마우스 종아리에 일관된 마사지와 같은 섭동을 적용하고 근육 내 압력 변화를 모니터링

요약

여기에서는 마우스 종아리에 정의된 기계적 하중을 적용하고 수반되는 근육 내 압력 변화를 모니터링하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 우리가 개발 한 실험 시스템은 운동과 마사지의 유익한 효과 뒤에 메커니즘을 조사하는 데 유용 할 수 있습니다.

초록

마사지는 일반적으로 통증과 염증을 완화하는 데 도움이 되는 것으로 인식됩니다. 이전 연구는 골격 근육에 마사지의 항 염증 효과 보고 하지만, 뒤에 분자 메커니즘은 제대로 이해. 우리는 최근에 다양한 진폭을 가진 근위내 압력파를 생성할 수 있는 국부적인 주기적 압축 (LCC)를 적용하는 간단한 장치를 개발했습니다. 이 장치를 사용하여, 우리는 LCC가 대식세포의 염증 반응을 계조시키고 고정으로 인한 근육 위축을 완화한다는 것을 입증했습니다. 여기에서는, 우리는 마우스 뒷다리의 골격 근육의 고정화 유도한 염증 그리고 위축에 대하여 마사지 같이 내정간섭으로 LCC의 최적화 그리고 적용을 위한 프로토콜을 기술합니다. 우리가 개발 한 프로토콜은 운동과 마사지의 근본적인 유익한 효과를 조사하는 데 유용 할 수 있습니다. 우리의 실험 시스템은 근육 항상성의 기계적 조절을 해명하기 위한 분석 접근법의 프로토타입을 제공하지만, 더 포괄적인 연구를 위해 추가 개발이 이루어져야 합니다.

서론

마사지는 일반적으로 통증 완화와 경쟁 선수와 비 운동 선수 모두 모두 신체 성능의 개선에 도움이 될 것으로 인식^1,2. 사실, 이전 연구는 마사지가 국소 염증을 억제하는 것으로 나타났습니다³ 운동 후 근육 손상에서 회복을 자극^4,5. 마사지의 유익한 효과의 근간이 되는 분자 메커니즘은 크게 알려지지 않았습니다.

마사지에 대한 기계적 조사의 어려움 중 하나는 마사지와 같은 중재를 테스트하는 실험 기술의 재현성과 관련이 있습니다. 이전 연구에서는, 마사지를 모방하는 실험 절차는 주로 손바닥과 손가락과 같은 실무자의 신체 부위를 사용하여 물리적 인 개입의 적용을 포함^6,7,8. 따라서 크기, 빈도, 지속 시간 및 모드를 정확하게 재현하기가 어렵습니다.

많은 장치가 대상 조직에 정의된 기계적 하중을 적용하도록 개발되었습니다. 예를 들어, Zeng 등은 쥐의 뒷다리에 길이 가변 적재를 위한 공압 시스템을 개발하였고, 왕 등은 쥐와 토끼의 뒷다리에 마사지와 같은 기계적 하중을 적용할 수 있는 메카트로닉 장치를 개발했습니다. 실시간 피드백 제어¹⁰. 이에 비해, 우리의 로컬 주기적 압축 (LCC) 시스템은 훨씬 간단, 건설에 대한 훨씬 적은 비용을 요구. 그럼에도 불구 하 고, 우리는 가벼운 근육 수축 하는 동안 생성 되는 근육 압력 변화를 재현할 수 있습니다. 이 장치를 사용하여, 우리는 성공적으로 마사지와 같은 기계적 개입이 국소 간질 유체 역학을 조절하고 고정 유도 근육 위축을 완화한다는 것을^{입증했다 11.}

여기에서는 운동과 마사지의 긍정적 인 효과 뒤에 분자 메커니즘을 탐구하는 데 도움이 될 수있는 장치 및 프로토콜의 세부 사항을 설명합니다. 프로토콜의 회로도는 보충 그림 1로표시됩니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 국가 장애인 재활 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인하에 수행되었습니다.

