애기장대에서 패턴 트리거 산화 버스트와 모종 성장 억제 어세

요약

이 논문은 면역 점구체에 노출 된 후 애기장대에서 방어 반응을 정량화하는 두 가지 방법, 즉 일시적인 산화 파열 및 모종 성장 억제에 대해 설명합니다.

초록

식물은 병원균을 인식하고 질병으로부터 보호하기 위해 강력한 면역 체계를 발전시고 있습니다. 이 논문은 유도체 분자를 사용한 치료 후 애기장대에서 면역 활성화의 강도를 측정하는 데 사용할 수 있는 2개의 검정을 기술합니다. 먼저 제시된 것은 루미놀 계 분석법을 사용하여 모니터링될 수 있는 급속하게 유도되고 동적 산화 버스트를 포착하는 방법이다. 제시된 두 번째는 모종 성장의 면역 유발 억제를 측정하는 방법을 설명하는 방법이다. 이 프로토콜은 빠르고 신뢰할 수 있으며 전문 교육이나 장비가 필요하지 않으며 식물 면역의 유전 적 기초를 이해하는 데 널리 사용됩니다.

서론

병원체에 대하여 인식하고 방어하기 위하여는, 식물은 미생물 관련 분자 패턴 (MAMPs)로 알려져 있는 세포 외부보존된 미생물 분자를 검출하는막 결합한 패턴 인식 수용체 (PRRs)를 진화했습니다 1. 그들의 동족 PR에 MAMPs의 결합은 광범위한 질병 저항성의 결과로 단백질 키나제 매개면역 신호질을 개시합니다 2. PRR 활성화 다음 초기 반응 중 하나는 세포 외 반응성 산소 종 (ROS)의 생산을 촉매 하는 일체형 플라즈마 막 호흡 버스트 OXIDASE HOMOLOG (RBOH) 단백질의 인산화 및 활성화^{3 , 4.}ROS는 면역 신호를 전파하는 보조 메신저뿐만 아니라 직접 항균제^로서모두 작용하여 질병 내성을 확립하는 데 중요한 역할을 한다 5. 면역 유도산화 파열의 첫번째 관측은 피토프토라 감염증 접종^후리시리의 감자 덩이줄기를 사용하여 기술되었다 6. ROS 생산은 잎 디스크 7, 세포현탁액 배양^8,및 프로토 플라....

프로토콜

1. 면역 유도 다음 애기장대 잎 디스크에서 ROS 버스트의 검출

1. 식물 성장 및 유지 보수.
   1. 발아를 동기화하기 위해, 애기장대 씨앗을 멸균 0.1% 한천 의 1 mL에 약 50 개의 씨앗을 일시 중단하고 3-4 일 동안 4 °C (빛 없음)에 보관하십시오.
      참고: 야생형 배경 대조군(예를 들어, Col-0)과 높은 및 낮은 면역 출력을 가진 유전형(예: cpk28-1 및 bak1-5)을 계층화하여 내부 대조군역할을 합니다.
   2. 토양에 씨를 뿌리고 표준 단일 조건 (22 °C, 10 h 빛, 150 mE / m2 / s 의 빛 강도 및 65-70 % 상대 습도)에서 발아하십시오.
   3. 약 7 일 후, 포셉을 사용하여 개별 묘목을 새로운 냄비에 이식하고, 전체 로제트 개발을 허용하기 위해 적어도 4cm로 분리하십시오. 유전자형 당 6-12 개의 묘목을 이식하고 표준 단기 조건으로 돌아갑니다. 정기적으로 물과 식물을 비료 (2 주마다 20-20-20 비료의 1 g / L).
2. 하룻밤 회복을 위해 96 웰 플레이트에 잎 디스크를 수집합니다.
   1. 발아 후 4-5주(그림

결과

돌연변이 cpk28-1^19,25 및 bak1-5^17,18 식물은 산화 버스트와 SGI에서 각각 높고 낮은 면역 반응을 가진 유전자형에 대한 예상 결과를 입증하는 데 사용되었습니다. 야생형 배경 대조군(Col-0)을 기준으로 합니다. 투여량 의존적 효과를 평가하기 위해, elf18의 10배 펩타이드 희석 계열(1-1,000 nM)을 사용하였다. 예상대로 cpk28-1 기능 손실 라인은 Col-0에 비해 누적(그림3A)및 평균(그림3B)ROS 버스트가 더 높았으며, bak1-5는 10nM 및 농도에.......

