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방법 논문

포말리도마이드 기반 호모-PROTACs에 의한 E3 유비퀴틴 리가세 세레블론의 화학적 불활성화

13.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/59472

⸱

2019년 5월 15일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine III, University Hospital Ulm, 2Pharmaceutical Institute, Pharmaceutical Chemistry I, University of Bonn

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 작품은 탈리도마이드 유사체의 표적인 E3 유비퀴틴 리가세 세레블론(CRBN)의 유비퀴틴화 및 분해를 유도하는 새로운 접근법으로서 포말리도마이드 계, 이중 기능적 호모-PROTAC의 합성 및 특성화를 설명한다.

초록

면역 조절 약물 (IMiDs) 탈리도마이드와 그 유사체, 레날리도마이드 및 포말리도마이드, 다발성 골수종의 치료를 위한 모든 FDA 승인 약물, 림프성 전사 인자 이카로스(IKZF1) 및 아이올로스의 유비퀴틴화 및 분해를 유도 (IKZF3) 세레블론 (CRBN) E3 유비퀴틴 리가아제를 경질 분해를 경유한다. IMiDs는 최근 CRBN E3 ligase에 의한 유비퀴틴화 및 프로테아소말 분해를 위한 다른 단백질을 표적으로 하는 이중 기능성 프로테오분해 표적화 키메라(PROTACs)의 생성을 위해 활용되고 있다. 우리는 포말리도마이드 기반의 호모비기능 PROTACs를 설계 및 합성하고 CRBN의 자기 주도적 유비퀴틴화 및 분해를 유도하는 능력을 분석했습니다. 여기서, CRBN은 E3 유비퀴틴 리가제와 동시에 표적을 모두 작용한다. 호모-PROTAC 화합물 8은 IKZF1 및 IKZF3에 최소한의 남은 효과만 으로 높은 효능으로 CRBN을 저하시고 있습니다. 화합물 8에 의한 CRBN 불활성화는 상이한 다발성 골수종 세포주들의 세포 생존 및 증식에 영향을 미치지 않았다. 이 호모-PROTAC는 다발성 골수종 세포에서 IMiDs의 효과를 제거합니다. 따라서, 우리의 동형 포말리도마이드 계 화합물은 CRBN의 내인성 기질 및 생리기능을 확인하고 IMiDs의 분자 메커니즘을 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다.

서론

면역 조절 약물 (IMiDs) 탈리도마이드와 그 유사체, 레날리도마이드와 포말리도마이드, 모두 다발성 골수종의 치료를 위해 승인, E3 유비퀴틴 리가세 세레블론에 결합(CRBN), 컬린4A-RING E3 유비퀴틴 리가에 대한 기질 어댑터 (CRL4CRBN)1,2,3. IMiDs의 결합은 림프성 전사 인자 이카로스 (IKZF1) 및 아이올로스 (IKZF3)에 CRL4CRBN의 친화성을 향상시켜, 그들의 유비퀴틴화 및 저하로 이어지는 (그림1)4,5 ,5, 6개 , 7명 , 8. IKZF1 및 IKZF3는 다발성 골수종 세포에 필수적이므로 불활성화는 성장 억제를 초래합니다. SALL4는 최근 탈리도마이드9,10에의한 1950년대의 기형및 소위 Contergan 재앙에 대한 책임이 있는 CRBN의 추가적인 IMiD 유도 신기판으로서 발견되었다. 대조적으로, 카제인 키나아제 1α(CK1α)는 염색체 5q 델레이션을 가진 골수이형성 증후군에서 치료 효과에 연루되는 CRBN의 레날리도마이드특이적 기질(11)이다.