1. 마우스 양측 뒷다리의 고정

참고: 남성 C57BL/6 마우스는 적어도 7일 동안 적응 후 11-12주 후에 실험에 사용하였다.

1. 나트륨 펜토바르비탈 (50 mg /kg i.p.)을 사용하여 마우스를 적절하게 마취하십시오. 쥐가 뒷다리 발가락 핀치에 반응하지 않도록 하십시오.
   참고: 오전 10시부터 오후 7시 사이에 고정 절차를 수행하여 마우스의 먹이 활동에 미치는 영향을 최소화하십시오.
2. 무릎 관절이 연장되고 발목 관절이 발바닥이 구부러진 척추 위치에 놓인 마우스의 양측 뒷다리에 수술 테이프를 적용하십시오.
3. L4-5 척추 레벨의 트렁크에 알루미늄 와이어(재료 표 참조)를 놓고 나선형 층의각 회전 사이에 5mm 간격으로 뒷다리 주위의 나선형 구성으로 와이어를 코일합니다(그림1A). 와이어를 너무 단단히 코일하지 말고 국부적인 혈류를 방해하지 않도록하십시오.
4. 배선에서 탈출할 가능성을 최소화하기 위해 알루미늄 와이어의 구성을 수동으로 조정하여 90° 납치 위치에서 고관절을 고정시됩니다.
5. 마우스를 원래 케이지로 되돌아갑니다. 3 시간 후, 그들은 마취에서 회복하고 평소와 같이 음식과 물에 액세스 할 수 있는지 확인하십시오.
6. 집 3 - 6 고정하기 전에 케이지 당 고정 마우스.

2. 마우스 위장관 근육의 근육 내 압력 측정

참고: LCC와 결합된 압력 모니터링 실험에서 원통형 단위(36 g, 66 g 및 200g)의 여러 다른 분동을 테스트했습니다. 이러한 측정은 근육 염증 및 위축을 분석하기 위한 실험과 는 별도로 수행되었다(자세한 내용은 3-5단계 참조) 즉, 압력 측정을 받은 마우스는 조직학적 분석에 사용되지 않았다.

1. 압력 측정은 뒷다리 배선 및 LCC에 비해 더 침습적 인 절차 (예 : 피부 절개 및 바늘 삽입)를 포함하기 때문에 세 가지 마취제 (메데토미딘 0.75 mg / kg, midazolam 4.0 mg / kg 및 butorphanol 5.0 mg / kg, butorphanol) 혼합물을 사용합니다. i.p.)를 참조하십시오. 쥐가 뒷다리 발가락 핀치에 반응하지 않도록 하십시오.
2. 마우스를 쉬운 위치에 놓고 전기 면도기로 탈모한 후 후 종아리에 메스로 2mm 절개를 하고 70 % 에탄올 및 클로르헨시딘 흡수 면으로 피부 표면을 반 살균하십시오.
3. 피부 표면에 둔각 (150 ° - 170 °)에서 위장혈증 근육에 20G 주유징 바늘을 삽입하십시오.
4. 바늘의 플라스틱 칼집을 가이드로 사용하여 위천혈의 중간 배에 혈압 텔레미터 (재료 표참조)의 센서를 배치한 다음 근육에서 칼집을 제거합니다.
5. 4-0 나일론 봉합사로 피부를 봉합한 후, 마우스의 종아리에 원통형 단위의 여러 가지 가중치로 LCC를 적용하고(자세한 내용은 3단계 참조), 생물학적 신호 분석을 위한 소프트웨어를 사용하여 근육 내 압력을 모니터링합니다(표 표 참조 재료)를참조하십시오.
6. 마우스를 원래 케이지로 되돌아갑니다. 3 시간 후, 그들은 마취 / 진통에서 회복하고 평소와 같이 음식과 물에 액세스 할 수 있는지 확인하십시오.