토론

이 논문은 애기장대에서패턴 트리거 면역 반응을 분석하는 두 가지 방법을 설명하며, 전문 장비를 사용하지 않고 면역 출력을 평가하는 정량적 접근법을 제공합니다. 조합에서, 패턴 트리거된 ROS 및 SGI는 각각 미생물 지각에 대한 초기 및 후기 반응을 평가하는 데 사용될 수 있다.

산화 파열 분석법의 주요 제한은 가변성입니다. 완전히 이해되지 않는 이유로 절대 RlUs는 종종 실험 간의 크기 순서에 따라 다릅니다. 실험 간 가변성이 높기 때문에, 야생형 대조군(예를들어, Col-0)에 더하여 높은(예를들어, cpk28-1)및 낮음(예를들어, bak1-5)을가진 내부 참조 대조군을 포함하는 것이 바람직하다. 그러나, 실험 간의 재현성을 높이기 위해 조치를 취할 수 있습니다. 온도, 습도, 광주 및 광강도와 같은 환경 조건은 복제본 간에 동일해야 합니다. 샘플링 할 때 식물의 나이와 건강도 고려해야합니다. 잎 디스크는 짧.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
20-20-20 비료	식물 Prod	10529	물에 1g/L를 섞고 최적의 성장을 위해 2주마다 식물에 적용하십시오.
4mm 생검 펀치	메디컬 마트	232-33-34-P	표면적이 0.125cm^2인 코르크 보어 세트도 사용할 수 있습니다.
뚜껑이 있는 48웰 멸균 플레이트	Sigma-Aldrich	CLS3548
Draft Sheid	VWR	VWR-225AC	모든 표준 분석 저울을 성장 감지 분석에 사용할 수 있지만 직접 컴퓨터 출력이 최적입니다.
BioHit mLine 기계식 12 멀티채널 피펫 (30-300 uL)	Sartorius	725240	모든 멀티채널 피펫을 사용할 수 있으며, 필요한 경우 단일 피펫을 사용할 수 있습니다.
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)	EZ Biolab	cp7211	-80C에서 10mM 스톡 펩타이드를 저단백질 결합 튜브에 저장합니다. 해동되면 -20C에서 100uM 작업 재고를 보관하십시오.
집게	Fisher Scientific	22-327379
양 고추 냉이 과산화 효소	Sigma-Aldrich	P6782	순수한 물에 용해하십시오. -20°C에서 보관하고 빛을 피해 보관하십시오.
Luminol	Sigma-Aldrich	A8511	DMSO에 용해됩니다. -20°C에서 보관하고 빛을 피해 보관하십시오.
Murisage and Skoog 기초 염	Cedarlane Labs	MSP09-100LT	4C에 보관.
토양	SunGrow 원예	선샤인 믹스 #1	다른 토양 유형도 애기장대를 재배하는 데 사용할 수 있습니다. 냄비를 채울 때 물과 섞으십시오.
LUM 모듈이 포함된 SpectraMax Paradigm 다중 모드 마이크로플레이트 리더	분자 장치는	견적을 요청해야 합니다	발광을 검출할 수 있는 모든 플레이트 리더를 이러한 분석에 사용할 수 있습니다.
설탕	시그마-알드리치	S0389-1KG	실온에서 보관하십시오.
백색 폴리스티렌 96웰 플레이트	Fisher Scientific	07-200-589

가 있는 분석 저울 은 은