여기서, 우리는Dmdmdx 마우스 유래 피부 섬유아세포로부터 iPSC에서 디스트로핀 발현을 복원하고 Tet-on MyoD 활성화 시스템을 사용하여 iPSC를 myogenic 전구 세포(MPC)로 직접 분화하는 Cas9 기반 exon23 결실 프로토콜을 제시한다.
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이 논문에서
요약
초록
Duchenne 근 이영양증 (DMD)는 궁극적으로 근육 전구 세포의 고갈로 이끌어 내는 dystrophin 유전자에 있는 돌연변이에 기인한 가혹한 진보적인 근육 질병입니다. 클러스터된 정기적으로 연속된 짧은 palindromic 반복/CRISPR 관련 9 (CRISPR/Cas9) 유전자 편집은 디스트로핀 유전자의 발현을 회복시킬 수 있는 잠재력을 갖는다. 자가성 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)-유래 근육 전구 세포 (MPC)는 줄기 / 전구 세포 풀을 보충하고 손상을 복구하며 면역 반응을 일으키지 않고 DMD에서 추가 합병증을 예방 할 수 있습니다. 이 연구에서는 CRISPR/Cas9 및 비통합 iPSC 기술의 조합을 도입하여 회복된 디스트로핀 단백질 발현을 가진 근육 선조를 얻습니다. 간략하게, 우리는 Dmdmdx 마우스의 진피 섬유아세포로부터 iPSC 라인을 확립하기 위해 비통합 센다이 벡터를 사용합니다. 그런 다음 CRISPR/Cas9 결실 전략을 사용하여 재프레임된 디스트로핀 유전자의 비상동성 말 결합을 통해 디스트로핀 발현을 복원합니다. 94개의 iPSC 콜로니에서 3개의 콜로니에서 exon23 고갈의 PCR 검증 후, 우리는 근육 분화 조절에 중요한 역할을 하는 주요 전사 인자인 MyoD의 독시사이클린(Dox)-유도 발현에 의해 iPSC를 MPC로 분화합니다. 우리의 결과는 DMD의 처리를 위한 미래 치료를 개발하기 위한 중요한 잠재력을 가지고 있는 iPSC 파생된 MPC에 있는 dystrophin 표현을 복구하기 위하여 CRISPR/Cas9 삭제 전략을 사용하는 타당성을 보여줍니다.
서론
Duchenne 근 이영양증 (DMD)는 가장 일반적인 근 이영양증의 한개이고 전세계 대략 5,000명의 신생아 소년의 1에 영향을 미치는 dystrophin의 부재에 의해 특징입니다1. 디스트로핀 유전자 기능의 손실은 진보적 인 myofibers 변성으로 이어지는 구조적 근육 결함을초래1,2. 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV)-매개 유전자 치료 시스템은 마이크로 디스트로핀(μ-Dys)을 이용한 유전자 교체와 같은 디스트로핀 발현을 복원하고 근육 기능을 향상시키는 것으로 시험되었다. 그러나, rAAV 접근법은 기능성 단백질3,4의발현을 유지하기 위해 반복주사를 요구한다. 따라서, 우리는 DMD를 가진 환자에 있는 dystrophin 유전자 발현을 효과적이고 영구적으로 복구할 수 있는 전략이 필요합니다. DMD를 위한 마우스 모델인Dmdmdx 마우스는, 조기 종결 코동을 도입하고 C 말단 디스트로글리칸 결합 도메인이 결여된 비기능성 잘린 단백질을 초래하는 디스트로핀 유전자의 엑소(23)에서 포인트 돌연변이를 갖는다. 최....
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프로토콜
모든 동물 취급 및 외과 적 절차는 오거스타 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인 된 프로토콜에 의해 수행되었다. 마우스는 표준 식이요법과 물 광고 리비텀을 공급하였다.
1. 성인 Dmdmdx 마우스에서 기본 마우스 섬유 아세포의 격리
- 조지아 의과 대학에 의해 승인 IACUC에 따라 CO2 질식 및 흉부 절제술에 의해 성인 Dmdmdx 마우스 (남성, 2 개월) 안락사 오거스타 대학. 라미나 후드 에서 멸균 상태에서 멸균 메스로 꼬리를 잘라. 꼬리를 70% 에탄올로 5분 간 헹구고, 멸균 인산완충식염수(PBS)로 6cm 접시에 씻습니다.
- 꼬리 피부를 따라 밑면에서 꼬리 끝까지 날카로운 절개로 꼬리 피부를 벗겨낸 다음 핀셋으로 꼬리 피부를 부드럽게 벗깁니다. 멸균 된 메스를 사용하여 1mm3 의 크기로 피부를 다진 피부 조직을 덜베코의 최소 필수 매체 / 햄의 F12 (DMEM / F12)에서 6cm 접시로 옮기고 0.1 % 콜라게 나아제 IV 및 1 U / mL의 디스파스를 함유합니다.
