Integrin 긴장 다양 한 세포 기능에 중요 한 역할을 담당합니다. 통합 긴장 센서 integrin 긴장은 picoNewton (pN) 감도 보정와 서브 마이크론 해상도 몇 군데.
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이 논문에서
요약
초록
Integrin 리간드 결합에 의해 전송 분자 긴장은 많은 세포 기능 및 동작에 중요 한 역할을 재생 integrin 통로에 근본적인 기계 신호입니다. 보정 고 integrin 긴장 높은 힘 감도와 해상도 이미지, 우리는 통합 긴장 센서 (ITS), 형광 긴장 DNA 기반 센서 개발. ITS 힘 분자 수준에서 형광 신호에 따라서 변환 형광 분자 긴장을 유지 하는 경우에 활성화 됩니다. ITS 활성화에 대 한 긴장 임계값은 10-60 pN 잘 셀에서 integrin 긴장의 동적 범위를 커버 하는 범위에서 조정할 수 있습니다. ITS와 융합 하는 기판에 부착 세포의 integrin 긴장 형광에 의해 시각 이며 서브 마이크론 해상도 몇 군데. ITS는 또한 라이브 셀에 고정된 셀 셀 구조 이미징에 호환 됩니다. ITS는 혈소판 수축 및 세포의 연구에 성공적으로 적용 되었습니다. 이 문서는 합성 및 ITS integrin 전송 셀룰러 힘의 연구에의 응용에 대 한 절차를 자세히 설명합니다.
서론
셀은 integrins 준수 및 셀룰러 힘 세포 외 기질을 발휘에 의존 합니다. Integrin 중재 하는 세포 접착 및 힘 전송 셀1,2, 마이그레이션3,4및 생존5,,67확산에 대 한 중요 한 있습니다. 긴 기간에 또한 셀 확산8,,910 와 차별화11,12영향 integrin biomechanical 신호. 연구원은 측정 하는 다양 한 방법을 개발 했다 하며 지도 integrin 전송 휴대 세포-매트릭스 인터페이스에서. 이러한 메서드는 탄성 층13, 배열 micropost....
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프로토콜
여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC, 8-16-8333-나) 아이오와 주립 대학에 의해 승인 되었습니다.
1입니다. 통합 긴장 센서의 합성
- 사용자 지정 하 고 ssDNAs ( 테이블의 자료를 참조)을 주문.
참고: ssDNA 시퀀스는 다음과 같습니다. 위 물가 /5ThioMC6-D/GGG AGG ACG CAG CGG GCC/3BHQ_2 /. 낮은 물가 다음과 같습니다.
12 pN ITS: GGC CCG CTG CGT CCT CCC /3Bio//5Cy3 /
23 pN ITS: GGC CCG CTG CGT CC /iBiodT//5Cy3/CCC
33 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG CTG CG/iBiodT/CCT CCC
43 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG C/iBiodT/G CGT CCT CCC
54 pN ITS: /5Biosg / / iCy3/GGC CCG CTG CGT CCT CCC
여기에서, /5ThioMC6-D / 5' 끝에 thiol 한정자 C6 S S (이황화)를 나타냅니다. /3BHQ_2/ 블랙 홀을 끄는 2 3' 끝을 나타냅니다. / 3Bio /, 5Biosg /, 및 /iBiodT/는 각각....
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결과
ITS와 물고기 keratocytes integrin 긴장 지도 체포 됐다. 그것은 표시는 keratocyte 마이그레이션합니다 integrin 긴장 두 힘 트랙 (그림 2A)에서 생성 됩니다. 힘 지도의 해상도 0.4 µ m (그림 2B) 되도록 보정 했다. 높은 integrin 긴장 뒤쪽 여백 (그림 3A)에 집중 한다. ITS는 또한 다른 세포의 다른 특정 패턴을 보여 줍니다. Nonmotile 셀, NIH-3T3 빠른 마이그레이션 keratocyte의 아주 다른 특정 integrin 긴장 패턴 (그림 3B)을 형성.
Immunostaining와 .......
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토론
ITS는 휴대에 대 한 강력한 기술 강제로 합성 및 응용 프로그램 매핑 아직 매우 액세스할 수 있습니다. 모든 재료 준비, 1 일 이내 ITS는 합성 수 있습니다. 실험, 동안 표면 코팅의 3 단계 셀 도금 전에 필요 합니다. 최근, 우리는 더 ITS 소 혈 청 알 부 민, 유리 또는 폴리스 티 렌 표면33ITS의 직접적인 물리적 흡착 수에 직접 연결 하 여 한 단계로 코팅 절차를 단순화. ITS는 셀룰러 구조 이미징의 유사한 수준에 세포 힘 신호의 형광 강도 제공합니다. 편리한 합성 및 샘플 준비, 현미경 검사 법, 대 한 겸손 한 요구 사항 및 셀룰러 힘에 대 한 높은 감도 ITS 셀 역학의 연구에 대 한 강력 하 고 신뢰할 수 있는 기술을 확인합니다. 이 문서에서 우리는 그것의 합성 및 응용에 대 한 포괄적인 절차를 제시.
RGD 어근 ligand ssDNA와 그것의 합성에서 가장 중요 한 절차 이다. 프로토콜 섹션에서 설명 했 듯.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
이 작품은 아이오와 주립 대학 그리고에 의해 국립 연구소의 일반 의료 과학 (R35GM128747) 제공 시작 기금에 의해 지원 되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| BSA-biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 434301 | |
| 상부 가닥 DNA | 통합 DNA 기술 | N/A | 고객 설계. DNA 염기서열은 PROTOCOL 섹션 |
| 하단 가닥 DNA | 통합 DNA 기술 | N/A | 고객 설계에 나와 있습니다. DNA 염기서열은 PROTOCOL 섹션에 나와 있습니다. |
| sulfo-SMCC | Thermo Fisher Scientific | A39268 | |
| 사이클릭 펩타이드 RGD with an amine group | Peptides International | PCI-3696-PI | |
| IMDM | ATCC | | |
| FBS | ATCC | 302020 | |
| 페니실린 | gibco | 15140122 | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| 200 uL 페트리 접시 | Cellvis | D29-14-1.5-N | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | N/A | 분광계 |
| SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit | Hoefer | SE410-15-1.5 | 전기기공용 장치 |
| CHO-K1 세포주 | ATCC, | CCL-61 | |
| NIH/3T3 세포주 | ATCC | CRL-1658 | |
| 항빈쿨린 항체, | EMD, Millipore | 90227 | 빈쿨린 면역염색용 1차 항체 |
| 염소 항-마우스 IgG(H+L), 초클론 2차 항체, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A28175 | 빈쿨린 면역염색 |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen | A22287 | |
| Eclipse Ti | Nikon | N/A | 현미경 |
참고문헌
- Price, L. S., Leng, J., Schwartz, M. A., Bokoch, G. M. Activation of Rac and Cdc42 by Integrins Mediates Cell Spreading. Molecular Biology of the Cell. 9 (7), 1863-1871 (1998).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell Spreading and Focal ....
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재인쇄 및 허가
