방법 논문

VirWaTest, 물 샘플에서 바이러스 검출을 위한 사용 시점 방법

DOI:

10.3791/59463

⸱

2019년 5월 11일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Viruses Contaminants of Water and Food (VIRCONT), Department of Genetics, Microbiology and Statistics, Section of Microbiology, Virology and Biotechnology, University of Barcelona, 2Grupo de Investigación Biodiversidad, Medio Ambiente y Salud (BIOMAS), Facultad de Ingenierías y Ciencias Agropecuarias (FICA), Ingeniería en Biotecnología, Universidad de las Américas, 3Municipal Laboratory - Waters of Mataró, 4GenIUL

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서 우리는 VirWaTest를 제시, 이는 사용 시점에서 물 샘플에서 바이러스의 농도 및 검출을위한 간단하고 저렴하고 휴대용 방법입니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

인간과 동물에 의해 배설된 바이러스는 수원을 오염시키고 이 물이 음주, 식품 관개, 세척 등에 사용될 때 인간의 건강에 위험을 초래할 수 있습니다. 고전적인 대변 박테리아 표시기는 항상 바이러스 성 병원체의 존재를 검사하지 않으므로 바이러스 성 병원체 및 바이러스 지표의 검출은 특히 인도주의적 시나리오및 지역에서 위험 완화 조치를 채택하기 위해 관련이 있습니다. 수인성 바이러스 발병이 빈번한 경우.

현재, 대변 지표 박테리아 (FIB)의 정량화를 허용하는 몇몇 상업적인 시험은 사용의 시점에서 시험을 위해 유효합니다. 그러나, 이러한 상업적 인 테스트는 바이러스의 검출을 위해 사용할 수 없습니다. 환경 용수 샘플에서 바이러스를 검출하려면 몇 리터를 더 작은 부피로 농축해야 합니다. 더욱이, 일단 집중되면, 바이러스의 검출은 바이러스 게놈의 핵산 추출 및 분자 검출(예를 들어, 중합효소 연쇄 반응[PCR]-기반 분석법)과 같은 방법에 의존한다.

여기에 설명된 방법은 10 L 물 샘플에서 바이러스의 농도뿐만 아니라 사용 시점에서 바이러스 성 핵산의 추출을 간단하고 휴대용 장비로 허용합니다. 이를 통해 여러 바이러스에 대한 사용 시점에서 물 샘플을 테스트할 수 있으며, 인도주의 적 시나리오뿐만 아니라 장착 된 실험실을 사용할 수없는 모든 상황에서 유용합니다. 양자택일로, 방법은 추가 분석을 위해 상온에서 실험실에 물 견본및 농축물의 선적에 존재하는 바이러스를 집중시키는 것을 허용합니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

인도주의적 비상 사태의 첫 단계 동안 깨끗한 물 공급, 위생 및 위생에 대한 접근은 영향을받는 사람들의 생존에 매우 중요합니다. 따라서 수질 모니터링은 수인성 발생을 방지하는 것이 최우선 과제입니다. 오염된 물은 질병의 기원이 빈번하게 알려져 있지만, 기존의 실험실 방법의 가용성에도 불구하고 E형 간염 바이러스 (HEV)와 같은 바이러스 발병의 원인을 결정하는 것은 종종 어렵습니다. 수질의 제어는FIB1,2,3,4의정량화를 기반으로합니다. 그러나, FIB의 부재와 로타바이러스(RoV), 노로바이러스(NoV) 또는 HEV5,6과같은 바이러스 성 수인성 병원균의 존재 사이에 상관관계가 없다는 것이 광범위하게 문서화되어 있다. 따라서, FIB에 근거한 수질 기준을 사용하면 수인성 바이러스 성 병원균의 존재와 관련된 위험의 과소 평가가 발생할 수 있습니다. 인간 아데노바이러스(HAdV) 또는 특정 병원체와 같은 지표 바이러스의 감시는 바이러스 성 병원체에 대한 노출을 정의하고인간 감염의 잠재적 원인을 식별하는 데 도움이 될 것입니다 7,8, 9,도 10 및 위생 대책 의 효능을 검증하는데 11.

지금까지 이러한 시나리오에서 바이러스를 탐지하는 것은 숙련된 직원과 복잡한 물류에 의존했습니다. VirWaTest (virwatest.org)는 사용 시점에서 물 샘플에서 바이러스의 농도 및 후속 검출을위한 간단하고 저렴하고 휴대용 방법의 개발을 목표로한다.