분해를 위해 특정 단백질을 표적으로 하는 작은 분자의 능력은 현대 약물 발달을 위한 흥미진진한 의미입니다. 탈리도마이드와 그 유사체의 메커니즘은 인간에서 처음 사용한 후에 발견되었지만, 소위 Proteolysis Targeting C히메라스 (PROTACs)는 특히 관심단백질(POI)을 표적으로 하도록 설계되었습니다(그림) 2)12,13,14,15,16,17,18. PROTACs는 CRBN 또는 폰-히펠-린다우(VHL)18,19,20,E3 유비퀴틴 리가제의 리간드에 링커를 통해 연결된 POI에 대한 특정 리간드로 구성된 헤테로비기능 분자이다. 21,22. PROTACs는 일시적인 삼차 복합체의 형성을 유도하여 POI를 E3 유비퀴틴 리가제에 지시하여 유비퀴틴화 및 프로테아소말 분해를 초래합니다. 기존의 억제제에 비해 PROTACs의 주요 장점은 POI에 결합하는 것이 그것의 억제 보다는 오히려 충분하다는 것입니다 및 그러므로 PROTACs는 잠재적으로 약용으로 여겨지는 단백질을 포함하여 단백질의 훨씬 더 넓은 스펙트럼을 표적으로 할 수 있습니다 전사 인자15. 또한 키메라 분자는 촉매작용을 하므로 효능이 높습니다. POI로 유비퀴틴이 전달된 후, 삼차 복합체는 해리되고 새로운 복합체의 형성에 사용할 수 있다. 따라서, 매우 낮은 PROTAC 농도는 표적단백질(23)의분해에 충분하다.

여기서 우리는 자체(24)의 분해를 위해 CRBN을 모집하는 포말리도마이드-포말리도마이드 공액호-PROTAC(화합물 8)의합성을 설명한다. E3 유비퀴틴 리가제 CRBN은 모집자 및 대상을 동시에 제공합니다(그림 3). 데이터의 유효성을 검사하기 위해 음의 결합 제어(화합물 9)도 합성했습니다. 우리의 데이터는 새로 합성된 호모-PROTAC가 CRBN 분해에 특이적이고 다른 단백질에 최소한의 효과만 가지고 있음을 확인합니다.

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프로토콜

1. PROTAC 분자의 준비

주의: 사용하기 전에 모든 관련 물질 안전 데이터 시트(MSDS)를 참조하십시오. 이러한 합성에 사용 되는 화학 물질의 몇 가지 독성 및 발암성. 모든 적절한 안전 관행과 개인 보호 장비를 사용하십시오.

