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방법 논문

애기장대에서 패턴 트리거 산화 버스트와 모종 성장 억제 어세

13.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/59437

⸱

2019년 5월 21일

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Queen's University

이 논문에서

요약

이 논문은 면역 점구체에 노출 된 후 애기장대에서 방어 반응을 정량화하는 두 가지 방법, 즉 일시적인 산화 파열 및 모종 성장 억제에 대해 설명합니다.

초록

식물은 병원균을 인식하고 질병으로부터 보호하기 위해 강력한 면역 체계를 발전시고 있습니다. 이 논문은 유도체 분자를 사용한 치료 후 애기장대에서 면역 활성화의 강도를 측정하는 데 사용할 수 있는 2개의 검정을 기술합니다. 먼저 제시된 것은 루미놀 계 분석법을 사용하여 모니터링될 수 있는 급속하게 유도되고 동적 산화 버스트를 포착하는 방법이다. 제시된 두 번째는 모종 성장의 면역 유발 억제를 측정하는 방법을 설명하는 방법이다. 이 프로토콜은 빠르고 신뢰할 수 있으며 전문 교육이나 장비가 필요하지 않으며 식물 면역의 유전 적 기초를 이해하는 데 널리 사용됩니다.

서론

병원체에 대하여 인식하고 방어하기 위하여는, 식물은 미생물 관련 분자 패턴 (MAMPs)로 알려져 있는 세포 외부보존된 미생물 분자를 검출하는막 결합한 패턴 인식 수용체 (PRRs)를 진화했습니다 1. 그들의 동족 PR에 MAMPs의 결합은 광범위한 질병 저항성의 결과로 단백질 키나제 매개면역 신호질을 개시합니다 2. PRR 활성화 다음 초기 반응 중 하나는 세포 외 반응성 산소 종 (ROS)의 생산을 촉매 하는 일체형 플라즈마 막 호흡 버스트 OXIDASE HOMOLOG (RBOH) 단백질의 인산화 및 활성화3 , 4.ROS는 면역 신호를 전파하는 보조 메신저뿐만 아니라 직접 항균제로서모두 작용하여 질병 내성을 확립하는 데 중요한 역할을 한다 5. 면역 유도산화 파열의 첫번째 관측은 피토프토라 감염증 접종후리시리의 감자 덩이줄기를 사용하여 기술되었다 6. ROS 생산은 잎 디스크 7, 세포현탁액 배양8,및 프로토 플라스톱 종6을사용하여 여러 식물 종에서 평가되었다. 여기서 설명된 것은 애기장대(애기장대)의 잎 디스크에서 패턴 트리거된ROS 생산을 위한 간단한 방법이다.

MAMP 지각에 대한 반응으로, 활성화된 RBOH 단백질은 과산화수소(H2O)로 변환되는 수퍼옥사이드 라디칼(O2-), 하이드록실 라디칼(•OH) 및 일중염 산소(1 O2)의 생산을 촉매합니다. 2)세포 외공간에서 9. H2O2는 산화제 고추냉이 과산화제(HRP)10의존재 에서 루미놀 계 케미발광에 의해 정량화될 수 있다. HRP는 H2O2를 산화하여 수산화이온(OH−)및 산소 가스(O2)를 발생시키고 루미놀과 반응하여 빛의 광자(10)를 방출하는 불안정한 중간체를 생성한다. 광자 방출은 대부분의 분자 실험실에서 장비의 표준 조각이된 발광을 감지 할 수있는 마이크로 플레이트 리더 또는 이미저를 사용하여 상대 광 단위 (RUS)로 정량화 될 수 있습니다. 40-60분 간격으로 생성된 빛을 측정함으로써, 과도 산화 파열은 유도체 처리 후 2-5분, 10-20분에서 정점에 도달하고, ~60분11후기저 수준으로 되돌아오는 것으로 조기에 검출될 수 있다. 이 시간 동안 생성된 누적 광은 RBOH 단백질(12)의 활성화에상응하는 면역 강도의 척도로서 사용될 수 있다. 편리하게, 이 분석법은 특수 한 장비 또는 성가신 샘플 준비를 필요로하지 않습니다.