바이러스 농도는 10 L 물 샘플의 유기 응고 원리에 기초하며, 바이러스가12,13더 작은 양으로 회수됩니다. flocs는 수집되고 바이러스를 용해하고 2 주 이상 실온에서 저장될 때 핵산이 분해되는 것을 방지하는 완충제에 추가됩니다.

핵산 추출 방법은 핵산이 흡착되는 자기 입자의 사용을 기반으로합니다. 그들은 입자가 부착하는 자기 파이펫을 사용하여 한 세척 버퍼에서 다른 세척 버퍼로 마지막으로 용출 버퍼로 전송될 수 있습니다. 얻어진 바이러스 성 핵산 현탁액은 PCR에 근거를 둔 분자 방법을 사용하여 검출이 수행될 수 있는 기준 실험실로 발송될 수 있습니다. 각 핵산 추출에 대해, 2개의 다른 양은 견본에 기인한 효소 억제를 배제하기 위하여 시험됩니다. 또는 최소한의 장비 가용성으로 PCR 테스트를 사용 지점에서 실행할 수 있습니다. 전체 프로세스는 전원 공급 장치와 독립적으로 수행되도록 설계되었습니다(그림 1).

인간에 의해 배설되고 고농도의 폐수 샘플에서 발견되는 HAdV를 검출하는 정량적 PCR 분석은 사용 시점에서 실행되도록 조정되었습니다. HAdV는 인간의 배설물 바이러스 지표로 사용됩니다. MS2 박테리오파지의 정량화를 위한 PCR은 MS2가 VirWaTest에서 공정 제어로 사용되기 때문에 적응되었습니다. 이 방법은 관심 있는 바이러스의 검출을 위해 사용자 정의할 수 있다.

개발 후 VirWaTest 메서드는 중앙 아프리카 공화국 (RCA) 및 에콰도르에서 두 가지 다른 설정에서 사용자에 의해 적용 되었습니다., 실제 상황에서 프로토콜의 응용 프로그램에 대 한 피드백을 제공 하 고.

우리의 지식에, 이것은 어떤 전원 공급 장치, 대형 장비 및 동결 / 냉각 조건과 관계없이 사용 시점에서 바이러스의 농도 및 검출을 허용하는 첫 번째 절차입니다. 강력한 결과를 얻으려면 각 물 샘플의 두 개의 복제를 수집하는 것이 좋습니다.

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프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 준비 및 포장

참고: 포장할 재료/장비는 표1에 나와 있습니다. 장갑을 사용하여 공정 제어, 농도 시약, 핵산 추출 시약 및 검출 시약에 필요한 시약을 처리합니다. 핵산 추출에 필요한 시약을 처리하기 위해 보호 안경을 착용하십시오.