  1. 테르트-부틸 N-(2,6-디옥소-3-피프리딜)카르바메이트(화합물 1)
    1. THF(50 mL)에서 1,1-카르보닐디미다졸(1.95 g, 12 mmol)과 촉매량 4-(디메틸아미노) 피리딘(5 mg)을 THF(50 mL)에 100 mL 의 바닥 플라스크와 함께 바락을 넣은 바락에 보크-글란-OH(2.46 g, 10 mmol)의 혼합물에 첨가한다. 명확한 용액이 형성 될 때까지 교반하면서 10 시간 동안 역류에서 가열하십시오.
    2. 회전 식 증발기로 감소 된 압력하에서 용매를 제거하고 EtOAc (200 mL)를 추가하고 분리 깔때기로 옮김으로 옮니다. H2O (50 mL)와 염수 (50 mL)로 유기 층을 씻고 Na2SO4위에 건조시십시오.
    3. 짧은 실리카 겔 패드(직경 5cm 및 높이 5cm)를 통해 용액을 걸러내고 EtOAc의 추가 부피(200 mL)로 용출합니다.
    4. 용매를 증발시키고 얻어진 무색 고체를 진공에서 건조시다.
  2. 테르트-부틸 N-(1-메틸-2,6-디옥소-3-피프리딜)카르바메이트(화합물 2)
    1. 화합물 1(2.28 g, 10 mmol)을 분쇄된 탄산칼륨(2.76 g, 20 mmol)과 DMF(25 mL)를 100 mL 라운드 바닥 플라스크에 결합합니다. 주사기를 사용하여 낙하 시 요오드메탄 (1.42 g, 0.62 mL, 10 mmol)을 추가하고 플라스크에 구멍이 뚫린 고무 중격을 장착하십시오. 반응 용기를 초음파 욕조에 2 시간 동안 놓습니다.
    2. 반응 혼합물을 EtOAc (100 mL)로 희석하고 분리 깔때기로 옮김으로 옮니다. 유기층 1N NaOH(2x 25 mL),H2 O(25 mL), 염수(25 mL)로 세척하고 Na2SO4위에 건조시다.
    3. 용매를 걸러내고 증발시.. 석유 에테르 /EtOAc (2 :1)를 사용하여 실리카 젤 (6cm 열 직경 및 20cm 높이)을 통해 컬럼 크로마토그래피에 의해 제품을 정화합니다.
  3. 2-(2,6-디옥소피리딘-3-yl)-4-플루오로이소인돌린-1,3-디온(화합물 3)의 제제
    1. 3-플루오로프탈리 안수소(1.25 g, 7.5 mmol), 글루타미드 1(1.14 g, 5 mmol) 및 아세테이트 나트륨 용액(0.50 g, 6.0 mmol)을 빙하 아세트산(20 mL)에 50 mL 둥근 바닥 플라스크에 넣고 콘렌드와 함께 사용한다. 혼합물을 120 °C에서 6 시간 동안 가열합니다.
    2. 냉각 후, 보라색 혼합물을H2O(100 mL)에 붓고 10분 간 저어주면서 여과에 의해 형성된 고체를 수집하고, H2 O(3×5 mL) 및 석유 에테르(3×5 mL)로 세척하고 진공에서 건조시다.
  4. 4-플루오로-2-(1-메틸-2,6-디옥소피리딘-3-yl)이소인돌린-1,3-디온(화합물 4)
    1. 3-플루오로프탈리 안수소(1.25 g, 7.5 mmol), 글루타미드 2(1.21 g, 5 mmol) 및 아세테이트 나트륨 용액(0.50 g, 6.0 mmol)을 빙하 아세트산(20 mL)에 100 mL 둥근 바닥 플라스크에 넣고 콘덴트와 함께 탄압을 결합합니다. 혼합물을 120 °C에서 6 시간 동안 가열합니다.
    2. 냉각 후, 보라색 혼합물을H2O(100 mL)에 붓고 10분 간 저어주면서 여과에 의해 형성된 고체를 수집하고, H2 O(3×5 mL) 및 석유 에테르(3×5 mL)로 세척하고 진공에서 건조시다.
  5. 테르트-부틸N-[2-[2-][2-[2-(2--2-2-2-6-다이옥소-3-피프리딜)-1,3-다이옥소-이소인돌린-4-yl]아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에틸]카르바메이트(화합물 7)
