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방법 논문

타입-2 당뇨병과 관련 하 여 무 알콜 수 막 염을 위한 진보 된 뮤 린 모형

6.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/59470

⸱

2019년 4월 26일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Endocrinology & Metabolism Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, 2Berlin Institute of Health (BIH), 3Berlin-Brandenburg Center for Regenerative Therapies (BCRT), Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, 4DZHK (German Centre for Cardiovascular Research), 5Institute of Medical Immunology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, 6Julius Wolff Institute (JWI) and Center for Musculoskeletal Surgery, Charité - Universitätsmedizin Berlin, Berlin, Germany, corporate member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

간단 하 고 신뢰할 수 있는 식이 유발 설치류 동물 모델에 대 한 무 알콜 지방 각 막 염 (내 쉬)에 대 한 설명, 동물의 비 SPF 주택을 통해 달성 하 고 특정 높은 뚱뚱한 다이어트의 관리. 우리는 마우스를 환경 세균에 노출 시 킴으로써 인간 면 역학적 조건을 다시 캡처하는 간 및 지방 면역 세포 하위 세트의 식별을 설명 합니다.

초록

비만은 만성 저 학년 염증과 인슐린 저항성과 관련 되어 있으며, 2 형 당뇨병 및 무 알콜 수 막 염 (내 쉬)과 같은 만성 대사 질환의 증가 하는 보급에 기여 합니다. 최근의 연구는 프로 염증 성 면역 세포가 비만 비 대 지방 조직과 간을 침투 시키는 것을 확립 했습니다. 신진 대사 항상 성의 맥락에서 면역 세포의 새로운 중요성을 감안할 때, 타입-2 당뇨병과 내 시의 개발 중에 그들의 수정 사항을 정량화 하 고 특성화 하는 중요 한 필요가 있다. 그러나, 인간 내 쉬의 전형적인 병 태 생리학적 특징을 유도 하는 동물 모델은 희소 하다.

이 문서에서는, 우리 내 시의 신뢰할 수 있는 마우스 모델에서 간 및 지방 조직에서 고립 된 면역 세포 하위 집합을 식별 하는 자세한 프로토콜을 제공 합니다, 비 특이 적 병원 체 없는 (SPF) 조건 하에서 주택 고 지방 다이어트 (HFD) 마우스에 의해 설립 적어도 7 주 동안 장벽. 우리는 유 세포 분석기에 의해 비-SPF 조건에서 마우스의 처리, 조직의 소화 및 대 식 세포, 천연 킬러 (NK) 세포, 수지상 세포, B 및 T 세포 서브 세트의 식별을 입증 한다. SPF HFD 마우스 및 비 SPF 마우스의 대표적인 유 세포 분석 플롯이 제공 된다. 신뢰할 수 있고 해석할 데이터를 얻기 위해 항 체의 사용, 조직 소화를 위한 정확 하 고 정밀한 방법 및 유 세포 분석 실험에서의 적절 한 게이팅을 중요 한 요소입니다.

미생물 항 원에 대 한 비-SPF 조건에서 그들을 주택에 의해 쥐에 있는 생리 적 항 원 노출을 복원 하는 내정간섭은 면역학 변경 사이 링크를 조사 하기를 위한 관련 도구를 제공할 수 있었습니다, 규정식에 의하여 유도 된 비만과 관련 된 장기 합병증.

서론

비만은 심장 병, 치기, 무 알콜 항 암 각 막 염 (내 시), 타입-2 당뇨병 (T2D) 및 몇몇 유형의 암의 발달을 위한 다 인 성과 무질서 및 중요 한 위험 요소입니다. 비만의 보급은 급속 하 게 세계적으로 증가 하 고 있습니다. 오늘날 세계 인구의 약 30%가 21억 명이 비만 또는과 체중1입니다. 비만-관련 된 인슐린 저항은 포도 당 항상성2를 유지 하는 인슐린을 위한 증가 한 필요를 보충 하기 위하여 췌 장 섬 베타 세포가 소진 될 때 T2D로 이끌어 낼 수 있습니다.