  1. 공정 제어
    1. ISO 절차 10705-1:199514에따라 실험실에서 1 x 1010 PFU/mL을 포함하는 MS2 박테리오파지 스톡 컬쳐(미국식 문화 컬렉션[ATCC] 15597-B1)를 준비한다.
    2. 이어서, 10 mL 튜브내로 1 x 108 PFU를 함유하는 튜브당 현탁액의 10 μL을 알리쿼트하고 37°C에서 물이 증발하게 한다. 물 샘플 당 하나의 튜브를 사용합니다.
    3. 또한, 수집된 샘플당 멸균 증류수 10mL를 함유하는 튜브 1개를 준비합니다.
  2. 농도 시약
    1. 미리 flocculated 탈지 우유 용액 (PSM)를 위해, 5 개의 10 L 물 견본을 집중하기 위하여 다음 양을 이용하십시오.
      1. 탈지 우유 5g이 들어있는 플라스틱 튜브를 준비합니다.
      2. 바다 소금 16.66g이 들어있는 지퍼 비닐 봉지를 준비합니다.
      3. 증류수 500mL가 들어있는 플라스틱 병을 준비합니다.
    2. pH 조정에 필요한 시약을 준비합니다. 다음 양을 사용하여 PSM의 pH및 5개의 10 L 물 샘플의 pH를 조절한다.
      1. 10 mL 플라스틱 튜브에 구연산 1-하이드레이트 5 g을 넣습니다.
        주의: 구연산은 눈과 접촉할 때 심각한 자극을 일으킵니다. 이런 일이 발생하면 몇 분 동안 물로 조심스럽게 눈을 헹구하십시오. 자극이 지속되면 의사의 조언을 구하십시오.
      2. 수산화 나트륨 2 g을 10 mL 플라스틱 튜브에 넣습니다.
        주의: 수산화나트륨은 심한 피부 화상과 눈 손상을 일으킬 수 있습니다. 삼켰을 경우 입을 헹구세요. 구토를 유도하지 마십시오. 눈에 닿으면 몇 분 동안 물로 조심스럽게 헹구하십시오. 그런 다음 의사의 조언을 구하십시오.
      3. 멸균 증류수 25mL를 플라스틱 용기에 넣습니다.
      4. 멸균 증류수 50mL를 플라스틱 용기에 넣습니다.
    3. 응집에 사용되는 샘플 컨디셔닝 봉지, 핵산을 보존하는 데 사용되는 방부제 용액, 폐기된 물과 물질을 중화하기 위해 중화 된 봉지를 준비하십시오. 시험할 각 10L 물 샘플에 대해 다음 양을 사용하십시오.
      1. 바다 소금 15g과 구연산 1g 8g을 컨디셔닝 봉지에 지퍼 비닐 봉지에 넣습니다.
      2. 5 mL 튜브에 2mL의 라시스 버퍼 (재료 표)와 핵산 보존제 (재료 표)의 0.3 mL를 추가합니다.
        주의: 용해 완충제에는 구니딘 티오티아네이트와 트리톤 X-100이 함유되어 있다. 산과의 접촉은 독성 가스를 해방하고, 삼키거나, 흡입하거나, 피부에 접촉하면 유해합니다. 삼켰을 경우 입을 헹구세요. 구토를 유도하지 마십시오. 피부에 닿으면 충분한 물로 씻으시고 씻어주세요. 그런 다음 의사의 조언을 구하십시오. 핵산 보존제는 피부와 눈의 자극을 유발하며 삼키면 유해합니다. 피부나 눈과 접촉하면 몇 분 동안 풍부한 물로 헹구어 주세요. 어떤 경우에, 특히 삼키고 기분이 좋지 않은 경우 의사의 진찰을 받으십시오.
      3. 40g의 세제 파우더를 지퍼 비닐 봉지에 넣습니다.
        주의: 파우더 세제는 눈 자극을 유발합니다. 눈과 접촉하면 몇 분 동안 풍부한 물로 헹구어 두지 하십시오. 자극이 지속되거나 삼켰을 경우 의사의 진찰을 받으십시오.
