전기 생리학 전체 셀 패치 클램프를 사용 하 여 시 냅 스 다양성의 평가

Summary

여기, 선물이 급성 뇌 조각에 전체 셀 패치 클램프 전기 생리학을 사용 하 여 기능 시 냅 스 다양성을 평가 하기 위한 프로토콜.

Abstract

중앙 신경 조직에서 뉴런의 쌍 종종 여러 개의 시 냅 스 연락처 및/또는 기능 신경 전달 물질 방출 사이트 (synaptic 다양성)를 형성 한다. 시 냅 스 다 플라스틱 이며 개발에 걸쳐 변화와 다른 생리 적인 조건에서 시 냅 시스 전송의 효능에 대 한 중요 한 결정 되 고. 여기, 우리는 실험 종료 급성 뇌 조각에 전체 셀 패치 클램프 전기 생리학을 사용 하 여 주어진된 postsynaptic 신경에 시 냅 스의 복합성의 정도 추정에 대 한 개요. 특히, 전압 클램프 녹음 자발적인 흥분 성의 postsynaptic 전류 (sEPSCs)의 진폭 및 미니어처 흥분 성의 postsynaptic 전류 (mEPSCs)의 차이 비교 하는 데 사용 됩니다. 이 방법의 뒤에 이론은 이다 다양성을 전시 하는 구심 성 입력 큰, 활동 전위 종속 sEPSCs 각 시 냅 스 접촉에서 발생 하는 동기식 릴리스 때문에 표시 됩니다. 반면에, 활동 전위 독립적인 릴리스 (비동기) 인 작은 진폭 mEPSCs를 생성 합니다. 이 문서는 실험 및 분석 시 냅 스 다양성의 존재의 특성의 집합을 설명 하 고 요구 사항 및 기술의 한계에 설명 합니다. 이 기술은 vivo 영향 서로 다른 뇌 영역에 시 냅 스 연락처의 조직에에서 어떻게 다른 행동, 약리학 또는 환경적 개입 조사에 적용할 수 있습니다.

Introduction

시 냅 스 전송 뉴런 간의 통신에 대 한 근본적인 메커니즘 이며 따라서, 두뇌 기능. 시 냅 스 전송 또한 불안정 하 고 방식 활동-종속 뿐만 modulatory 신호¹응답에서 그 효능을 변경할 수 있습니다. 따라서, 시 냅 스 기능 검사 신경 과학 연구의 주요 초점 되었습니다. 전체 셀 패치 클램프 전기 생리학 있도록 고안 실험적인 디자인 및 데이터 분석, 시 냅 시스 전송의 깊이 있는 생물 및 분자 메커니즘을 이해 하는 다양 한 기술입니다. 일반적으로 사용 되, 아마도 때문에 기술과 개념의 단순 방식은 미니어처 흥분 성의/금지 postsynaptic 전류 측정 (나 / Ipsc) 전압 아래 클램프 구성^{2,3, 4 , 5 , 6}. 개별 mPSCs 연 접 터미널 ^{7에서에서 발표 했다 그들의 각각 신경 전달 물질의 바인딩에 응 postsynaptic ionotropic 수용 체 (예: AMPA 및 GABA_A 수용....}

Protocol

모든 동물 실험 동물 관리 위원회의는 웨스턴 온타리오 대학 동물 관리 지침 (AUP #2014-031)에 캐나다 위원회에 의해 승인 됩니다.

1입니다. 솔루션

1. 조각화 솔루션
   1. 조각화 솔루션의 구성 표 1 을 참조 하십시오.
   2. 20 x 재고 솔루션을 사전에 준비 하 고 최대 1 개월 4 ° C에서 그것을 저장.
   3. 1 x 조각화 솔루션, NaHCO₃, 포도 당 및 자당 ddH₂O, 해산 하 고 20 배 재고를 추가 합니다. 315-320 mOsm 사이 osmolarity 확인 하 고 더 이상 1 주 4 ° c.에 대 한 솔루션을 저장
   4. 솔루션을 조각화의 100 mL와 함께 두 개의 비 커와 parafilm으로 그들을 커버. 솔루션 (-80 ° C 냉동 고에서 약 20 분) 냉동 부분적으로 된다 때까지 솔루션을 냉장고에 침착 해. 얼음에 95% O₂/5% CO₂ 20 분에 대 한 솔루션을 조각화의 두 비 커를 거품 가스 분산 관을 사용 하 여.