- 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 2시간 동안 배양 접시에 피부 조직을 소화한다....
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결과
Dmdmdx 피부 섬유아세포 유래 iPSC의 확립. 우리는 통합없는 재프로그래밍 벡터를 사용하여Dmdx 마우스 유래 피부 섬유 아세포로부터 마우스 iPSC를 생성하는 효율성을 입증했습니다. 도 1A는 감염 후 3주에 배아 줄기세포(ESC)와 유사 콜로니의 출현을 입증하였다. 우리는 살아있는 알칼리성 인산염 (AP) 얼룩에 의한 iPSC 유도의 효율을 평가합니다; 도 1B는 FACS 분석에 의한 AP 양성 세포의 백분율이 약 1.8%였다는 것을 보여준다. SSEA1, Lin28, Nanog, OCT4 및 SOX2, 마우스 배아 줄기 세포에 대한 다능 마커는 면역형광 염색에 의해 iPSC 콜로니에 대해 양성이었다(도1C). 생체 내에서 iPSCs의 3개의 생식선 분화를 조사하기 위하여는,.......
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토론
듀첸 근이영양증(DMD)은 디스트로핀의 부족을 특징으로 하는 파괴적이고 궁극적으로 치명적인 유전질환으로, 진행성 근육 위축으로 이어지는1,2. 우리의 결과는 CRISPR/Cas9 매개 exon23 결실의 접근법에 의해Dmdmdx iPSC 유래 myogenic 전구 세포에서 복원된 디스트로핀 유전자 발현을 입증한다. 이 방법은 세 가지 장점이 있습니다.
첫째, 우리는 비통합 RNA 벡터를 사용하여Dmdmdx 마우스 유래 진피 섬유아세포로부터 iPSC를 생성하였다. 렌티바이러스 및 레트로바이러스 벡터와 같은 iPSCs를 생성하기 위해 다양한 방법이 개발되었으며, 이는 숙주 염색체로 통합되어 재프로그래밍 유전자를 발현하여 안전성 문제를 제기합니다. 플라스미드 벡터, 아데노-관련 바이러스 및 아데노바이러스와 같은 DNA 기반 벡터는 비-통합 방.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
탕과 와인트라우브는 NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354에 의해 부분적으로 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 외과 기구 | |||
| 31게이지 바늘 | 다양한 | ||
| 날카로운 절개 | 다양 | ||
| 멸균 메스 | 다양한 | ||
| 핀셋 | 다양한 | ||
| 섬유아세포 배지(전체 배지 100mL용) | 회사 | 카탈로그 번호 | 볼륨 |
| 2-메르캅토에탄올(55mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.1mL |
| 항생제 항진균 슬러션 100x | CORNING | MT30004CI | 1mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - High glucose | SIGMA | D6429 | 87mL |
| Fetal 소 혈청 특성화 | HyClone | SH30396.03 | 10 mL |
| L-글루타민 용액 | SIGMA | G7513 | 1 mL |
| MEM 비필수 아미노산 용액 (100x) | Gibco | 11140076 | 1 mL |
| TVP 용액(500 mL 완용액) | 회사 | 카탈로그 번호 | 볼륨 |
| 치킨 세럼 | Gibco | 16110-082 | 5 mL |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | 186 mg |
| 포스팟 완충 식염수 | - 500 mL | ||
| 트립신(2.5%) | Thermo | 15090046 | 5 mL |
| mES 성장 배지(완제품 용액 500mL) | 회사 | 카탈로그 번호 | 볼륨 |
| 2-메르캅토에탄올(55mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.5mL |
| 항생제 항진균 슬러션 100x | CORNING | MT30004CI | 5mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - High glucose | SIGMA | D6429 | 408.5mL |
| 소 태아 혈청 특성화된 | HyClone | SH30396.03 | 75 mL |
| L-글루타민 용액 | SIGMA | G7513 | 5 mL |
| 마우스 재조합 백혈병 억제 인자(LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 500 μ L | |
| MEK/GS3 억제제 보충제 | EMD Millipore Corp | CS210510-500UL | 500 μ L |
| MEM 비필수 아미노산 용액 (100개) | Gibco | 11140076 | 5 mL |
| ES 세포 배지는 4주 이상 보관해서는 안 되며 억제제와 함께 2주 이상 보관해서는 안 됩니다. | |||
| mES 동결 배지(완용액 50mL용) | Company | 카탈로그 번호 | Volume |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | SIGMA | D2650 | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | SIGMA | D6429 | 24.9 mL |
| 태아 소 혈청 특성화 | HyClone | SH30396.03 | 25 mL |
| 마우스 재조합 백혈병 억제 인자 (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 50 μ l |
| 재료/장비 | 회사 | 카탈로그 번호 | RRID |
| 0.05% 트립신/0.53 mM EDTA | CORNING | 25-052-CI | |
| 4% 파라포름알데히드 | Thermo scientific | J19943-k2 | |
| Accutase 용액 | SIGMA | A6964 | 세포 박리 용액 |
| AgeI-HF | NEB | R3552L | |
| Alexa488-conjugated goat-anti-mouse 항체 | Invitrogen | A32723 | AB_2633275 |