  3. 핵산 추출 시약
    1. 자기 입자 50 μL(재료 표)과 에탄올 1 mL96 %를 결합 버퍼를 구성하는 5 mL 튜브에 넣습니다.
      주의: 자기 입자 버퍼에는 산이나 중금속 이온과 접촉할 때 독성 가스를 형성하는 나트륨 아지드가 포함되어 있으며, 섭취하거나 피부에 닿을 때 독성이 있습니다. 섭취하거나 피부에 닿으면 입이나 피부를 풍부한 물로 헹구고 의사의 진찰을 받으십시오. 에탄올은 인화성이 높은 액체 및 증기이며 심각한 눈 자극을 일으킵니다. 열, 뜨거운 표면, 스파크 및 기타 발화원을 피하십시오. 피부나 눈과 접촉하면 풍부한 물로 헹구어 주세요. 다량의 물을 섭취하거나 흡입한 경우, 신선한 공기로 외부로 나가라. 어쨌든 의사의 진찰을 받으십시오.
    2. 세척 버퍼 1, 2 및 3의 500 μL, 600 μL 및 200 μL을 각각 3 개의 2 mL 튜브에 추가합니다.
      주의: 세척 완충제에는 구니디늄 티오치아네이트와 구니디늄 염화물이 함유되어 있으며, 흡입또는 삼키거나 피부와 눈을 자극할 경우 유해합니다. 산과의 접촉은 매우 독성 가스를 방출합니다. 피부나 눈과 접촉하면 풍부한 물로 헹구세요. 삼키면 풍부한 물로 입을 헹구세요. 구토를 유도하지 마십시오. 항상 의사의 조언을 구하십시오.
    3. 0.5 mL 튜브에 용출완충제(재료 표)를 120 μL 추가합니다.
  4. HAdV 및 MS2 검출 시약
    참고: 8-well 열자전거러를 사용하는 경우 각 PCR 분석에서 두 가지 다른 핵산 추출 반응을 동시에 분석할 수 있습니다. 모든 PCR 아세에 대해, 1.5 mL 튜브에 aliquoted 분자 생물학 물을 준비합니다.
    1. HAdV 감지
      1. 22.5 μM AdF 포워드 프라이머10 μL, 22.5 μM AdR 역프라이머 10 μL, 11.25 μM AdP프로브의 5 μL을 함유하는 혼합물을 준비한다(표 2).
      2. 2.5 μL의 혼합물을 튜브 스트립의 튜브 1 ~ 8에 추가합니다. 실온에서 건조시키고 튜브를 닫고 빛으로부터 보호하십시오.
      3. 튜브 1-5 및 튜브 6-8 : 두 개의 스트립으로 나누어 스트립을 잘라.
      4. 증폭된 HAdV 영역의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 현탁액의 직렬 희석을 준비한다. 1 x 105,1 x 10 7, 1x 109 GC/mL을 튜브 6-8에 포함하는 1 μL의 공기 건조.
        참고: 프라이머, 프로브 및 공기 건조 현탁액이 들어 있는 튜브를 빛으로부터 보호하십시오.
    2. MS2 감지
      1. 25 μM 펙손-2F 포워드 프라이머10 μL, 25 μM 펙손-2R 역프라이머의 10 μL, 25 μM PecP-2프로브의 2.5 μL을 함유하는 혼합물을 준비한다(표 2).
      2. 2.25 μL의 혼합물을 튜브 스트립의 튜브 1 ~ 8에 추가합니다. 실온에서 건조시키고 튜브를 닫고 빛으로부터 보호하십시오.
      3. 튜브 1-5 및 튜브 6-8 : 두 개의 스트립으로 나누어 스트립을 잘라.
      4. 1.4.1.4 단계에서와 같이 진행하지만 대신 MS2용으로 설계된 표준 서스펜션을 사용하십시오.