3. 마우스 종아리의 국소 주기적 압축(LCC)

1. 근육 내 압력 측정 및 안락사 (즉, 자궁 경부 탈구)를 제외하고 마취를 위해 펜토 바르 비탈 나트륨 (50 mg / kg i.p.)을 사용하십시오.
2. 뒷다리 배선에서 마우스를 분리하고 무릎 관절이 확장되고 발목 관절이 발목 관절이 구부러져 종아리가 위쪽으로 향할 수 있도록 경향이있는 위치에 놓습니다. 무대에서 마우스 뒷다리를 고정하지 마십시오.
3. LCC를 10분 동안 1Hz에서 쿠션패드(그림 1C)로덮인 원통형 중량 단위(그림1B)를수직으로 이동하여 종아리에 7일 동안 적용한다.
4. 매일 LCC의 각 시합 후, 마우스 뒷다리를 다시 와이어.

4. 위장관의 면역성 화학적 분석

1. 세 가지 마취제 (메데토미딘 0.75 mg /kg, 미다졸람 4.0 mg / kg, 및 butorphanol 5.0 mg / kg)의 혼합물의 복강 내 주입에 의해 적절한 마취 / 진통하에 자궁 경부 탈구에 의해 마우스를 안락사.
2. 후방 종아리 표면을 제모 한 후, 피부 절개를하고, 수술 가위를 사용하여 티바이오 섬유 뼈에서 분리하여 위장 근육을 해부하고 신속하게 최적의 절삭 온도 화합물 용액에 동결.
3. 저온 극저온을 사용하여 유리 슬라이드에 위장내 근육의 저온 섹션 샘플을 준비하십시오. 시료를 분석할 때까지 -80°C 냉동고에 보관합니다.
4. 냉동실에서 분석할 위장혈성 저온절 샘플을 꺼내 실온에서 공기 건조시켜 탈수한다.
5. 액체 차단펜을 사용하여 슬라이드의 모든 저온 단면이 포함된 영역을 그립니다. 원은 솔루션이 슬라이드에서 흐르는 것을 방지합니다.
6. 물에 젖은 종이 천으로 촉촉한 환경을 조성하는 트레이에 슬라이드를 놓아 시료의 건조를 피하십시오.
7. 실온에서 30분 동안 차단 완충액(0.25% 카제인, 담체 단백질 및 0.015 M 나트륨 아지드을 함유하는 인산완충식염수)의 100 μL을 적용합니다.
8. PBS-T (0.1 % 폴리 옥시에틸렌 소르비탄 모노 라우 레이트 (재료 표참조)를 함유 한 PBS로 배양하여 슬라이드를 두 번 헹구십시오.
9. 각 샘플에 PBS로 희석된 1차 항체 100 μL을 적용하고, 트레이를 뚜껑으로 덮고, 실온에서 밤새 배양합니다.
10. PBS-T로 3회 세척하십시오(세척시 5분).
11. 각 샘플에 PBS로 희석된 이차 항체 100 μL을 적용하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
    참고: 항 라미닌 염색의 경우 Alexa Fluor 568-컨쥬게이팅 이차 항체를 사용하십시오. 안티 F4/80, 안티 MCP-1 및 안티 TNF-α의 경우, 알렉사 플루어 568- 또는 488-컨쥬게이트 이차 항체를 사용한다.
12. PBS-T로 3회 세척하십시오(세척시 5분).
13. 각 시료에 PBS-T로 희석한 DAPI 용액 100 μL을 적용하고 실온에서 3분 동안 배양합니다.
14. PBS-T로 3회 세척하십시오(각 5분).
15. 시료를 마운팅 매체로 장착하고 커버립으로 덮습니다.

5. 위장관의 히스토 형태 분석

1. 형광 현미경에 샘플 슬라이드를 배치 (재료의 표참조) 적절한 필터와 20 × 목표를 사용하여 샘플을 볼 (DAPI-B, 여기 360/ 40 nm 및 방출460/50 nm; GFP-B, 470/40 여기및 방출을 위한 535/50 nm를 위한 nm; FRITC, 540/25 nm 여기 및 방출을 위한 605/55 nm.
2. 이미지 분석을 위한 소프트웨어를 사용하여(재료 표참조), 각 근화섬유의 단면적(CSA)을 측정하고, F4/80-, MCP-1-및 TNF-α 양성 세포의 수를 계산한다.
   참고 : 항 라미닌-2 면역 염색으로 시각화 된 지하 막의 내부 마진을 추적하여 각 myofiber의 CSA를 결정합니다.