    1. 50 mL 둥근 바닥 플라스크를 터트-부틸 N-[2-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에틸]카르바메이트(5, 0.41 g, 1.65 mmol), 화합물 3 (0.41 g, 1.50 mmol), 건조 DMF (10 mL) 및 DIPEA (0.39 g, 0.51 mL, 3.0 mmol). 볶음 바 및 환류 응축기가 장착됩니다. 아르곤 대기하에서 90°C에서 10시간 동안 가열합니다.
    2. 실온으로 냉각한 후, 진한 녹색혼합물을 H2 O(100 mL)에 붓고 분리 깔때기에 EtOAc(3x 50 mL)로 추출합니다. H2O (50 mL)와 염수 (50 mL)로 결합 된 유기 층을 씻고 Na2SO4, 필터를 건조시키고 진공에 농축하십시오.
    3. 석유 에테르/EtOAc(1:1 ~ 1:2)의 그라데이션을 사용하여 실리카 겔(3cm 기둥 직경 및 60cm 높이)을 통해 컬럼 크로마토그래피에 의해 원유 제품을 정화합니다.
  6. 호모디머의 준비 (화합물 8)
    1. α, ω-diamine 링커 6(0.22 g, 0.22 mL, 1.50 mmol), DIPEA(1.05 mL, 6.00 mmol) 및 3(0.83 mL, 3.00 mmol)의 용액을 건조 DMSO(20 mL)에 결합하여 50 mL 의 둥근 바닥 플라스크와 함께 바플록을 재장착한 바플래드를 장착한 바플래드를 장착한 바플래드를 결합합니다. 아르곤 대기하에서 90°C에서 18시간 동안 가열합니다.
    2. 실온으로 냉각한 후, 진한 녹색혼합물을 H2 O(100 mL)에 붓고 분리 깔때기에 EtOAc(3x 50 mL)로 추출합니다. H2O (50 mL)와 염수 (50 mL)로 결합 된 유기 층을 씻고 Na2SO4,필터 및 진공 에 농축하십시오.
    3. 석유 에테르/EtOAc(1:2)의 그라데이션을 사용하여 실리카 겔(3cm 기둥 직경 및 50cm 높이)을 통해 컬럼 크로마토그래피에 의해 원유 제품을 정결화하였다.
  7. 이종화의 준비 (화합물 9)
    1. 화합물 7 (0.83 g, 1.65 mmol)을 건조 CH2Cl2 (10 mL)에 용해시고. 삼투오와세트산(10 mL)을 첨가하고 폐쇄된 50 mL 둥근 바닥 플라스크에서 2시간 동안 40°C에서 황색 혼합물을 저어줍니다.
    2. 휘발성을 제거하고 CH2Cl2 (4x 5 mL)로 coevaporate. 잔여물을 10시간 동안 바쿠오에서 건조시고 다.
    3. 건조 한 DMF (20 mL)에서 재료를 다시 용해. 화합물 4 (0.44 g, 1.50 mmol)와 DIPEA (0.78 g, 1.05 mL, 6.00 mmol)를 추가하고 플라스크에 환류 응축기장착하십시오. 아르곤 대기하에서 90°C에서 10시간 동안 가열합니다.
    4. 실온으로 냉각한 후, 진한 녹색혼합물을 H2 O(100 mL)에 붓고 분리 깔때기에 EtOAc(3x 50 mL)로 추출합니다. 포화 NaHCO3 (50 mL), H2O (50 mL), 10 % KHSO4 (50 mL), H2O (50 mL), 염수 (50 mL)로 결합 된 유기 층을 세척하고 Na2SO4,필터및 농축물을 통해 건조시다.
    5. 석유 에테르/EtOAc(1:2)의 그라데이션을 사용하여 실리카 겔(3cm 기둥 직경 및 50cm 높이)을 통해 컬럼 크로마토그래피에 의해 원유 제품을 정결화하였다.
    6. 핵 자기 공명(NMR)에 대한 DMSO-d6에서 1HNMR 및 13CNMR 스펙트럼에 의한 분자 구조(그림5A 화합물 8, 5B 화합물 9)를해명 및 검증 분 광 계. 220-500 nm에서 다이오드 어레이 검출(DAD)을 적용하여 두 화합물의 순도가 액체 크로마토그래피 질량 분석법(LC-MS)을 통해 97% 이상 높은지 확인합니다.