2. 바이러스 농도

참고: 샘플 수집, 시약 준비, 응고, 플록 수거 및 폐기물 처리 절차 중에 항상 장갑을 사용하십시오. 시약 준비 절차 중에 보호 안경을 착용하십시오.

  1. 샘플 수집
    1. 뚜껑이 있는 평평한 바닥 양동이에 10L의 물 샘플을 모읍시다. 각 샘플에 대해 최소 2개의 복제를 수집합니다.
      참고: 투명 버킷을 사용하여 펠릿을 시각화하는 것이 중요합니다. 물 샘플에 부유 물질 (예 : 모래, 조류)이 포함되어 있는 경우 퇴적물을 한 다음 새 양동이에 물 상류물을 수집합니다.
    2. 각 물 샘플에 대해 수집된 볼륨과 위치 및 수집 날짜를 등록합니다.
    3. 배터리에 연결된 마그네틱 교반기를 버킷 지지대 아래에 놓고 물 샘플이 들어 있는 버킷을 지지대에 놓습니다.
      참고: 신선한 장소에서 평평한 표면을 찾아 직사광선이 들어오는 물 샘플을 담은 양동이를 보관하십시오.
  2. 시약 준비
    1. pH 조정 시약
      1. 구연산 분말과 수산화 나트륨 펠릿을 각각 증류수 25 및 50 mL을 함유 한 냄비에 붓습니다.
      2. 구연산과 수산화 나트륨이 완전히 녹을 때까지 손으로 부드럽게 흔들어 주세요.
        주의: 수산화 나트륨 펠릿에 물을 붓지 마십시오. 대신, 물에 수산화 나트륨 펠릿을 부어.
    2. 전향성 탈지 우유
      1. 스탠드업 백을 마그네틱 교반기 위에 놓고 500 mL의 증류수를 붓습니다. 교반 자석을 가방 안에 넣고 마그네틱 교반기의 켜기.
      2. 바다 소금 봉지와 탈지 된 우유 튜브의 내용물을 스탠드 업 백에 붓고 중간 속도로 5 분 동안 저어서 녹입니다.
      3. 파스퇴르 파이펫을 사용하여 PSM 용액에 3 mL의 구연산을 추가하여 pH가 3.4에서 3.6 사이에 있는지 확인합니다. pH 표시기 스트립을 사용하여 PSM 용액의 pH를 측정합니다. pH가 3.5에 가까워질수록 더 적은 양의 구연산과 수산화나트륨을 첨가합니다.
      4. 마그네틱 교반기의 끄기와 플록이 보이는지 확인합니다. 손전등을 사용하여 flocs를 시각화하는 데 도움이됩니다.
  3. 응집
    1. 교반 자석을 물에 떨어뜨리고 마그네틱 교반기의 속도를 최대 속도로 설정한 다음 켭니다. 교반 자석이 회전하기 시작했는지 확인합니다.
    2. 공정 제어 튜브에 증류수 10mL를 추가합니다. 튜브를 몇 번 반전하여 바이러스 성 스톡을 재수화하고 용액을 물에 붓습니다.
    3. 한 샘플 컨디셔닝 봉지의 내용물을 물에 붓고 5 분 동안 저어줍니다.
    4. pH 표시기 스트립을 사용하여 물 샘플의 pH를 측정합니다. pH가 3.4에서 3.6 사이인지 확인하기 위해 물 샘플에 구연산 또는 수산화 나트륨 몇 방울을 추가하십시오. pH가 3.5에 가까워질수록 더 적은 양의 구연산과 수산화나트륨을 첨가합니다.
    5. 100 mL 컨테이너를 사용하여 PSM 용액의 100 mL를 추가합니다.
    6. 뚜껑으로 양동이를 밀봉하고 자기 교반기의 최소 속도를 설정하고 물을 8 시간 동안 저어 둡니다.
    7. 마그네틱 교반기를 끄고 물이 적어도 5시간 동안 남아 서 플록이 가라앉을 수 있도록 하십시오.
  4. 플록 컬렉션
    1. 파이펫 컨트롤러, 파이펫 2개, 플라스틱 튜브로 구성된 사이펀 시스템을 구축하여 플로크에서 물을 배출하기 위해 상급물을 흡인합니다.
      1. 파이펫 컨트롤러에 10mL 테이프 엔드 파이펫을 부착합니다. 그런 다음 파이펫 끝을 플라스틱 튜브에 부착합니다.
      2. 핀셋을 사용하여 10mL 오픈 팁 파이펫의 필터를 제거하고 플라스틱 튜브에 파이펫을 부착합니다.
    2. 빈 양동이를 바닥에 놓습니다.
    3. 오픈 팁 파이펫의 끝을 물에 담그고 있습니다. flocs를 방해하지 않도록 수면에 가까이 두십시오. 테이프 엔드 파이펫에 도달할 때까지 물 상류물을 흡인합니다.
    4. 테이프 엔드 파이펫에 부착된 끝으로 플라스틱 튜브를 꼬집고 파이펫에서 분리합니다.
    5. 튜브를 빈 양동이에 놓습니다. 물이 빈 양동이로 흐르게하기 위해 튜브의 압력을 놓습니다.
    6. 플라스틱 튜브를 꼬집어 수위가 교반 자석에 도달하려고 할 때 물 흐름을 중지하고 양동이에서 파이펫을 이동합니다.
    7. 양동이를 흔들어 플록을 다시 일시 중단하고 500mL 스탠드업 비닐 봉지에 붓습니다. flocs가 1 시간 더 정착할 수 있도록 하십시오.
    8. 50mL 파이펫과 수동 파이펫 컨트롤러를 사용하여 물 상급물을 조심스럽게 흡인하여 플로크를 방해하지 않도록 하십시오.
    9. 100 mL 파이펫을 사용하여 flocs를 흡인하고 50 mL 의 원심 분리튜브로 옮김을 전달합니다. 시료 농축액의 최종 부피를 기록하고 1 mL을 파저피펫을 사용하여 방부제를 함유하는 5 mL 튜브로 옮김을 넣습니다.
      참고 : 농축 된 샘플의 최종 부피를 가능한 한 정확하게 측정하고 등록 할 수 있도록 원심 분리튜브를 졸업하는 것이 중요합니다.
    10. 현장에서 핵산 추출을 수행합니다. 또는 바이러스를 함유하는 방부제를 최대 15일 동안 20-30°C에 저장하거나 추가 분석을 위해 기준 실험실로 발송합니다.
  5. 폐기물 처리 및 자재 재사용
    1. 버려진 물을 포함하는 양동이에 중화제 봉지의 내용을 추가합니다. 물을 섞은 다음 30 분 동안 그대로 둡니다.
    2. 처리된 물을 일반 폐기물로 폐기합니다.
    3. 파이펫과 플라스틱 튜브를 버킷 내부에 넣습니다. 양동이에 물을 채우고 중화제 봉지 한 봉지의 내용물을 붓습니다.
    4. 적어도 30 분 동안 씻어 살균하고 남은 중화제를 제거하기 위해 풍부한 깨끗한 물로 헹구십시오.

3. 핵산 추출

참고: 장갑을 착용하고 핵산 추출 시 항상 보호 안경을 착용하십시오.

