Lyssaviruses 검출을 위한 보편적 중첩 역방향 전사 중 합 효소 연쇄 반응의 평가

Summary

중첩 된 범-리스 사 바이러스는 역 전사 중 합 효소 연쇄 반응을 특이 적으로 알려진 모든 리즈 사 바이러스를 검출 하기 위해 개발 되었다. 다른 동물 종의 광견병 뇌 샘플을 이용한 검증은이 방법이 금 표준 형광 항 체 시험에 상응 하는 민감도 및 특이성을 가지 며, 일상적인 광견병 진단을 위해 사용 될 수 있음을 보여주었다.

Abstract

가정 내에서 리 조 바이러스 의 광견병 바이러스 및 기타 종 종을 검출 하는 것은 Rhabdo비리대에 있어서, 상기 팬 리스 사 바이러스 중첩 역방향 전사 중 합 효소 연쇄 반응 (중첩 된 rt-pcr)은 보존 된 영역을 검출 하기 위하여 개발 된 광견병 (N) 유전자의. 이 방법은 바이러스 RNA (cDNA)를 합성 하기 위한 프라이 머로 서의 템플릿 및 올리고 (dT)₁₅ 와 랜덤 hexamers로 서 바이러스가 있는 DNA를 사용 하 여 역 전사 (RT)를 적용 한다. 이어서, 바이러스 성 cDNA는 외부 프라이 머를 사용 하 여 1 라운드 PCR에서 845 bp N 유전자 단편을 증폭 하는 템플릿으로 사용 되 고, 이어서 제 2 라운드 형 PCR에 의해 내부 프라이 머를 이용 하 여 최종 371 bp 단편을 증폭 한다. 이 방법은 광견병 바이러스 (RABV)의 상이한 유전 적 clades를 검출할 수 있다. 중국에서의 10 년의 임상 광견병 진단 및 감시에서 8 개의 국내 동물 종에서 9624 두뇌 표본을 사용 하 여 유효성 검사는, 방법이 직접 형광에 비교 하 여 100% 감도 및 99.97% 특이성을가지고 있음을 보여주었습니다 항 체 시험 (지방), 세계 보건 기구 (WHO)와 동물 건강을 위한 세계 조직 (OIE)에 의해 권장 되는 금 표준 방법. 또한, 상기 방법은 또한 합성의 모방 검출에 의해 평가 된 바와 같이, 바이러스의 분류에 관한 국제 위원회의 제 10 회 보고서에서의 타겟 된 N 유전자 단편을 다른 승인 및 2 개의 신규 리 사이 바이러스 종들에 게 증폭 시킬 수 있다 모든 리즈 사 바이러스의 N 유전자 플라스 미드. 이 방법은 광견병 진단에 대 한 지방에 대 한 편리한 대안을 제공 하 고 중국의 국가 표준 (T36789)로 승인 되었습니다.

Introduction

광견병은 인 리스 사코 바이러스¹내에서 바이러스에의 한 전 세계적으로 발생 한 질병입니다. 리스 사 바이러스 (가족 Rhabdo비리대)는 5 개의 단백질을 인코딩하는 약 12kb 게놈을 갖는 단일 음성 가닥 RNA 바이러스: N, phosphoprotein, 매트릭스 단백질 (G), 당단백질 및 큰 단백질 또는 중 합 효소 (L). N 유전자, 유전 거리 및 항 원 성 패턴의 뉴클레오티드 서 열에 기초 하 여, 리 사이 바이러스는 고전적인 광견병 바이러스 (RABV) 및 광견병 관련 바이러스 (RRV)를 포함 하는 16 종으로 구분 되었다: 라고스 박쥐 바이러스 ), 모 코 롤라 바이러스 (MOKV), 유럽 박쥐 리스 사 바이러스 1 (EBLV-1), 브라질의 박쥐 리스 사 바이러스 2 (EBLV), 아 라 반 바이러스의 아 반 바이러스,이 코 코 (IKOV),이 르 쿠 바이러스 (GBLV), Irkut (IRKUT), (이로 브 루), Gannoruwa Khujand 바이러스 (쿠 브), 웨스트 코 카 서 스 박쥐 바이러스 (WCBV), 시 나 니 박쥐 바이러스 (L레프) 및 레이다 박쥐 리스 사 바이러스 최근 두 가지 추가 리 사이 바이러스가 확인 되었습니다: 일본 pip....

Protocol

이 프로토콜에서 마우스의 사용은 군사 의학 연구소의 동물 복지에 대 한 관리 위원회에 의해 승인 되었다, 군사 의료 과학 아카데미, 중국 (실험실 동물 관리 및 사용 위원회 승인, 허가 2010-02). 실험실 동물의 관리 및 사용을 위한 모든 기관 및 국가 지침이 따랐습니다.