지방 조직은 지방 세포를 포함 하는 다양 한 세포 유형으로 구성 되어 있으며, 내 피 셀, 섬유 아 세포 및 면역 세포. 비만의 진행 도중, 면역 세포의 수 그리고 활동에 있는 변경은 비 대 성 지방 조직3의 저급 한 염증을 이끌어 낼 수 있습니다,4. 구체적으로, 과도 한 에너지 섭취는 혈당, 중성 지방 및 유리 지방산의 만성 상승 수준을 동반 하 고, 지방 세포 저 산소 증, 내 소포체 스트레스, 손상 된 미토 콘 드리 아 기능 및 향상 된 사이토카인 분 비, 염증 성 지방 면역 세포의 활성화의 결과5,6. 과거 연구는 주로 선천적인 면제에 집중 했습니다, 그러나 더 최근에 적응 하는 면역 세포 (T와 B 세포)는 포도 당 항상성의 중요 한 규칙으로 부상 했습니다. 그들은 염증 성 (CD8+ t 세포, Th1 및 B 세포 포함) 또는 주로 조절 기능 (규제 T (treg) 세포, Th2 세포 포함)을 소유 하 고 인슐린 저항성을 악화 시키거나 보호 할 수 있습니다7,8 , 9.

또한, 지방 조직10에의 한 사이토카인의 증가 된 생산을 포함 하 여 비만이 증가 하는 방법을 설명 하기 위해 여러 가지 기전이 제안 되었다. 내 쉬, 무 알콜 지방 간 질환의 진보적 인 형태와 선진국의 주요 건강 부담은, 조직 학적으로 풍 화 된 간세포, 지질 축적, 섬유 증 및 연골 염을 특징으로 하 고 진행 될 수 있다 간 경 변, 단 부 질환 또는 간세포 암 종. 몇몇 식이요법 (예를 들면 메티오닌과 콜린 결핍 다이어트11)은 비 인간 동물 모델에서 내 시 같은 간 병리학을 유도 하는 것으로 알려져 있지만, 이러한 접근법의 대부분은 내 쉬와 그 대사에 대 한 인간의 상태를 탈환 하지 않는다 그들은 특정 유전자 녹아웃을 필요로 하는 결과, 비 생리 식이 조작 또는 인간의 내 쉬의 전형적인 인슐린 저항이 부족. 또한, 신진 대사 질환의 근본적인 메커니즘에 대 한 우리의 이해는 현재 표준 특정 병원 체 무료 (SPF) 조건 하에 보관 된 실험실 마우스를 사용 하 여 수행 된 실험을 기반으로 합니다. 이러한 장벽 시설은 비정상적으로 위생 적 이며 인간 들이 겪는 미생물 다양성을 고려 하지 않으며,이는 임상 접근법에 대 한 동물 연구의 번역 과정에서 어려움을 고려할 수 있는12,13 , 14.

인간 면 역학적 상태를 재생 하는 고급 마우스 모델에서 인슐린 저항성 및 내 시를 개발 하는 동안 지방 조직과 간에 서 상이한 면역 세포 서브 세트를 조사 하기 위해, 마우스를 반 멸 균 된 개별 케이지 내에 수납 하였다 장벽 없는 조건. 항 원 노출 조건 하에 보관 된 마우스는 이미 15 주 동안 고 지방 식이 요법 (HFD)을 먹이는13의 후 내 시 같은 간 병리학을 개발 했습니다. 그들은 나이 일치 하는 SPF 마우스에 비해 그들은 거 대 한 신경 병 증을 개발, 간 침투 및 면역 세포의 활성화.

이 원고는 내 시의 모델에서 마우스 지방 조직과 간에 서 면역 세포 서브 세트를 정의 하 고 계산 하는 강력한 유 세포 분석을 설명 합니다. 유 세포 분석기 분석은 RT-PCR 또는 면역 조직 화학 접근법과 달리 개별 세포의 여러 파라미터를 동시에 검출할 수 있게 합니다.

요약 하자면, 우리의 연구는 인슐린 저항과 내 쉬의 개발과 또한 인간의 상태에 대 한 충실도를 나타내는 기본 메커니즘을 조사 하기 위한 단기 HFD의 마우스 모델을 제공 합니다.