  1. 마그네틱 파이펫 작동
    1. 추출을 수행하기 전에 자기 파이펫의 작동에 익숙해지십시오.
  2. 핵산 추출
    1. 바인딩 버퍼, 세척 버퍼 및 용출 버퍼 : 왼쪽에서 오른쪽으로 랙에서 추출에 필요한 시약을 포함하는 튜브를 정렬합니다. 분석되는 샘플 또는 복제물의 수에 따라 적절한 튜브 수를 설정합니다.
    2. 일회용 파스퇴르 피펫을 사용하여 결합 완충액을 함유하는 튜브에 샘플 농축액 1 mL을 이송한다. 튜브를 8x 에서 10x로 반전하여 용액을 균질화합니다.
    3. 태양열 궤도 또는 수동으로 사용하여 지속적으로 혼합하면서 실온에서 10 분 동안 용액을 배양하십시오.
    4. 세 개의 세척 버퍼에 재사용할 수 있는 마그네틱 파이펫과 클린 팁을 사용하여 자기 입자를 수집합니다.
    5. 세척 완충제 1의 500 μL을 포함하는 관으로 자기 입자를 풀어 놓습니다. 30s의 팁으로 용액을 부드럽게 흔들어 서 씻고 수집하십시오.
    6. 세척 버퍼 2의 600 μL을 포함하는 튜브에 자기 입자를 전송합니다. 30s의 팁으로 용액을 부드럽게 흔들어 서 씻고 수집하십시오.
    7. 세척 버퍼 3의 200 μL을 포함하는 튜브에 자기 입자를 전달한다. 30s의 팁으로 용액을 부드럽게 흔들어 서 씻고 수집하십시오.
    8. 용출 버퍼를 포함하는 튜브에 자기 입자를 방출하고 팁을 폐기.
    9. 태양열 궤도를 사용하여 지속적으로 혼합하면서 실온에서 5 분 동안 용액을 배양하십시오.
      참고: 용출 버퍼에 자기 입자를 혼합하는 것은 매우 중요한 단계입니다. 궤도가 결여된 경우, 인큐베이션 시간 동안 지속적으로 손으로 혼합한다.
    10. 마그네틱 파이펫의 팁을 새 파이펫으로 교체하고 용출 버퍼에서 자기 입자를 수집합니다. 분자 검출 방법을 방해할 수 있기 때문에 용출 버퍼에서 자기 입자를 완전히 제거해야 합니다.
    11. 파티클이 부착된 팁을 폐기합니다. PCR 분석을 진행하거나 용출 버퍼를 기준 실험실로 배송하거나 용출 버퍼를 4°C에서 저장하여 추가 분석을 진행합니다.

4. 배터리 작동 식 8 튜브 실시간 열자전거로 바이러스 검출

참고: 핵산 검출 절차 중에 장갑을 착용하고 항상 보호 안경을 착용하십시오. 교차 오염을 방지하기 위해 새로운 PCR 실험을 수행할 때 장갑을 새 장갑으로 교체하십시오.

  1. HAdV 정량 PCR
    1. 튜브 2, 4 및 5에 14 μL의 뉴클레아제 없는 물을 넣습니다.
    2. 튜브 1-5에 4 μL의 PCR 혼합물을 추가합니다.
    3. 샘플 A에서 튜브 1에 14 μL의 핵산 추출을 추가하고 샘플 B에서 튜브 3에 14 μL을 추가합니다.
    4. 샘플 A에서 튜브 2에 추출된 핵산 2 μL을 추가하고 샘플 B에서 튜브 4로 2 μL을 추가합니다. 5튜브 스트립을 닫습니다.
    5. 튜브 6, 7 및 8에 14 μL의 뉴클레아제 없는 물을 추가합니다.
    6. 튜브 6, 7 및 8에 이 혼합물의 4 μL을 넣고 닫습니다.
    7. 두 스트립을 열전자전거에 넣고 적절한 실행을선택합니다(표 3).
    8. 물 튜브를 버리고 추출 된 핵산을 냉동실에 보관하거나 가능하면 두 번째 테스트를 수행해야하는 경우 빛으로부터 보호되는 신선한 장소에서 보관하십시오.
    9. 마이크로파이펫, 랙, 작업 재료 및 모든 재료를 핵산 클리너로 올바르게 청소하고 사용된 팁, 장갑 및 튜브가 들어있는 비닐 봉지를 폐기하십시오.
      주의: 핵산 제거제는 매우 인화성 액체 및 증기입니다. 스프레이 미스트에서 호흡하지 말고 눈이나 피부에 액체가 닿지 않도록 하십시오. 그렇지 않으면 즉시 풍부한 물로 헹구고 의사의 진찰을 받으십시오.
    10. 결과를 수집하고 얻은 데이터를 분석합니다.
  2. MS2 정량적 PCR
    1. 튜브 2, 4 및 5에 14 μL의 뉴클레아제 없는 물을 넣습니다.
    2. 4 μL의 PCR 혼합물과 0.5 μL의 역전사 효소를 튜브 1-5에 첨가합니다.
    3. 샘플 A에서 튜브 1에 14 μL의 핵산 추출을 추가하고 샘플 B에서 튜브 3에 14 μL을 추가합니다.
    4. 샘플 A에서 튜브 2에 추출된 핵산 1 μL을 추가하고 샘플 B에서 튜브 4로 1 μL을 추가합니다. 5튜브 스트립을 닫습니다.
    5. 튜브 5, 6, 7 및 8에 15.5 μL의 뉴클레아제 없는 물을 넣고 닫습니다.
    6. 4 μL의 PCR 혼합물과 0.5 μL의 역전사 효소를 튜브 6, 7 및 8에 첨가합니다.
    7. 두 스트립을 열전자전거에 넣고 적절한 실행을선택합니다(표 3).
    8. 4.1.8 단계 4.1.10에 설명된 대로 진행합니다.