MAMP 검출 직후에 피크, 산화 버스트는 MAPK 활성화 및 에틸렌 생산과 함께초기 면역 반응으로 간주됩니다 5. 이후 면역 반응은 전사 재프로그래밍, 구내 폐쇄 및 칼로오스증착 2,5를포함한다. MAMMp에 장기간 노출되면 식물 성장의 억제를 초래하는 에너지 비용이 많이 드는 면역 신호가 지속적으로 활성화되어개발과 면역 13 사이의 절충을 나타냅니다. 패턴 트리거 모종 성장 억제 (SGI)는 널리 애기장대에서 면역 출력을 평가하는 데 사용되며 PRRs14,15를 포함한 면역 신호의 여러 주요 구성 요소의 식별에 필수적이었다 ,16. 따라서, 이 논문은 또한 애기장대에서패턴 트리거 SGI에 대한 분석서를 제시하며, 이에 따라 모종은 8-12일 동안 면역 점구체로 보충된 표준 용지 또는 미디어를 포함하는 다중 웰 플레이트에서 재배된 다음 무게를 측정합니다. 분석 척도를 사용하여

ROS 및 SGI 분석이 PRR 매개 신호를 모니터링하는 데 사용되는 방법을 입증하기 위해 다양한 면역 출력을 나타내는 세 가지 유전자형이 선택되었습니다: (1) 야생 형 애기장대 수탁콜롬비아 (Col-0), (2) 지배적 인 음성 bak1-5 다기능 PRR 공동 수용체 브라시노스테로이드 무감각 1-관련 키나제 1(BAK1)이 면역 신호에 비기능성 인 돌연변이체17,18,및 (3) 열성 cpk28-1 돌연변이가 결여되어 있는 돌연변이체는 조절 단백질 칼슘 의존 단백질 키나제 28 (CPK28) 및 높게 한 면역 트리거 반응을 표시19,20. ROS 및 SGI 세포는 PRR EF-Tu 수용체(EFR)15에의해 애기장대에서 인식된 세균 신장률 투(EF-Tu)의 합성 생산 된 elf18 펩티드 에피토프에 대한 응답으로 제시된다. 이러한 프로토콜은 세균성 운동성 단백질 인 flagellin14 또는 내인성 식물 유도체 단백질 (AtPeps)16과같은 다른 면역 유도체와 함께 사용할 수 있지만 식물 반응성은 식물 반응성에 따라 다르다는 점에 유의해야합니다. 유도자21. 함께, ROS 및 SGI 분석제는 PRR 중재응답의 신속하고 정량적인 평가를 위해 사용될 수 있다.