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프로토콜

이 연구는 우리 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 감독 하에 동물 복지 법 및 건강의 국립 연구소의 실험실 동물의 관리 및 사용에 대 한 가이드에 따라 수행 되었다. 동물 프로토콜은 독일 Charité 베를린의 제도적 윤리 지침에 따라 실시 되었으며, Landesamt의 Gesundheit und Soziales의 승인을 받았고, 도착 가이드라인을 준수 합니다.

1. 다이어트 유도 동물 모델

  1. 4 주의 나이에 비 SPF 주거에 마우스 (C57Bl 6J, 남성)를 전송 하 고 환경 병원 체/항 원의 넓은 범위에 지속적으로 그들을 노출 합니다. 항 원은이 방법으로 공기 통로에 의해 분배 되기 때문에 실험실 동물의 매일 취급에 의해 노출을 보장 합니다.
  2. 22 ° c의 온도에서 12 h:12h 빛/어두운 주기에 있는 일반적인 여과기를 가진 열려있는 caging 시스템에서 쥐 (C57Bl, 수 컷, 12 주)를 유지 하십시오. 실험 식이와 침구를 조사 하거나 오토 클레이 브를 하지 마십시오. 마스크 또는 헤어 네트 없이 동물 주거 시설에 접근 하십시오. 동물 방 사이의 문을 엽니다. 에 어 샤워를 사용 하지 마십시오.
  3. 항 원이 공기 통로에 의해 분배 되도록 정기적으로 실험실 동물 및 스위치 룸의 일일 처리를 보장 합니다. 실험실 마우스 옆 객실에 보관 된 포유류 실험실 동물의 침구에서 항 원에 매일 비 특이 적인 미생물 노출을 가진 더러운 주택을 보완.
  4. 유 세포 분석을 사용 하 여 혈액과 비장에서 CD44-CD62L 메모리 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 비율을 측정 합니다 (refefence13에서 설명한 바와 같이).
    참고: 이 점에서 우리는 충분 한 미생물 노출의 증거로 CD8+ t 세포에서 이펙터 메모리 CD8+ t 세포의 20%의 증가를 정의 했습니다.
  5. 시작 HFD (60로% 지방에서 19 킬로 퍼센트 단백질과 21 킬로%의 탄수화물과 5 주 오래 된 C57Bl/6J 남성 마우스와 6% 자당 함량의 물 소비를 7-15 주. HFD는 실험 과정 전반에 걸쳐 인슐린 저항의 발달을 유도 하기 위해 지방에서 60% kJ를 포함 해야 합니다 (전술한 바와 같이).
    참고: 헤 마 톡 실린 염색은 간세포 벌 루 닝과 같은 조직 학적 특성을 수행 하 여야 하며, 말로 리 테 릭 체, 면역 세포 침 윤 및 거 대 병 증은 내 시와 같은 간 병리학을 입증 하는 것으로 확인 되어야 한다 (참고 로 나타낸 바와 같이 13).

2. 시 약 및 용액의 제조

  1. 0.5% BSA와 ACK (암모늄 염화 물-칼륨) 용 해 완충 액으로 보충 된 인산 완충 식 염 수가 70% 에탄올을 준비 합니다.
  2. 염색 완충 액
    1. 500 mL의 태아 송아지 혈 청 (FCS) 10ml를 용 해 하 여 2% FCS PBS를 얻었다. 사용 전에 염색 완충 액을 얼음에 넣습니다.
    2. 용액을 4°c의 플라스틱 병에 보관 하십시오.
  3. 지방 조직 소화를 위한 콜라 게 나아 제 솔루션
    1. 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 2.5 g을 PBS의 500 mL에 녹 인 후 0.5% BSA/PBS를 얻었다.
    2. CaCl2 의 74.5 g을 0.5% BSA/PBS에 녹여 10 MM cacl2 용액을 얻었다.
    3. 10 mM CaCl2 PBS와 함께 0.5% BSA의 각 mL에 콜라 게 나 제 II ( 재료 표참조)의 1 mg을 추가 합니다.
    4. 지방 조직 시료 1g 당 3 mL의 콜라 게 나 제 다이제스트 액을 준비 합니다. 각 분리에 대 한 신선한 콜라 게 나아 제 용액을 준비 합니다.
  4. 간 조직 소화를 위한 콜라 게 나아 제 솔루션
    1. 행 크 ´의 균형잡힌 염 용액 (HBSS)의 500 mL에서 BSA의 2.5 g을 분해 하 여 0.5% BSA HBSS를 얻었다.
    2. 0.5%의 500 mL에 10 mL의 FC를 추가 하 여 0.5% BSA/HBSS를 얻습니다.
    3. 콜라 게 나 제 IV ( 물질 표참조) 0.5 mg을 각각 2% FCS 0.5% BSA/hbss에 첨가 하십시오.
    4. 2% FCS 0.5% BSA/HBSS 콜라 게 나아 제 용액 당 0.02 mg의 DNase를 첨가 한다.
    5. 간 조직 시료 당 13 mL의 콜라 게 나 제 다이제스트 용액을 준비 합니다.
    6. 각 분리에 대 한 신선한 콜라 게 나아 제 용액을 준비 합니다.