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결과

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방법 개발

이 절차는 GenIUL과 옥스팜 인터몬의 협력으로 물과 식품의 바이러스 오염 물질 실험실에서 개발되었습니다. 그것은 세 가지 단계로 구성되어 있습니다. 제 1, 바이러스 입자 농도는, 앞서 설명한12,17,18에기재된 탈지 우유 응집 방법의 적응이다. 원래 방법은 전원 공급 장치와 독립적으로, 더 간단하고 원심 분리 단계없이 수정되었습니다.

VirWaTest 농도 방법의 회수는 HAdV 및 MS2 박테리오파지 스파이크 지하수 샘플에서 시험하였다. Vi...

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토론

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VirWaTest 방법은 경험이 없는 사용자가 사용하는 시점에서 물 샘플에서 바이러스 및 핵산 추출의 농도를 가능하게 합니다. 저렴하고 빠르며 간단한 프로토콜입니다. 농도는 낮은 pH및 높은 전도성 조건이 탈지 우유 단백질이 바이러스 흡착을 흡착하는 flocs로 집합하게하는 탈지 우유를 사용하여 유기 응고의 원리에 기초한다. flocs 퇴적물은 수집하기 쉬우므로 10L의 물을 농축할 수 있는 반면, 전통적인 초원심분리는 큰 물의 양을 처리할 수 없습니다.

이 방법은 배터리 작동 식 자기 교반기 이외의 전기 장비를 사용하지 않고 샘플링 지점에서 실행 가능하기 위해 수정되었습니다. 물 여과에 근거를 둔 몇몇 그밖 접근은 바이러스의 사격량에 적응되고 또한 사용의 시점에서 수행될 수 있습니다. 그러나, 물 샘플에 존재하는 부유 물질은 종종 필터를 막힘; 따라서, 이러한 시스템에 집중될 수 있는 작은 부피는 심각한 한계이다.

이것은 샘플의...