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프로토콜

1. 면역 유도 다음 애기장대 잎 디스크에서 ROS 버스트의 검출

  1. 식물 성장 및 유지 보수.
    1. 발아를 동기화하기 위해, 애기장대 씨앗을 멸균 0.1% 한천 의 1 mL에 약 50 개의 씨앗을 일시 중단하고 3-4 일 동안 4 °C (빛 없음)에 보관하십시오.
      참고: 야생형 배경 대조군(예를 들어, Col-0)과 높은 및 낮은 면역 출력을 가진 유전형(예: cpk28-1 및 bak1-5)을 계층화하여 내부 대조군역할을 합니다.
    2. 토양에 씨를 뿌리고 표준 단일 조건 (22 °C, 10 h 빛, 150 mE / m2 / s 의 빛 강도 및 65-70 % 상대 습도)에서 발아하십시오.
    3. 약 7 일 후, 포셉을 사용하여 개별 묘목을 새로운 냄비에 이식하고, 전체 로제트 개발을 허용하기 위해 적어도 4cm로 분리하십시오. 유전자형 당 6-12 개의 묘목을 이식하고 표준 단기 조건으로 돌아갑니다. 정기적으로 물과 식물을 비료 (2 주마다 20-20-20 비료의 1 g / L).
  2. 하룻밤 회복을 위해 96 웰 플레이트에 잎 디스크를 수집합니다.
    1. 발아 후 4-5주(그림1A)에서 날카로운 4 mm 생검 펀치를 사용하여 식물당 하나의 잎 디스크를 제거하고, 중간 정맥을 피하고 상처를 제한하는 데 주의를 기울여야 합니다(그림1B). 잎 디스크를 ddH2O의 100 μL을 포함하는 미사용 96웰 루미노미터 플레이트에 놓고, 탈수방지를 위해 아닥시알 면이 위쪽을 향하도록 한다(그림1C). 여러 인리포를 평가하는 경우, 각 인리세터 처리에 대해 동일한 잎에서 잎 디스크 1개제거합니다.
      참고 : 완전히 확장 된 샘플 잎, 로제트의 상단에서 세 번째에서 다섯 번째까지, 그리고 가변성을 제한하기 위해 거의 같은 크기와 나이. 가능하면, 리프 디스크를 하룻밤 회수하기 전에 면도날을 사용하여 반으로 자르고, 이는 유도액에 노출된 표면적을 증가시키기때문에(23).
    2. 잎 디스크 수집 중에 상처에 의해 생성 된 ROS의 간섭을 방지하기 위해 실온에서 하룻밤 복구. 증발을 방지하기 위해 뚜껑이 있는 접시를 덮습니다.
  3. 유도기 처리를 수행하고 ROS 생산을 측정합니다.
    1. 반응 용액을 추가하기 전에 플레이트 리더를 프로그래밍하면 ROS 버스트 개시와 기록된 첫 번째 측정 사이의 시간이 줄어듭니다. 플레이트 판독기에 적합한 상용 소프트웨어를 사용합니다. 이 경우(목표 참조) 설정을클릭하고 LUM96 카트리지 및 운동 읽기 유형을 선택합니다. 영역 읽기 범주를 클릭하고 드래그하여 읽을 웰 또는 전체 플레이트의 하위 집합을 선택합니다. PMT 및 광학 탭에서 타이밍 탭에서 통합 시간을 1,000ms로 설정하고 총 실행 시간을 40-60분으로 설정하고 간격을 2분으로 설정합니다.
    2. 멀티 채널 파이펫을 사용하여 각 우물에서 물을 제거합니다.
      참고: 리프 디스크에 구멍을 뚫지 마십시오.
    3. 100 μM 루미놀, 10 μg/mL HRP, 및 원하는 점구체 농도(예: 1 nM, 10 nM, 100 nM, 또는 1,000 nM)를 함유하는 반응 용액을 멸균 ddH2O에서 10 mL의 용액을 사용하여 96웰 플레이트 1개에 대해 준비합니다.
      참고 : 10 mMM 스톡을 만들고 액체 N 2에서 플래시 동결을 만들기 위해 저결합 튜브에멸균 H2O에 동결 건조 펩티드를 용해시키고 -80 °C에서 보관하십시오. 사용할 준비가 되면, 멸균H2O에 주식을 희석하여 100 μM의 작업 재고를 생성하고 -20°C에 보관한다.
    4. 다중 채널 파이펫을 사용하여 반응 혼합물의 100 μL을 각각의 웰에 분배하고, 동시에22의모든 잎 디스크에 용액을 첨가한다. 유도의 부재에서 기저 ROS 수준을 평가하기 위해 각 유전자형에 대한 제어 반응(무연구)을 포함한다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 가시 스펙트럼의 모든 파장에 대한 광 방출을 즉시 측정합니다.
      참고: 루미놀과 HRP는 빛에 민감한 시약이기 때문에 저조도에서 반응 용액을 준비하고 적용하십시오. 사용하지 않는 한 시약을 얼음 이나 -20°C에 보관하십시오.
    5. 동적 산화 버스트를 포착하기 위해 마이크로 플레이트 리더에서 40-60 분 간격으로 2 분 간격으로 1,000 ms통합 시간으로 발광을 측정합니다 (그림 1D).
      참고: 더 긴 통합 시간을 사용하여 분석 감도11을개선하는 동시에 96웰 플레이트의 모든 샘플을 한 간격 내에서 측정할 수 있습니다.
  4. 데이터 해석.
    1. 각 유전자형에 대해 스프레드시트 응용 프로그램을 사용하여 각 시점에서 평균 광자 수 와 표준 오차를 계산하고 분산형 플롯을 사용하여 ROS 생산을 시간 함수로 표시합니다.
      figure-protocol-1
      여기서 t = 각 시간점
    2. 또는 각 리프 디스크에 대한 광자 수를 합산하고 표준 오차 막대 또는 상자 및 수염 플롯이 있는 막대 그래프를 사용하여 각 유전자형에 대한 이러한 값의 평균을 표시합니다.
      figure-protocol-2