Results

위의 프로토콜 전체 셀 패치 클램프 전기 생리학을 사용 하 여 예를 들어 마우스 hypothalamic 뉴런을 사용 하 여 시 냅 스 복합성의 정도 검사 하는 방법을 설명 합니다. 이 슬라이스 준비 기술은 건강 한 가능한 세포가 없는 부 어 막 또는 핵 (그림 1) 항복 한다. 프로토콜의 각 단계 조직 및 녹음의 품질의 건강을 위해 중요 하다.

그림 1: 건강 하 고 건강에 해로운 조직 다음 슬라이스 준비. 40 x 확대 차동 간섭 콘트라스트 광학 아래 PVN의 전기 생리학 준비를 슬라이스. 빨간 화살촉 건강 한 세포를 나타내고 검은 화살촉 건강에 해로운 .......

Discussion

성공적인 패치 클램프 전기 생리학 실험에 대 한 한 가지 중요 한 요구 건강 한 조각/셀을 얻는 이다. 우리의 설명된 프로토콜 hypothalamic 조각 PVN의 뉴런을 포함 하는 최적화 되어 있습니다. 다른 뇌 영역 해야 수정 솔루션 및 조각화 방법^21,22,,2324. 기록, 그것은 막 저항 등 셀 속성을 지속적으로 모니터링 하 여 안정적인 녹음을 허용 하도록 중요 한 커패시턴스 및 액세스 저항. 액세스 저항 증가 EPSC 진폭을 감소 하 고 따라서 진폭 측정을 혼동 수 있습니다. 따라서, 20 m ω를 초과 하거나 녹음 하는 동안 20% 이상 증가 액세스 저항 값으로 셀이 삭제 됩니다. 유사 하 게, 감소에 (또는 낮은) 막 저항 가난한 공간-클램프 될 수 있습니다 하 고, 따라서, 진폭을 줄일.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL 주사기	BD	309659
10 블레이드	Fisher Scientific/기타	35698
22 블레이드	VWR/기타	21909-626
22 μ M 주사기 필터	Milipore	09-719-000
Adson foreceps	Harvard Instruments	72-8547
각진 날카로운 가위	Harvard Instruments	72-8437
Clampex	Molecular Devices	pClamp 10
양날 블레이드	VWR	74-0002
여과지	Sigma/기타	1001090
파인 붓	Fisher/various	15-183-35/various
Gas Dispersion Tube VWR		LG-8680-120
Isoflurane	Fresenius Kabi/others	M60303
Krazy glue	various
Mini analysis	Synaptosoft	MiniAnalysis 6
Osmomoter	Wescor Inc	모델 5600
Parafilm	Sigma	PM-996
파스퇴르 피펫	VWR	14672-200
pH 미터	Mettler Toledo	FE20-ATC
고무 전구	VWR	82024-550
메스 핸들 No. 3	Harvard Instruments	72-8350
메스 핸들 No. 4	Harvard Instruments	72-8356
단일 가장자리 블레이드	VWR	55411-050
Vibratome 슬라이서	Leica	VT1200S
정수 시스템	Millipore	Milli-Q Academic A10
웰 플레이트 뚜껑	Fisher / various	07-201-590 / 다양
< 강한>화학 물질 / 시약< / 강한>
4-AP	시그마	275875
BAPTA	분자 프로브	B1204
CaCl2*2H2O	시그마	C7902
CdCl2	sigma	202908
DNQX	Tocris	189
EGTA	시그마	E3889
포도	시그마	G5767
HEPES	시그마	H3375
K2-ATP	시그마	A8937
KCl	시그마	P9333
K-글루코네이	트 시그마	G4500
MgCl2*6H2O	시그마	M2670
분자 생물학 등급 물	시그마	W4502-1L
Na3GTP	시그마	G8877
	NaCl Bioshop	SOD001.1
Na-글루코네이	시그마	S2054
NaH2PO4	Sigma	71504
NaHCO3	Sigma	S6014
피크로 톡신	시그마	P1675
SrCl	시그마	255521
자당	Bioshop	SUC507.1
TTX	알라몬 연구소	T-550
yDGG	토크리스	6729-55-1