2. PROTAC 분자의 기능적 검증

  1. PROTACs에 의한 CRBN 열화의 서부 얼룩 분석
    참고 : 화합물의 효과8개및 화합물9개CRBN 단백질 수준에서 서부 블롯 분석에 의해 시험되었다. 또한 IKZF1 및 IKZF3 수준에 미치는 영향도 확인할 수 있습니다(그림 6).
    1. 샘플 준비
      1. 화합물 8 및 9, 레날리도마이드(Len), 포말리도마이드(Pom), MG132 및 MLN-4924를 10 mM의 농도로 DMSO에서 용해시키고, 추가 사용까지 -80°C에서 저장한다.
      2. 시드 1 x 106 MM1S 세포를 2.5 mL 의 매질로 6웰 플레이트에 제거하고 24시간 동안 100 nM 또는 1 μM 화합물 8 또는 9로 세포를 치료한다.
      3. 처리 후 세포를 수확하고 700 x g, 5 분, 4 °C에서 원심 분리기를 수확합니다. 차가운 1x PBS로 셀 펠릿을 씻어 남은 매체를 제거하고 원심 분리기를 700 x g, 5 분, 4 °C에서 제거하고 상류제를 폐기하십시오. 이 단계를 한 번 반복합니다.
      4. 용해 완충액의 용해 세포 (25 mM Tris HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 5 % 글리세롤, 1 x 프로테아제 & 포스파타제 억제제 칵테일) 얼음에 10 분 동안, 원심 분리기에서 10 00 x g에서 10 °C. 제조자의 프로토콜에 따라 비신초닌산 단백질 분석(BCA 분석)에 의한 단백질 농도를 상수로 수확하고 결정합니다.
      5. 1x LDS 로딩 버퍼 (5 % 2-메르카포에탄올)를 가진 변성 단백질 (15-30 μg / 샘플)을 10 분, 75 ° C로 끓입니다.
    2. SDS-페이지
      1. 젤 샌드위치를 10% 분리 젤로 고정 [4 mL 3x 젤 버퍼(3M Tris/HCl, 0.3% (w/v) 나트륨 도데실 황산염 (SDS), pH 8.45), 4 mL 아크릴 아블릴아미드 30%, 2.52 mL 글리세롤 50%, 1.395 mL H2O, 75% 11% 암모늄 퍼황페이트 (APS), 및 9.75 μL TEMED] 및 4% 스태킹 젤 [1.992 mL 3x 젤 버퍼, 0.792 mL 30% 아크릴아미드, 3.168 mL H2O, 36 μL 11% APS, 및 6 μL TEMED] 전극 조립 유닛. 빗을 제거하고 음극 버퍼 (100 mM Tris / HCl, 100 mM 트리신, 0.1 % (v) SDS)로 우물을 씻어 내고 샘플을 로드하십시오.
      2. 양극 버퍼 (100mM Tris / HCl, pH 8.9)를 탱크에 채웁니다. 2.1.4 단계에서 단백질 샘플을 로드하고 70 V, 20 분에서 SDS-PAGE를 실행한 다음 일정한 전압에서 115 V, 150 분.
    3. CRBN, IKZF1 및 IKZF3의 면역 블롯팅 및 검출
      1. PVDF 멤브레인(0.45 μm)을 100% 메탄올에서 1분 동안 활성화하고 1x 전사 완충액에서 겔을 분리[10x 전사 완충제(10x 전달 완충제, 25mMM 트리스 베이스/HCl, 900 mL H2O), 20% 메탄올, 0.1% SDS, pH 8.3].
      2. 제조업체의 프로토콜에 따라 블로팅 카세트를 조립합니다. 90 분 동안 180 mA에서 젤을 옮김.
      3. 1x TBS-T (25 mM Tris /HCl, 150 mM NaCl, pH 7.6, 0.1 % 트웬 20)에서 멤브레인 3 x를 실온에서 각각 5-10 분 동안 씻으하십시오. 실온에서 5 % 무지방 건조 우유 (NFDM), TBS-T에서 막 을 1 시간 동안 차단하십시오. 실온에서 멤브레인을 1X TBS-T로 3x 5-10분 동안 세척하십시오.
      4. CRBN (5 % BSA, TBS-T에서 1 :500)에 대한 기본 항체와 인큐베이션 멤브레인을 4 °C에서 부드럽게 흔들어 밤새.
      5. 실온에서 멤브레인을 1X TBS-T로 3x 5-10분 동안 세척하십시오. 항 마우스 (5 % NFDM, TBS-T에서 1 : 10.000) 또는 항 토끼 (5 % NFDM, TBS-T에서 1 : 5.000) 고추 냉기 퍼옥시다아제 HRP에 결합 된 보조 항체 (실온에서 1 시간).
      6. 실온에서 멤브레인 2x를 1X TBS-T로 5-10분 동안 세척하십시오. 이 단계를 1x TBS로 두 번 반복합니다.
      7. 제조업체의 프로토콜에 따라 HRP 기질 용액으로 2 분 동안 인큐베이션하고 화학 발광 검출 장치에서 화학 발광을 감지합니다.
      8. 실온에서 멤브레인 1x를 1X TBS로 5-10분 동안 세척하십시오. 항체의 방출을 위해, 시판시적으로 이용 가능한 스트리핑 버퍼의 스트립 멤브레인은 실온에서 각각 5-10분 동안 1X TBS에서 멤브레인 3x를 세척한다.
      9. 실온에서 1시간 동안 5% 무지방 건조 우유, TBS-T로 멤브레인을 다시 차단합니다. 실온에서 각각 5-10분 동안 1x TBS-T에서 멤브레인 3x를 세척하고 2.1.3.4단계에 따라 IKZF1, IKZF3 또는 튜불린으로 재프로브합니다.
  2. MG132, MLN4942 또는 포말리도마이드와의 경쟁 실험
    참고: 유비퀴틴-프로테아좀 경로를 통해 CRBN이 분해되는지 여부를 확인하기 위해, 우리는 프로테아좀 억제제 MG132 및 네딜화 활성화 효소(NAE) 억제제MLN4942(그림 7)와 경쟁 실험을 수행하였다.
    1. 시드 1 x 106 MM1S 셀을 6 웰 플레이트에서 잘 당. 10 μM MG132, 10 μM MLN4942, 또는 레날리도마이드(100x)를 가진 프리트트 세포는 37°C, 5% CO2에서 1h 배양한다.
    2. 37 °C, 5 % CO2에서 3 시간 동안100 nM 화합물 8을 추가하십시오.
    3. 2.1.1 단계에 따라 웨스턴 블롯에 대한 수확 세포.
  3. 다발성 골수종 세포주에서 세포 생존력 시험
    참고: 이 분석실험은 세포 생존력에 미치는 영향을 시험하고 추가적으로 화합물 8을 이용한 세포의 전처리를 통해 다발성 골수종 세포에 대한 IMiDs의 효과를 적대하는 데 사용된다(도8,도 9A,B).
    1. 시드 5 x 104 MM1S 세포는 생존성 분석에 대한 생물학적 삼각수에서 96 웰 플레이트에서 웰 당. 서쪽 얼룩 분석을 위해, 종자 1 x 106 MM1S 세포는 생물학적 삼중체에서 6 웰 플레이트에서 잘 당.
    2. DMSO 또는 100 nM, 1 μM, 또는 10 μM 화합물 8,화합물 9 또는 포말리도마이드및 37°C에서 96시간 동안 배양하여 37°C, 5% CO2로 세포를 치료한다. 구조 실험을 위해, 세포를 100 nM 화합물 8에서 3 시간 동안 치료하고, 1 μM 포말리도마이드를 첨가하기 전 또는 후에 96 시간 동안 배양합니다.
    3. 발광 세포 생존성 분석으로 96 웰 플레이트 발광을 측정, 플레이트 리더또는 서부 블롯 분석을위한 6 웰 플레이트에서 세포를 수확 하는 제조 업체의 프로토콜에 따라.