3. 단일 세포 현 탁 액의 생성

  1. 지방 조직 소화
    1. 자 궁 경부 탈 구를 따르는 아이 소 루 레인 마 취를 통해 생쥐를 안락사 시킵니다. 70% 에탄올로 가슴을 뿌려 주세요. 흉 강 및 심장을 노출 하는 늑 골 케이지의 전체 길이를 따라 외피 및 복 벽을 통해 5-6 cm 중앙 절 개를 조심 스럽게 만드십시오.
      참고: 기본 장기를 손상 시 키 고가 위 팁을 유지 하지 마십시오.
    2. 26G 바늘을 사용 하 여 좌 심 실의 꼭대기에 0.9%의 염 분 용액 10 mL 이상을 주입 하십시오.
      참고: 성공적인 관류는 간 창백에 의해 지적 된다.
    3. 가 위로 복 강을 열고 미세한 곡선가 위와 각 측면에 perigonadal fat 패드를 잘라. 미세 곡선가 위와 지방 조직 무게와 gonadal 조직을 분해.
    4. 4 ° c에서 페 트리 접시에 미세 조각으로 지방 조직을 잘라가 위를 사용 하 여 기계적 해리를 수행 합니다. 지방 조직을 50 mL 원추형 원심 분리기 튜브로 전달 하 고 0.5% BSA/PBS의 1Ml와 함께 페 트리 접시를 헹 궈 냅니다.
    5. 지방 조직의 1g 당 3 mL의 지방 조직 다이제스트 용액 (2.3 단계에서 제조 됨)을 추가 합니다. 부드러운 흔들림 (200 rpm) 하에서 20 분 동안 37 ° c에서 지방 조직 용액을 배양 합니다.
    6. 지방 조직의 그램 당 0.5% BSA/PBS의 5 mL를 추가 하 고 얼음 위에 놓습니다. 10 mL 혈 청 피 펫으로 용액을 여러 번 트리 터 팅 하 고 플런저의 도움으로 스 트레이너 (100 µm)를 통과 시킵니다.
    7. 4 ° c에서 10 분 동안 500 x g 에서 원심 분리기.
    8. 피 펫 팅 하 여 부유 지방 세포 분 획을 제거 합니다. ACK 용 해 완충 액 1 mL에 세포 펠 렛 (기질 혈관 분 획)을 소생 시킵니다 ( 물질 표참조). 10ml의 10Ml를 추가 합니다.
    9. 4 ° c에서 10 분 동안 500 x g 에서 원심 분리기.
    10. 2% FCS PBS의 250 µ L에서 decant 상층 액 및 소생 세포 펠 렛.
    11. 트리 판 블루 제외를 사용 하 여 혈 세포 측정기에 생존 셀의 수를 계산 합니다.
  2. 간 조직 소화
    1. PBS로 채워진 원추형 원심 분리기 튜브에 간을 저장 하 고 얼음을 운반 하십시오.
    2. 4°c에서 페 트리 디쉬에 실린 지 스탬프를 사용 하 여 기계적 해리를 수행 한다. 따뜻한 간 다이제스트 용액 10ml를 포함 하는 50 mL 원추형 원심 분리기 튜브에 해 부 조직을 넣어. 3 mL의 간 다이제스트 용액으로 페 트리 접시를 헹 궈 냅니다.
    3. 부드러운 흔들림 (200 rpm) 하에서 20 분 동안 37 ° c에서 간 조직 용액을 배양 합니다.
    4. HBSS 20 mL를 추가 합니다. 10 mL 혈 청 피 펫으로 용액을 여러 번 트리 터 팅 하 고 플런저의 도움으로 스 트레이너 (100 µm)를 통과 시킵니다.
    5. 4 ° c에서 10 분 동안 500 x g 에서 원심 분리기. 상기 상층 액을 decant 하 고 HBSS 20 mL의 세포 펠 렛을 소생 시켰다.
    6. 실 온에서 1 분간 30 x g에서 원심 분리 하 여 간세포 매트릭스를 제거 한다. 셀 펠 렛을 버리십시오.
    7. 상층 액을 500 x g 에서 4°c에서 10 분간 원심 분리기. 10ml의 33% 저 점도 밀도 구배 용액 ( 재료 표참조)을 hbss로 원심 분리 (800 x g, 상 온; 브레이크 없음
    8. 1 mL의 ACK 용 해 완충 액으로 펠 렛을 소생 하 고 실 온에서 4 분간 배양 한다. 그런 다음 HBSS 10ml를 추가 합니다.
      참고: 상 등 액을 (간세포)와 함께 상 등 액을 매우 조심 스럽게 전사 파이 펫 (면역 세포와 적혈구를가지고 복용 하지 않고)를 버리고 폐기 한다.
    9. 15 mL 원추형 원심 분리기 튜브에 30 μ m 스 트레이너를 통해 세포를 통과 하 고 4°c에서 10 분 동안 500 x g 에서 원심 분리기. 2% FCS PBS의 250 µ L에서 decant 상층 액 및 소생 세포 펠 렛.
    10. 트리 판 블루 제외를 사용 하 여 혈 세포 측정기에 생존 셀의 수를 계산 합니다.

