여기서는 3D 매트릭스에서 축산이 자라는 동작을 분석하여 자연 발달을 모방하는 방법을 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
이 프로토콜은 자연타입 I 콜라겐을 사용하여 축산 성장을 모니터링하고 분석하기 위한 3차원(3-D) 하이드로겔을 생성합니다. 프로토콜은 쥐 꼬리 힘줄 유래 유형 I 콜라겐에 의해 형성된 3-D 하이드로겔 내부에 배아 또는 초기 산후 설치류 뇌의 작은 조각을 배양하는 데 중점을 두고 있다. 조직 조각은 하이드로겔 내부에서 배양되고 다공성 매트릭스 내부의 그라데이션을 생성하고 분자를 분비하기 위해 특정 뇌 단편 또는 유전자 변형 세포 응집체에 직면한다. 이 프로토콜의 단계는 간단하고 재현 가능하지만 개발 중에 신중하게 고려해야 할 중요한 단계를 포함합니다. 더욱이, 성장하는 축세포의 거동은 면역세포화학적 방법에 의한 고정 후 상 대비 현미경 또는 모노/다광자 형광 현미경을 사용하여 직접 모니터링하고 분석할 수 있다.
서론
축축액으로 끝나는 뉴런 축은 배아의 세포외 매트릭스(ECM)를 통해 장거리를 이동하여 특정 경로를 통해 적절한 목표에 도달합니다. 상기 성장원뿔은 축속액의 원위부분이며 세포1,2의물리적 및 분자환경을 감지하는 데 특화되어 있다. 분자 관점에서, 성장 콘은 적어도 네 개의 다른 분자 메커니즘에 의해 유도된다: 접촉 매력, 화학 매력, 접촉 반발, 및 다른 축색 유도 큐에 의해 트리거 된 chemorepulsion3,4 , 5개 , 6.접촉 매개 공정은 마이크로 패턴 기판에서 2차원(2D) 배양으로 부분적으로 모니터링할 수 있습니다(예: 줄무늬 7,8 또는 분자를 포함하는 스폿 9). 그러나, 축세포는 환경 4,
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프로토콜
모든 동물 실험은 바르셀로나 대학의 동물 실험 윤리위원회 (CEEA)의 지침과 프로토콜에 따라 수행되었으며,이 연구에서 설치류의 사용을위한 프로토콜은 CEEA에 의해 검토되고 승인되었습니다. 바르셀로나 대학 (CEEA 승인 #276/16 과 141/15).
1. 쥐 꼬리 콜라겐의 정화
- 윤리적 지침에 따라 동물을 희생한 후 성인 스프라그-Dawley 쥐 꼬리(8-9주)를 수집하고 95% 에탄올로 헹구십시오. 2-4 개의 꼬리를 얼음 (4 °C)에 놓고 그 과정에서 얼음으로 덮어 두십시오.
- 꼬리 힘줄을 얻으려면, 지혈을 사용하여 꼬리의 가장 꼬리 척추에 꼬리를 고정하고 첫 번째에서 5-7mm 주위에 배치 두 번째 지혈로 꼬리를 압축합니다. 두 개의 지혈로 날카롭게 비틀어 꼬리를 부러뜨리세요. 이렇게 하려면 척추가 부러지때까지 여러 번 접고 펼칩니다.
- 척추가 나올 때 힘줄을 칼집에서 분리하기 위해 지혈으로 천천히 당깁니다. 이 순간, 작은 가위로 힘줄을 잘라. 이 힘줄 조각을 멸균 100mm 페트리 접시에 얼음에 보관하십시오.
- 힘줄이 완전히 추출 될 때까지 꼬리의 나머지 부분에 대한 클램핑 및 슬라이딩을 반복합니다.
- 획득한 모든 꼬리에 대해 1.2-1.4 단계....
