석에 권장됩니다.
EasyPGX qPCR 기기 96 Diatech PharmacogeneticsRT800-96기기는 Real Time PCR 분석에 권장됩니다.
EasyPGX 준비 FL-DNADiatech PharmacogeneticsRT029Kit for the Real Time PCR assay
Micropipettes (volume from 1.000 µ L)DNA 추출 및 Real Time PCR에 필요한 소모품
파우더 프리 일회용 장갑DNA 추출 및 Real Time PCR에 필요한 소모품
QIAamp Fast DNA StoolQiagen51604대변에서 DNA 추출 및 정제에 권장되는 키트
멸균 필터 팁 DNase-, RNase-free (1 - 1.000 µ L)DNA 추출 및 Real Time PCR에 필요한 소모품
열 차단 예: EasyPGX 건조 블록Diatech PharmacogeneticsRT801DNA 추출에 필요한 기기
Vortex 예: EasyPGX 원심분리기/소용돌이 1.5 ml Diatech PharmacogeneticsRT802DNA 추출에 필요한 기기

참고문헌

  1. Fearon, E. R. Molecular Genetics of Colorectal Cancer. Annual Review of Pathology. 6, 479-507 (2011).
  2. Sears, C. L., Garrett, W. S. Microbes, Microbiota, and Colon Cancer. Cell Host and Microbe. 15, 317-328 (2014).
  3. SEER Stat Fact Sheets: Colon and Rectum Cancer. National Cancer Institute. , Available from: http://seer.cancer.gov/statfacts/html/colorect.html (2019).
  4. Levin, B., et al. Screening and Surveillance for the Early Detection of Colorectal Cancer and Adenomatous Polyps, 2008: A Joint Guideline From the American Cancer Society, the US Multi-Society Task Force on Colorectal Cancer, and the American College of Radiology. Gastroenterology. 134, 1570-1595 (2008).
  5. Bosch, L. J., et al. Molecular tests for colorectal cancer screening. Clinical Colorectal Cancer. 10, 8-23 (2011).
  6. Ahlquist, D. A. Molecular detection of colorectal neoplasia. Gastroenterology. 138, 2127-2139 (2010).
  7. Calistri, D., et al. Fecal multiple molecular tests to detect colorectal cancer in stool. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 1, 377-383 (2003).
  8. Calistri, D., et al. Detection of colorectal cancer by a quantitative fluorescence determination of DNA amplification in stool. Neoplasia. 6, 536-540 (2004).
  9. Calistri, D., et al. Quantitative fluorescence determination of long-fragment DNA in stool as a marker for the early detection of colorectal cancer. Cellular Oncology. 31, 11-17 (2009).
  10. Calistri, D., et al. Fecal DNA for noninvasive diagnosis of colorectal cancer in immunochemical fecal occult blood test-positive individuals. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 19, 2647-2654 (2010).
  11. De Maio, G., et al. Circulating and stool nucleic acid analysis for colorectal cancer diagnosis. World Journal of Gastroenterology. 20, 957-967 (2014).
  12. Rengucci, C., et al. Improved stool DNA integrity method for early colorectal cancer diagnosis. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 23, 2553-2560 (2014).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

정오


Formal Correction: Erratum: Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection
Posted by JoVE Editors on 9/28/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection. An affiliation was updated.

The first affiliation was updated from:

Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST)

to:

Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy

태그

DNAPCRDNAPCR
대변 DNA 무결성 검출에 의한 대장암 위험 및 유병률 평가
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.