4. 표면 염색

  1. 표 1 및 표 2에 기재 된 바와 같이 T 세포-서브 세트 (패널 1)와 선 천 면역 세포 (패널 2)에 대 한 항 체 혼합을 준비 한다. 부피는 항 체 농도에 관한 하나의 샘플 (100 µ L)에 대해 최적화 된다.
    참고: 림프 구와 타고 난 면역 세포는 자동 형광의 차이를 제시 하 고 별도로 분석 해야 합니다.
  2. 표면 염색을 위해 폴리스 티 렌 FACS 튜브에서 100 µ L에 최대 3 x 106 셀을 사용 하십시오. Fc 수용 체를 차단 하기 위해 10 µ L의 항 CD16/CD32 항 체 (희석 1:100)를 추가 하 고 얼음에서 10 분간 배양 한다. 얼룩 없는 네거티브 컨트롤 샘플을 사용 하 여 측면 산란 (SSC) 및 전방 산란 (FSC)을 조정 하 여 음수 셀 모집단의 위치를 확인 합니다.
  3. 소용돌이 패널 1 및 패널 2에 대 한 항 체 혼합물의 적절 한 부피를 추가 한다. 생존 염료 1 µ L을 각 시료에 추가 하 여 살 균 및 죽은 세포 차별을 허용 합니다. 4°c에서 20 분 동안 배양 하 고 빛 으로부터 보호 합니다.
  4. 2% FCS PBS로 두 번 세척 하 고 4°c에서 5 분 동안 300 x g 에서 원심 분리기를 사용 합니다.
  5. 300 µ의 세포 펠 렛을 2% FCS PBS에 소생 시켜 FACS 분석까지 4°c에서 저장 한다.
    참고: 측정을 시작 하기 전에 30 µm 세포 스 트레이너를 통해 세포를 폴리스 티 렌 FACS 튜브와 소용돌이로 통과 시켰다. 유 세포 분석은 1-3 h의 경우 4°c에서 2% FCS PBS에 저장 된 표지 된 세포로 수행 하였다. 세포는 최적화 된 결과를 위해 가능한 한 빨리 분석 되어야 합니다.