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결과
여기에서, 우리는 배아 마우스 신경계의 3-D 하이드로겔 콜라겐 배양에서 축색 성장을 연구하기 위하여 널리 접근가능한 방법론을 제시합니다. 이를 위해, 우리는 괴수의 쥐 꼬리로부터 콜라겐을 분리하여 배아 뉴런 조직(예를 들어, 해마의 CA 영역)과 대면한 Netrin-1 또는 Sema3E를 발현하는 유전자 변형 세포 응집체를 배양하는 3-D 매트릭스를 생성하였다. 이들 세포 응집체는 콜라겐 매트릭스 내부에 후보 분자의 방사형 분포구배를 형성하였다. 마지막으로, 상이한 분자에 대한 뉴런 반응을 평가하기 위해, 우리는 면역세포화학적 방법(예를 들어, α-TUJ-1)을 사용하여 배양을 표지하고 간단하고 쉬운 정량화 방법을 적용하여, 퍼팅의 효과를 결정하기에 충분한 데이터를 획득하였다. 축색 행동에 후보자.
우리의 실험에서, 해마 축색이 Netrin-1에 직면했을 때, 이 축색은 Netrin-1의 근원을 향해 우선적으로 성장했는데, 이는 네트린-1이 이 축산에 대한 화학적 매력적인 분자.......
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토론
개발 축색의 성장은 주로 침략적이며 ECM 분해 및 리모델링을 포함합니다. 여기에 제시된 절차를 사용하여, 연구원은 축세포 (또는 세포)가 생체 내에서와 같이 유전자 변형 세포에 의해 분비되는 화학 구배에 반응할 수 있는 천연 유형 I 콜라겐에 의해 형성된 균질한 3-D 매트릭스를 얻을 수 있다. 매력적이거나 억제 큐(단백질, 지질 등)의 구배에 대한 상이한 축삭 반응은 특정 대조군(모의 형질감염 세포)과 쉽게 비교될 수 있다. 장점으로, 우리는 힘줄을 분리하기 쉽고 실제로 그들은 동물 실험의 잔재가 될 수 있음을 언급해야합니다. 또한, 힘줄은 피부 나 폐(31)와같은 다른 조직에 비해 고농도의 콜라겐이다.
여기에 제시된 방법론은 수행하기가 간단하지만 프로세스 중에 특별한 주의가 필요한 몇 가지 단계가 있습니다. 콜라겐 추출과 관련하여, 콜라겐 순도와 겔화의 질을 향상시키기 위해 꼬리 힘줄에서 원치 않는 혈관과 피부 이물질을 제거하는 것.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
저자는 편집 조언과 기술 지원에 대한 M. 세구라 펠리우에 대한 톰 요한난 에게 감사드립니다. 이 작품은 CERCA 프로그램과 혁신의 학과의 대학 및 연구위원회에 의해 투자되었다, 대학, 일반 카탈루냐의 기업 (SGR2017-648). 이 작품은 연구의 스페인 정부에 의해 투자되었다, 혁신과 대학 (MEICO) BFU2015-67777-R 및 RTI2018-099773-B-100, 스페인 프리온 네트워크 (프리오네트 스페인 AGL2017-90665-REDT), 그리고 연구소 카를로스 III, CIBERNED ( PRY-2018-2).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Material | |||
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets (DAB) | Sigma | D5905 | |
| Adult Sprague-Dawley rats (8-9 weeks) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) | Vector Labs | PK-4000 | |
| B27 무혈청 보충제 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| Bicinchoninic acid (BCA) 단백질 분석 키트 | Pierce | 23225 | |
| cDNA 플라스미드 벡터, | |||
| COS1 세포주 | ATTC | CRL-1570 | |
| D-(+)-글루코스 | Sigma | 16325 | |
| D-(+)-글루코스(물 내 45% 용액) 완전한 Neurobasal 배지 | Sigma | G8769 | |
| COS1 배양 배지용 D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1x ) | Invitrogen | 41966-029 | |
| Dulbecco' s 인산염 완충 식염수 10x (Ca2+ 및 Mg2++) (D-PBS) 배양을 위한 | Invitrogen | 14200 | |
| 에탄올 | 머크 | 108543 | |
| 에틸렌디아민테트라아세트산 이수화물 디소듐 염 (EDTA) | 시그마 | E5134 | |