2. 모종 성장 억제 분석

  1. 씨앗을 살균하고 무라시게와 스쿠그 (MS) 접시에 뿌리세요.
    1. 0.8% 한천[w/v]을 함유한 멸균 반강도(0.5x) MS 배지(2.16 g/L)를 준비합니다. 라미나 흐름 후드에 용지(90 x 15mm)를 붓습니다.
    2. 1mL의 70% 에탄올로 2분 동안 세척하여 미세원심지 튜브에 약 100개의 씨앗을 살균하고 흡인에 의해 제거합니다. 40% 표백제 1mL를 넣고 실온에서 17분간 부드럽게 바위를 만드십시오. 흡인으로 표백제를 제거하고 멸균수 1 mL에서 3회 5분 간 세척합니다.
      참고: 대안적으로, 염소 가스 종자 살균 프로토콜24를사용한다.
    3. 파이펫을 사용하여 MS 한천 플레이트에 유전자형당 약 100개의 씨앗을 뿌리고 층류 후드에 마이크로포어 테이프로 밀봉합니다.
      참고 : 나중에 모종을 이식하기가 어려워지기 때문에 씨앗을 가까운 곳에 두지 마십시오.
    4. 발아를 동기화하기 위해 3-4 일 동안 4 °C (빛 없음)에플레이트를 배치하여 종자 계층화 (그림 2A).
  2. 면역 성 유도체 펩티드를 포함하는 48 웰 플레이트에 모종을 이식하십시오.
    1. 층화 후, 발아를 허용하기 위해 3-4 일 동안 짧은 일 조건 (22 °C, 10 h 빛, 150 mE /m2/ s 의 빛 강도 및 65-70 % 상대 습도)에서 빛으로 플레이트를 이동합니다.
    2. 층상 유동 후드에서, 1% 자당을 함유하는 멸균 0.5x MS 액체 매체에 인플루터 펩티드 희석물(0 nM, 1 nM, 10nM, 1,000 nM)을 준비하고, 각 48웰 플레이트에 25 mL의 MS를 사용한다. 웰당 펩타이드를 함유하는 MS 액상 배지 또는 MS 배지의 500 μL을 파이펫팅하여 플레이트를 준비한다. 가능한 경우 플레이트 준비를 위해 반복 파이펫터를 사용하여 공정을 신속하게 처리하십시오.
      참고 : 각 유전자형에 대해, 모종 성장에 내재 된 차이를 설명하기 위해 유도없이 MS에서 모종을 성장.
    3. 멸균 집게를 사용하여 동일한 크기와 나이의 각 우물에 하나의 모종을 조심스럽게 이식하여 모종이나 뿌리에 손상이 없고 뿌리가 미디어에 잠겨 있는지 확인합니다. 각 유전자형에 대해, 각 펩티드 희석에 최소 6-8개의모종을 이식한다(그림 2B).
      참고 : 짧은 뿌리가 조작하기 쉽고 오래된 모종은 덜 최적의 결과를 얻을 수 있기 때문에 발아 후 4 일 에서 이식 모종.
    4. 마이크로 기공 테이프로 밀봉 플레이트와 표준 단일 조건 (22 ° C, 10 h 빛,150 mE / m2 / s 의 빛 강도, 65-70 % 상대 습도)에서 빛으로 다시 이동합니다. 모종은 8-12 일 동안 자랄 수 있습니다.
  3. 백분율 성장 억제를 결정합니다.
    1. 조심스럽게 48 웰 접시에서 묘목을 제거하고 종이 타월에 두드려 건조. 분석 척도에 대한 묘목을 계량하고 값을 기록합니다. 사용 가능한 경우 USB 출력이 장착된 분석 척도를 사용하여 스프레드시트에 새로운 중량 값을 기록합니다. 모종을 계량하기 전에 사진을 찍어 성장 억제를 시각적으로 표시합니다(그림2C).
    2. MS만에서 자란 묘종에 비해 유도체 처리 된 묘목의 퍼센트 성장 억제를 결정하십시오 (그림2D)다음과 같이 :
      figure-protocol-3
    3. 표준 오차 막대가 있는 막대 그래프를 사용하거나 상자 및 수염 플롯을 사용하여 실험 간 분산을 더 잘 표시하여 데이터를 플롯합니다.