5. 유 세포 분석 보상, 수집 및 게이팅

  1. 오염 되지 않은 네거티브 컨트롤 샘플을 실행 하 여 FSC 및 SSC를 설정 하 고 유 세포 집단의 전압을 조정 하 여 백혈구를 감지 하 고 파편과 생존 가능한 세포를 구별 합니다. 파편과 죽은 세포를 제외 하십시오.
    참고: 간에 서의 세포 현 탁 액의 생존 율은 추가적인 밀도 분리 단계로 인해 perigonadal 지방 조직 으로부터의 세포 현 탁 액 으로부터의 생존 율 보다 낮을 수 있다.
  2. 멀티 컬러 보정을 위해 단일 스테인드 컨트롤 샘플을 실행 합니다.
    참고: 항 체 포획 비드는 관심 있는 세포 집단의 세포 수가 너무 낮아서 세포를 사용 하 여 보상할 수 없는 경우 스펙트럼 중첩을 조정 하는 데도 사용 될 수 있다. 세포의 가능한 자동 형광 신호를 검출 하는 것은 모든 항 체에 대 한 1 (FMO) 제어는 권장 하지만이 프로토콜에서는 적용 되지 않았다.
  3. 측정을 시작 하 고 적절 한 수의 이벤트 (최소 5만 이벤트)를 수집 하 고 실험 데이터를 기록 합니다.
  4. 분석용 FCS 데이터 파일을 내보내고 게이팅 전략을 설정 합니다. CD45+ 백백혈구를 게이트 하 여 후속 세포 집단을 식별 합니다.

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결과

설명 된 프로토콜은 식이 유도 된 내 쉬의 모델에서 뮤 린 perigonadal 지방 조직과 간에 서 분리 된 선천적인 및 적응 면역 세포의 표면 마커의 특성화를 허용 합니다. 이 모델에서, 내 시는 HFD 플러스 자당 (6%)의 투여에 의해 유도 되었다 이전에 보고 된 바와 같이 C57Bl/6J 마우스에서 7 내지 15 주 동안식 수를 한다. 중요 하 게는, 생쥐는 반 멸 균 상태에 보관 되었고, 따라서 실험 전반에 걸쳐 환경 항 원에 노출 되었다. Spf 조건에서 보관 된 HFD 마우스 먹이 쥐와 spf 및 비 SPF 조건에서 보관 된 초 우 다이어트 마우스는 컨트롤로 제공 됩니다. HFD 공급은 이미 두 그룹에서 7 주 후에 상당한 체중 증가를 가져왔다. 체중에 있는 중요 한 다름은 주 4 (P < 0.001)에서 첫번째 명백 하 고 다음 실험적인 주 내내 중요 하 게 남아 있었습니다. 그러나, 체중 증가에 있는 중요 한 다름은 7 주13

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토론

스 테아의 각 막 염은 비만, 인슐린 저항성 및 dyslipidemia15와 같은 대사 이상과 강한 연관이 있다. 여러 연구에 따르면, 지방 조직 염증은 선천적인 면역계와 적응형 면역 체계의 세포의 변화 된 수준을 포함 하 여 타입-2 당뇨병의 병 인을 구동할 수 있다는 것을 나타냅니다.4,5,17 . 또한 비만이 면역 경로의 활성화를 조절 하 여 간 합병증18을 유발할 수 있음을 발견 했습니다. 각 면역 세포 집단은 인슐린 저항성 및 항 각 막 염의 발달에 다른 방법으로 기여 하기 때문에 지방 및 간 염증 반응에서 면역 세포 표현 형의 특성화에 대 한 관심이 증가 하 고 있습니다.