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결과

여기서 우리는 CRBN의 분해를 위한 동형 포말리도마이드 계 PROTAC의 설계, 합성 및 생물학적 평가를 기술하였다. 우리의 PROTAC는 두 개의 CRBN 분자와 동시에 상호 작용하고 포말리도마이드 유도 네오 기질 IKZF1 또는 IKZF3에 최소한의 남은 효과로 CRBN의 자가 유비퀴틴화 및 프로테아소말 분해를 유도하는 삼차 복합체를 형성합니다.

이전에 발표된 일련의 포말리도마이드 계 PROTAC 분자(24)에서, 화합물 8은 CRBN의 화학적 유도 열화에서 특히 효율적이었다. 그 합성은 다음과 같이달성될 수 있다(도 4). 1,1-카본디미다졸-보크 보호 l-글루타민의 응축은 순환화된 이미드 1로이어집니...

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토론

CRBN에 대해 여기에 설명된 바와 같이 이러한 호모-PROTAC의 설계는 CRBN에 대한 포말리도마이드의 특정 친화성에 의존하며, 이는 수많은 heterobifunctional PROTAC에서 성공적으로 활용되었으며 PROTAC 8의 개발을 매우 높게 초래했습니다. 선택적 CRBN 저하기. 우리의 분자의 특이성은 이미 proteomic 분석24에의해 확인되었습니다. 유전적으로 중재된 녹아웃의 경우, 부작용의 배제와 검증은 어렵고 시간이 많이 걸립니다. 또한, 화학적으로 유도된 녹다운은 가역적이고, 신속하며, 광범위한 세포및 조직 유형(28)에 직접 적용가능하다.