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

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VirWaTest는 ELHRA의 HIF (인도주의 혁신 기금) 프로그램에 의해 투자 된 연구 프로젝트 (인도주의 적 지원을위한 학습 및 연구 강화). 저자는 이 연구에서 친절하게 협력한 WASH 팀을 인정합니다. 에콰도르의 샘플 분석은 옥스팜 에콰도르와 디레시온 드 인베티가시오네스 드 라 유니버시다드 데 라스 아메리카스(AMB)의 지원을 받았습니다. BRT.17.01). S. 보필 마스는 바르셀로나 대학의 세라 헌터 펠로우입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
5x HOT FIREPol 프로브 qPCR Mix Plus (ROX)Solis BioDyne08-14-00001포함 Solis Biodyne의 5x HOT FIREPol 프로브 qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 반응
8-마이크로튜브 스트립 캡포함 dD Biolab840637로우 프로파일, 얇은 벽, 정량적 및 질적 PCR
배터리에 적합, 마그네틱 스티러용 전원 어댑터GenIUL90001167412V 자동차 전원 포함 어댑터
버킷 지지대GenIUL900011648알루미늄 지지대
10 LCater4You10LTR폴리프로필렌, 변조 방지, 투명 색상
원심분리기 튜브, 50 mLLabBoxCTSP-E50-050폴리프로필렌, 멸균, 눈금, 스커트 포함
구연산 1-수화물, 500 gPanReac AppliChem1410181211Pure, 제약 등급, 1 킬로그램
투명 PET 병LabBoxFPET-500-088투명 색상, PET, 캡 미포함
Difco 탈지유, 500gBecton Dickinson232100탈수
DNA/RNA 실드, 250mLZymo ResearchR1100-250DNA/RNA 보존 배지, 250mL
Easy9 피펫 컨트롤러LabBoxEAS9-001-0010.3 &뮤; m 필터, 0.1 - 100 mL의 피펫, 오토클레이브 가능 실리콘 피펫 홀더
Eppendorf Tube, 0.5 mLEppendorf0030121023Polypropilene, Safe-Lock
Eppendorf Tube, 2 mLEppendorf0030120094Polypropilene, Safe-Lock
Eppendorf Tube, 5 mLdD Biolab999542Polypropylene, sterile, 눈금이 매겨진
에탄올 96% V/V, 1 LPanreac AppliChem361085-1611UV, IR  및 HPLC
실험실 핀셋LabBoxFORS-007-002얇고 곡선진 끝, L= 120 mm
자기 교반기GenIUL900017000배터리 구동
마커dD Biolab929203검정, 초미세 팁, 방수, 빠른 건조, 플라스틱 및 유리제품용
마이크로 로타-랙 마이크로튜브용dD Biolab377824 모듈, L x W x H = 208 x 100 x 100 mm
Mini8 Real-Time PCR CyclerCoyote Biosciences, ChinaMini-8휴대용, 12V 전원 공급 장치 또는 외부 배터리와 함께 작동, 2 채널, 8 튜브 용량
NucliSens 용해 완충액Biomerieux200292시약, 최대 48 분리 용, 주변 온도에서 보관
오픈 팁 혈청학 피펫, 10 mLDeltalab900136N멸균, 개별 포장(종이/플라스틱)
PE 나사 캡 PP28LabBoxTP28-004-020PET 병용
pH 지시기 스트립LabBoxWSPH-001-001범위 pH 2.8 - pH 4.4, 팩당 50
스트립 플라스틱 시험관Quimikals300913캡 포함
폴리에틸렌 파스퇴르 피펫LabBoxPIPP-003-500눈금, 7mL 전체 부피,
나사 캡이 있는 비멸균 폴리프로필렌 나사 플라스크, 150mLDeltalab409726나사 캡, 멸균, 최대 100mL까지 눈금이 매겨진
폴리프로필렌 나사 플라스크(나사 캡 포함), 60mLDeltalab409526G나사 캡, 멸균, 최대 50mL
분말 분말 세제--옷 세탁용 일반 분말 비누
마그네틱 교반기용 전원 케이블GenIUL900011692배터리와 자기 교반기 사이의 연결
QuickPick 자기 도구BioNobile24001자기 입자를 위한 휴대용 도구
상자에 담긴 QuickPick 팁BioNobile24296RNase-Free, 오토클레이브, 96 단위
QuickPick XL gDNA 자기 입자BioNobileSN511003.2 mL
바다 소금Sigma-AldrichS9883-500G바닷물의 용해 염의 조성과 매우 유사한 인공 소금 혼합물
실리콘 튜빙LabBoxSILT-006-0055 미터 롤, 내부  ø x 외부  ø = 6 x 10 mm
수산화 나트륨 펠릿, 98.5-100.5 %VWR 화학 물질28244295펠릿, 1kg
태양열 로터리 플랫폼SOL-EXPERT Group70020아크릴 플레이트, 10 RPM, 최대 300 그램 지원
SOLIScript 1-스텝 프로브 키트Solis BioDyne08-57-00250Solis Biodyne의 5x 원-스텝 프로브 믹스 (qPCR 믹스) 및 40x 원-스텝 SOLIScript 믹스 (역전사효소), 250 반응
포함 SPEEDTOOLS RNA 바이러스 추출 키트BioTools21.141-4197BioTools의 BAW 버퍼(세척 버퍼 1), BAV3 버퍼(세척 버퍼 2 및 3) 및 BRE 버퍼(용리 버퍼)가 포함됩니다.
SpinBar 팔면체 교반 자석dD Biolab045926피벗 링, L x  ø = 38 x 8 mm, 파란색
테이프 끝 혈청학 피펫, 10 mLDeltalabPN10E1멸균, 개별 포장(종이/플라스틱)
테이프 끝 혈청학 피펫, 50 mLDeltalab900043멸균, 개별 포장(종이/플라스틱)
Termi-DNA-Tor - 핵산 제거제BioTools22001-4291재료 및 표면에서 핵산, 박테리아, 곰팡이 및 마이코플라스마 제거제, 450 mL
물 분자 생물학 시약, 1LSigma-AldrichW4502-1L뉴클레아제 및 프로테아제 프리, 0.1 μ m 필터
Whirl-Pak Bag, 540mLDeltalab200361안정적인 바닥
지퍼 잠금 일반 백LabBoxBZIP-080-100폴리에틸렌, L x W= 120 x 80mm
, 용 개

참고문헌

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