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

우리는 Anke Jurisch, 다이아나 워 너, 닥터 카 린 위 테와 코르넬리아 헥 트만에 게 도움을 요청 하 여 바이오 레 전 드에서 Tiburzy 하는 실험 절차와 벤자민에 대 한 도움이 되는 정보를 제공 하 여 게이팅 전략에 대 한 의견을 주었다. J.S.는 헬름홀츠 교부 금 (ICEMED)에 의해 지지 되었다. 이 연구는 베를린 건강 연구소의 임상 연구 단위에서 보조금에 의해 지원 되었다 (BIH), "BCRT 보조금" 독일 연방 교육부와 연구와 아인슈타인 재단에 의해. K.S.-B. 그리고 h.-D.V.는 FOR2165에 의해 후원 된다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
100 &마이크로; M 세포 스트레이너 Falcon352340
1 mL 주사기 BD   
26G x 5/8 바늘 BD 
35mm 페트리 접시 팔콘353001
40 &마이크로; M 세포 스트레이너 Falcon352340
ACK 용해 버퍼 GIBCOA1049201
Alexa Fluor 700 안티-마우스 CD45Biolegend 103127AB_493714 (BioLegend Cat. 103127)
분석 소프트웨어 FlowJo 10.0.8 소프트웨어
APC 안티-마우스 CD11c 항체Biolegend 117309AB_313778 (BioLegend Cat. 번호 117309)
APC 안티-마우스 KLRG1 (MAFA) 항체Biolegend 138411AB_10645509 (BioLegend Cat. 번호 138411)
BV421 안티-마우스 CD127 항체Biolegend 135023AB_10897948 (BioLegend Cat. 번호 135023)
BV421 안티-마우스 F4/80 항체Biolegend 123131AB_10901171 (BioLegend Cat. 번호 123131)
BV605 안티-마우스 CD279 (PD-1) 항체Biolegend 135219AB_11125371 (BioLegend Cat. 번호 135219)
BV605 안티 마우스 NK-1.1 항체Biolegend 108739AB_2562273 (BioLegend Cat. 번호 108739)
BV650 안티-마우스/인간 CD11b 항체Biolegend 101239AB_11125575 (BioLegend Cat. 번호 101239)
BV711 안티-마우스/인간 B220 항체Biolegend 103255AB_2563491 (BioLegend Cat. 번호 103255)
BV785 안티 마우스 CD8a 항체Biolegend 100749AB_11218801 (BioLegend Cat. 번호 100749)
C57Bl/6J 마우스, 수컷, 5주 된 마우스 Forschungseinrichtungen fü r experimentelle Medizin (FEM)
CaCl2 자선é - Universitä 베를린A119.1 
콜라겐 분해 효소 NB 4G 입증 된 등급 세르바 
콜라겐 분해 효소 유형 워딩턴 
원뿔형 원심분리기 튜브 15mL Falcon352096
원뿔형 원심분리기 튜브 50 mL 팔콘352070
DNAse   시그마-알드리치 
태아 소 세럼 BiochromS0115
필터 30µ 엠 셀트릭 
FITC 안티 마우스 CD3 항체Biolegend 100203AB_312660 (BioLegend Cat. 번호 100203)
유세포 분석 BD-LSR 포르테사 
펜치 시그마-알드리치 F4142-1EA
HBSS 생물 분석 GmBH 085021-0500 
고지방 다이어트 SSNIFE15741– 34 지방에서 60kJ%, 19  단백질에서 kJ%, 그리고 21  탄수화물
마이크로 해부 가위에서 kJ% 시그마-알드리치 S3146해부 목적으로 사용됩니다 
PE 안티 마우스 CD25 항체Biolegend 101903AB_312846 (BioLegend Cat. 번호 101903)
PE/Cy7 안티 마우스 CD62L 항체Biolegend 104417AB_313102 (BioLegend Cat. 번호 104417)
PE/Cy7 안티-마우스 I-A/I-E (MHCII) 항체Biolegend 107629AB_2290801 (BioLegend Cat. 번호 107629)
PE/Dazzle 594 안티-마우스 CD4 항체Biolegend 100565AB_2563684 (BioLegend Cat. 번호 100565
) Percoll 솔루션 BiochromL6115
PerCP/Cy5.5 안티-마우스 CD44 항체Biolegend 103031AB_2076206 (BioLegend Cat. 번호 103031)
PerCP/Cy5.5 안티-마우스 Gr-1 항체Biolegend 108427AB_893561 (BioLegend Cat. 번호 108427)
인산염 완충 식염수 Gibco12559069
세포 여과기 캡이 있는 둥근 바닥 튜브STEMCELL Technologies 38030
TruStain fcX 안티 마우스 CD16/32Biolegend 101301AB_312800 (BioLegend Cat. No. 101301)
트리판 블루 시그마-알드리치 T6146
좀비 NIR 고정 가능한 생존력 키트Biolegend 423105바이어블리티 염색 
30965930511511427513LS0041974716728001400422316은

참고문헌

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