1. RNA 추출

1. 광견병-의심 되는 뇌 조직, 피부 생 검, 타 액 또는 CSF 또는 RABV 감염 세포 배양 물 로부터 RNA를 추출 하 여, 구 아니 늄 추적용-페 놀 클로로 포 름 계 추출 방법 또는 시판 바이러스 RNA 추출 키트를 사용 한다. 준비 된 RNA를 즉시 사용 하거나 필요할 때까지-80 ° c에서 보관 하십시오.

2. 바이러스 성 RNA의 역 전사

1. 표 1 에 나열 된 RT 시 약을 냉동에서 제거 하 고, 얼음에 보관 하 고, 사용 하기 전에이를 해 동 하 고 소용돌이 십시오.
2. 표 1에 나열 된 시 약을 0.2 ML의 PCR 튜브에 µ 반응 믹스 12 리터를 준비 한다. 마스터 믹스의 부피를 필요 이상으로 1 개 이상의 반응 크기로 준비 하 여 파이 펫 팅 변형을 허용 합니다.<....

Results

18 개의 리 사 바이러스 종을 검출 하는 중첩 된 RT-PCR의 결과는 도 1에 나타나 있다. 모든 PCR 양성 대조 군에서는 1 차 및 371 bp에서 845 bp에 예상 되는 것을 나타내 었으 며, 네거티브 컨트롤에는 밴드가 없는 2 라운드 증폭. 총 18 개 리즈 사 바이러스는 예상 845 및/또는 371 bp 대역을 생산 하 여, 중첩 된 RT-PCR이 모든 리즈 사 바이러스를 검출 했음을 나타낸다. 16 개의 리 사 바이러스 플라스 미드는 두 차례의 PCR에서 효율적인 증폭을 했지만, 두 가지 즉 ARAV와 IKOV는 1 차 또는 2 라운드 PCR 중 하나에서 증폭을 가졌다. 표 6에 나타난 바와 같이 상이한 리 사 바이러스 플라스 미드의 검출에 있어서 다양 한 방법의 민감도는 2.24 x 10 내지 2.24 x µ의 범위에 이른다. 이러한 차이는 바이러스 성 서 열 다양성으로 인해 프라이 머와 .......

Discussion

현재 RABV는 중국의 거의 모든 인간과 동물 광견병 뿐만 아니라 다른 나라에 대 한 책임을 맡고 있는 주요 리 사이 바이러스입니다. 또한, IRKV 변이체는 2012에서 중국 북동부에 있는 길 림 성의 Murina leucogaster 박쥐 로부터 먼저 확인 되었고, 2017¹¹에 있는 랴오닝 성에 서 개 사망을 야기 하는 것으로 보고 되었다. 가장 최근에는, 2017에서 대만, 중국의 일본 pipistrelle bat에서 새로운 리즈 사 바이러스, TWBLV도 확인 되었다. 이러한 결과는 다른 리스 바이러스를 효과적으로 검출 하는 것이 또한, 상기 박쥐-매개의 발생을 방지 하는 것이 중요 하다는 것을 시사 바이러스. 이와 관련 하 여, 가장 보존 된 N 개의 유전자 영역을 표적화 하는 pan-리 조 바이러스 내포 된 RT-PCR은 매우 유용한 도구이 고, 그 결과는 지금까지 확인 된 16 가지 ICTV 승인 .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 &번; TAE	Various	Various
6 × 로딩 버퍼	TakaRa	9156
Agarose	US Everbright® Inc	A-2015-100g
ddH2O	다양한
DL 2,000 마커	Takara	3427A
dNTP (10 mM)	TakaRa	4019
dNTP (2.5 mM)	TakaRa	4030
전기영동 시스템	Tanon	EPS300
Ex-Taq (5 U/μ L)	TakaRa	RR001
겔 이미징 시스템	UVITEC	Fire Reader
Microcentifuge 튜브	다양한	다양한
M-MLV 역전사 효소(200 IU/µ L)	TakaRa	2641A
NanoDrop 1000 분광 광도계	Thermoscientific	ND1000
Oligo (dT)15	TakaRa	3805
PCR 기계	BIO-RAD	T100
PCR 튜브	다양한	Phusion
High-Fidelity DNA Polymearase	NEW ENGLAND BioLabs	M0530S
Pipettors	다양한	랜
덤 프라이머	TakaRa	3801
RNase 억제제(40 IU/&마이크로; L)	TakaRa	2313A
RNase-free ddH2O	TakaRa	9102
Taq 버퍼 (10×)	TakaRa	9152A
팁	다양한	다양한
와류 믹서	다양한	다양한