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결과

돌연변이 cpk28-119,25 및 bak1-517,18 식물은 산화 버스트와 SGI에서 각각 높고 낮은 면역 반응을 가진 유전자형에 대한 예상 결과를 입증하는 데 사용되었습니다. 야생형 배경 대조군(Col-0)을 기준으로 합니다. 투여량 의존적 효과를 평가하기 위해, elf18의 10배 펩타이드 희석 계열(1-1,000 nM)을 사용하였다. 예상대로 cpk28-1 기능 손실 라인은 Col-0에 비해 누적(그림3A)및 평균(그림3B)ROS 버스트가 더 높았으며, bak1-5는 10nM 및 농도에...

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토론

이 논문은 애기장대에서패턴 트리거 면역 반응을 분석하는 두 가지 방법을 설명하며, 전문 장비를 사용하지 않고 면역 출력을 평가하는 정량적 접근법을 제공합니다. 조합에서, 패턴 트리거된 ROS 및 SGI는 각각 미생물 지각에 대한 초기 및 후기 반응을 평가하는 데 사용될 수 있다.

산화 파열 분석법의 주요 제한은 가변성입니다. 완전히 이해되지 않는 이유로 절대 RlUs는 종종 실험 간의 크기 순서에 따라 다릅니다. 실험 간 가변성이 높기 때문에, 야생형 대조군(예를들어, Col-0)에 더하여 높은(예를들어, cpk28-1)및 낮음(예를들어, bak1-5)을가진 내부 참조 대조군을 포함하는 것이 바람직하다. 그러나, 실험 간의 재현성을 높이기 위해 조치를 취할 수 있습니다. 온도, 습도, 광주 및 광강도와 같은 환경 조건은 복제본 간에 동일해야 합니다. 샘플링 할 때 식물의 나이와 건강도 고려해야합니다. 잎 디스크는 짧...

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감사의 글

우리 실험실에서의 작업은 캐나다의 천연 자원 및 엔지니어링 연구 위원회 (NSERC) 발견 프로그램, 캐나다 혁신 재단 존 R. 에반스 리더의 기금 및 퀸즈 대학을 통해 지원됩니다. KS와 IS는 온타리오 대학원 장학금과 NSERC 캐나다 대학원 장학금(CGS-M)의 지원을 받습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
20-20-20 비료식물 Prod10529물에 1g/L를 섞고 최적의 성장을 위해 2주마다 식물에 적용하십시오.
4mm 생검 펀치메디컬 마트232-33-34-P표면적이 0.125cm^2인 코르크 보어 세트도 사용할 수 있습니다.
뚜껑이 있는 48웰 멸균 플레이트Sigma-AldrichCLS3548
Draft SheidVWRVWR-225AC모든 표준 분석 저울을 성장 감지 분석에 사용할 수 있지만 직접 컴퓨터 출력이 최적입니다.
BioHit mLine 기계식 12 멀티채널 피펫 (30-300 uL)Sartorius725240모든 멀티채널 피펫을 사용할 수 있으며, 필요한 경우 단일 피펫을 사용할 수 있습니다.
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)EZ Biolabcp7211-80C에서 10mM 스톡 펩타이드를 저단백질 결합 튜브에 저장합니다. 해동되면 -20C에서 100uM 작업 재고를 보관하십시오.
집게Fisher Scientific22-327379
양 고추 냉이 과산화 효소Sigma-AldrichP6782순수한 물에 용해하십시오. -20°C에서 보관하고 빛을 피해 보관하십시오.
LuminolSigma-AldrichA8511DMSO에 용해됩니다. -20°C에서 보관하고 빛을 피해 보관하십시오.
Murisage and Skoog 기초 염Cedarlane LabsMSP09-100LT4C에 보관.
토양SunGrow 원예선샤인 믹스 #1다른 토양 유형도 애기장대를 재배하는 데 사용할 수 있습니다. 냄비를 채울 때 물과 섞으십시오.
LUM 모듈이 포함된 SpectraMax Paradigm 다중 모드 마이크로플레이트 리더분자 장치는견적을 요청해야 합니다발광을 검출할 수 있는 모든 플레이트 리더를 이러한 분석에 사용할 수 있습니다.
설탕시그마-알드리치S0389-1KG실온에서 보관하십시오.
백색 폴리스티렌 96웰 플레이트Fisher Scientific07-200-589
가 있는 분석 저울 은 은

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