| Alexa488-conjugated goat-anti-rabbit 항체 | Invitrogen | A32731 | AB_2633280 |
| Alexa555-conjugated goat-anti-rabbit 항체 | Invitrogen | A32732 | AB_2633281 |
| anti-AFP | Thermo scientific | RB-365-A1 | |
| AB_59574 anti-α-Smooth 근육 Actin (D4K9N) XP | CST | 19245S | |
| AB_2734735 안티-디스트로핀 | Thermo | PA5-32388 | AB_2549858 |
| 안티-LIN28A (D1A1A) XP | CST | 8641S | AB_10997528 |
| anti-MYH2 | DSHB | mAb2F7 | AB_1157865 |
| anti-Nanog-XP | CST | 8822S | |
| AB_11217637 anti-Oct-4A (D6C8T) | CST | 83932S | AB_2721046 |
| anti-Sox2 | abcam | ab97959 | AB_2341193 |
| anti-SSEA1(MC480) | CST | 4744s | |
| AB_1264258 anti-TH (H-196) | SANTA CRUZ | sc-14007 | AB_671397 |
| 알칼리 인산가수분해효소 생염색제 (500x) | Thermo | A14353 | |
| 블라스티시딘 S | 시그마-알드리치 | 203350 | |
| BsmBI/Esp3I | NEB | R0580L/R0734L | |
| 카르베니실린 | 밀리포어 | 205805-250MG | |
| 콜라겐분해효소 IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Competent Cells | TakaRa | 636763 | |
| CutSmart | NEB | B7204S | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo | A16517 | |
| DirectPCR 용해 시약(셀) | VIAGEN BIOTECH | 302-C | |
| Dispase (1 U/mL) | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| 독시사이클린 염산염 | Fisher BioReagents | BP26535 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101L | |
| 피브로넥틴 소 혈장 | SIGMA | F1141 | |
| QIAEX II 젤 추출 키트 (500) | QIAGEN | 20051 | |
| 젤라틴, DAPI | |||
| Vector | H-1500 | ||
| Hygromycin B (50 mg/mL) | Invitrogen | 10687010 | |
| Ketamine HCL Injection | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH | 45822 | |
| KpnI-HF | NEB | R3142L | |
| lenti-CRISPRv2-blast | Addgene | 83480 | |
| lenti-Guide-Hygro-iRFP670 | Addgene | 99377 | |
| Lipofectamin 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000015 | |
| LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60625 | |
| LV-TRE-VP16 마우스 MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60626 | |
| 마우스 온 마우스 (M.O.M.) 기본 키트 | 벡터 | BMK-2202 | |
| NotI-HF | NEB | R3189L | |
| Opti-MEM I 감소 세럼 매체 | ThermoFisher | 31985070 | |
| 폴리에틸렌 글리콜 4,000 | 알파 에자르 | AAA161510B | |
| 폴리브렌 | SIGMA | TR1003 | |
| Corning BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Culture Slide | CORNING | CB354688 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | A25742 | |
| PrimeSTAR Max Premix | TakaRa | R045 | |
| Proteinase K | VIAGEN BIOTECH | 507-PKP | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals | ICN19453980 | |
| qPCR 렌티바이러스 적정 키트 | abm | LV900 | |
| 퀵 라이테이션 키트 | NEB | M2200S | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100) | QIAGEN | 12945 | |
| RevertAid RT 역전사 키트 | Thermo scientific | K1691 | |
| RNAzol RT | Molecular Research Center, INC | RN 190 | |
| T4 DNA 리가제 반응 버퍼 | NEB | B0202S | |
| T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 | NEB | M0201S | |
| 훌륭한 국물 변형 | 피셔 바이오 시약 | BP9729-600 | |
| ViralBoost 시약(500x) | ALSTEM | VB100 |
참고문헌
- Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).
- Batchelor, C. L., Winder, S. J. Sparks, signals and shock absorbers: how dystrophin loss cause....
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