IMiDs 탈리도마이드, 레날리도마이드 및 포말리도마이드는 다발성 골수종, B 세포 림프종 및 골수이형성 증후군의 치료에 주류가 되었습니다. IMiDs는 신기판 IKZF1, IKZF3, 또는 CK1α

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공개 사항

저자는 잠재적 인 재정적 이해 상충을 선언하지 않습니다.

감사의 글

이 작품은 도이치 포르충스게마인샤프트(에미-노에테르 프로그램 Kr-3886/2-1 및 SFB-1074-J.K.)에 의해 지원되었다. FOR2372 - M.G.)

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1,1'-카르보닐디미다졸TCI 화학 물질C0119
2,2′-(에틸디옥시)-비스(에틸아민)시그마-알드리치385506화합물 6
2-메르캅토에탄올시그마-알드리치M6250
3-플루오로프탈산 무수물, 98 %알파 아이사르A12275
4-디메틸아미노피리딘, 99 %아크로스148270250독성
아크릴아미드스탐믈&오울; sung/ 비사크릴레이드(30%/0,8%)Carl Roth3029.1
Aiolos(D1C1E) mAB세포 신호15103S
토끼에서 생산된 항-CRBN 항체SigmaHPA045910
항토끼 IgG HRP 결합 항체Sigma7074S
과황산암모늄Roth9592.2
Boc-Gln-OHTCI 화학 물질B1649
소 혈청 알부민시그마-알드리치A7906-100G
CellTiter-Glo 발광 세포 생존율 분석PromegaG7571
ChemiDoc XRS+Bio-Rad1708265
DMF, 무수, 99.8 %Acros348435000Extra Dry over Molecular Sieve
DMSO, 무수, 99.7 %Acros348445000분자체
글리신시그마 Aldrich15523-1L-R
염소 안티 마우스 (HRP 활용)산타 크루즈 생명 공학sc-2005
중단 프로테아제 & 포스파타제 억제제 일회용 칵테일 (100X)Thermo Scientific1861280
Ikaros (D6N9Y) Mab세포 신호전달 14859S
ImmobilonP 전달 멤브레인 (0,45µ m)MerckIPVH000010
Iodomethane, 99 %Sigma-AldrichI8507고독성
메탄올Sigma-Aldrich32213-2.5L
Mg132SelleckchemS2619
Mini Trans-Blot 전기 영동 전달 셀Bio-Rad1703930
Mini-PROTEAN Tetra 수직 전기 영동 셀Bio-Rad1658004
MLN4942biomol (cayman)Cay15217-1
Monoclonal Anti-α-Tubulin 항체 마우스 (B512)에서 생성SigmaT5168
N-Ethyldiisopropylamine, 99 %Alfa AesarA11801
Nonfat dried milk powderPanReac AppliChemA0830,0500
Nunc F96 MicroWell White 폴리스티렌 플레이트Thermo Scientific136101
NuPAGE LDS 시료 완충액 (4X)Thermo ScientificNP0008
Pierce BCA 단백질 분석 키트Thermo Scientific23225
포말리도마이드SelleckchemS1567
RestoreTM 웨스턴 블롯 스트리핑 완충액Thermo Scientific46430
나트륨 도데 실 설페이Carl Roth183.1
염화나트륨시그마 - 알드리치A9539-500g
TEMED칼 로스2367.3
tert- 부틸 N- [2- [2- (2- 아미노 에톡시) 에톡시] 에틸] 카르바 메이트시그마 - 알드리치89761화합물 5
트리신칼 로스6977.4
트리즈마 염기시그마 알드리치T1503-1kg
Tween-20Sigma-AldrichP7949-500ml
WesternBright ECL 스프레이AdvanstaK-12049-D50
트

참고문헌

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