결과

우리의 이전 관찰과 일치^12,위장혈성 myofibers의 CSA는 뒷다리 고정에 의해 현저하게 감소되었다(그림 2A, B). 또한, 우리의 면역 형광 염색 분석은 MCP-1과 TNF-α를 발현하는 세포가 염증 과정 조절에 중요한 역할을한다는 것을 밝혀^13,14,위암혈성 근육에서 크게 증가 고정 된 뒷다리의 조직 (MCP-1 : 그림 2C, F, H; TNF-α: 그림 2D, G,I). F4/80으로 긍정적으로 염색된 세포의 증가와 함께, 대식세포에 대한마커(그림 2C-...

토론

우리는 항 염증 효과가있는 마사지와 같은 기계적 자극을 적용하는 방법을 설명했습니다. 우리의 시스템은 이전에보고 된 것과 비교할 때에도 다음과 같은 장점이 있습니다. 먼저, 이전 연구는 적용된 기계적 힘을 정량적으로 정의하지 않았거나^2를 적용하거나 체표면에서의 측정에 기초하여 그들의 크기를 정의하되, 조직^{내부(10)는}정의하지 않았다. 대조적으로, 우리는 혈압 텔레미터를 사용하여 근육 내 압력을 측정했습니다. 둘째, 우리 장치의 간단한 구조(그림 1B)는우리가 상대적으로 저렴한 비용으로 높은 일관성과 재현성(그림 3A)으로시스템을 구성 할 수있었습니다. 셋째, 우리의 개입 (LCC)은 근육 내 압력 변화와 관련하여 신체 활동 (가벼운 근육 수축)에 관한 것입니다 (50 mmHg^15). 우리의 접근은...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
알루미늄 와이어	DAISO JAPAN	B028	알루미늄 와이어는 와이어에 의한 제한을 피하기 위해 사용됩니다
혈압 원격 측정기	Millar	SPR-671	혈압 측정기는 근육 내압을 측정하는 데 사용됩니다.
DAPI	Thermo Fisher Scientific	D1306	DAPI는 형광 현미경 검사용 DNA를 염색하는 데 일반적으로 사용되는 형광 프로브입니다.
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 (Dilution ratio, 1:500)	Invitrogen	A11034	면역조직화학 염색을 위한 항체.
Goat anti-rat Alexa Fluor 568 (Dilution ratio, 1:500))면역	조직화학 염색을 위한	Invitrogen	A11077
ImageJ	NIH	N/A
LabChart8	AD용		생체 신호 획득을 위한 분석 소프트웨어.
Prolong gold	Thermo Fisher Scientific	P36930	Prolong gold는 염색된 시료를 장착하기 위한 것입니다.
단백질 블록 무혈청	Dako	X090930-2	면역조직화학 절차에서 비특이적 배경 염색을 차단합니다.
Rat monoclonal anti-laminin-2 항체 (희석 비율, 1:1000)	Sigma Aldrich	L0663	면역조직화학 염색을 위한 항체.
Rat monoclonal anti-F4/80 항체 (Dilution ratio, 1:500)	Abcam	ab6640	면역조직화학 염색용 항체.
Rabbit polyclonal anti-MCP-1 항체 (Dilution ratio, 1:1000)	Abcam	ab25124	면역조직화학 염색용 항체.
토끼 다클론 항-TNF-&알파; 항체 (Dilution ratio, 1:1000)	Abcam	ab66579	면역조직화학 염색을 위한 항체.
수술용 테이프	3M Japan	1530EP-0	수술용 테이프는 관절의 움직임을 제한하는 데 사용됩니다.