| 형광 장착 매체 (예: Fluoromount-G 또는 유사) | 전자 현미경 과학 (EMS) | 17984-25 | |
| 젤라틴 분말 | 시그마 | G1890 | |
| 빙초산 (Panreac, cat. no. 211008) | Panreac | 211008 | |
| Hank' S 균형 잡힌 소금 용액 | Invitrogen | 24020083 | |
| 열 비활성화 태아 소 혈청 | Invitrogen | 10108-165 | |
| 열 비활성화 말 세럼 | Invitrogen | 26050-088 | |
| 과산화수소 (H2O2, 물 중 32 - 33%) | 완전한 | ||
| L-glutamine 200 mM 용액 (100x) | Invitrogen | 25030-024 | |
| Lipofectamine 2000 시약 | Invitrogen | 11668-019 | |
| 임산부 암컷 생쥐 (배아 일 12.5 - 16.5; E12.5-16.5) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| 수정된 최소 필수 매체 독수리 (MEM) | Invitrogen | 11012-044 | |
| Class III β-tubulin (clone TUJ-1) | Biolegend | 801201 | |
| N-2 보충제 100x에 | Invitrogen | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| 파라포름알데히드 | Merck | 1,040,051,000 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 용액 100x | Invitrogen | 15140-22 | |
| 인산염 완충 식염수 10x (PBS) 면역세포화학을 위한 | Invitrogen | AM9624 | |
| 이차 항체: 바이오틴화된 말 항-마우스 | Vector Labs | BA-2000 | |
| 무혈청 매체 (Opti-MEM) | Invitrogen | 11058-021 | |
| 아지드화나트륨 | Panreac | 162712 | |
| 중탄산 나트륨 용액 7.5% | Invitrogen | 25080-094 | |
| 멸균 배양 등급 H2O | 시그마 | W3500 | |
| 트리톤TM X-100 | 시그마 | X100 | |
| 트리즈마 베이스 | Sigma | T1503 | |
| Trypsin-EDTA (Trypsin (0.05% (wt/vol) with EDTA (1x) | Invitrogen | 25300-054 | |
| Equipment | |||
| 1 큰 곡선 가위와 1개의 작은 곡선 가위; | 정밀한 도구 기구 또는 유사한 | ||
| 1.5 mL 원뿔형 원심분리기 튜브 | Eppendorf 또는 이와 유사한 | ||
| 15 mL 코니컬 원심분리기 튜브 | Corning 또는 이와 유사한 | ||
| 2개의 지혈제 | 세밀한 도구 기구 또는 유사 | ||
| 2개의 작은 직선 해부 가위 | 고급 도구 기구 또는 유사한 | ||
| 200 mL 원심분리 튜브, 원심분리용 | Nalgene 또는 유사한 | ||
| 200 mL 멸균 유리 원뿔형 플라스크, | |||
| 2 L 유리 비커 | |||
| 4- 및 6-웰 배양 플레이트 | Nunc | 176740 및 140675 | |
| 자동 피펫 펌프 및 일회용 10 mL 및 25 mL 필터 함유 멸균 플라스틱 피펫. | Gilson, Brand, Eppendorf 또는 이와 유사 | ||
| 자동 피펫, 멸균 필터 팁 및 최신 멸균 팁 | Gilson, Eppendorf 또는 이와 유사한 | ||
| 각도 고정 로터가 있는 벤치 탑 마이크로 원심분리기 | Eppendorf, Beckman Coulter 또는 이와 유사한 | ||
| 스윙 버킷 로터가 있는 벤치탑 냉장 원심분리기(1.5, 15 및 50 mL 튜브 어댑터 포함) | Eppendorf, Beckman Coulter 또는 이와 유사한 | ||
| 세포 배양 인큐베이터(37 °); C, 5% CO2 및 95% 공기 | |||
| 투석 튜빙 셀룰로오스 막 | Sigma | D9402 | |
| 투석 튜빙 클로저 | Sigma | Z37101-7 | |
| 일회용 유리 피펫 | |||
| 암시야 광학이 있는 해부 현미경 | Olympus SZ51 또는 동급 | ||
| 고속 냉장 Beckman Coulter 원심분리기 또는 이와 유사한 각도 고정 로터 | |||
| 층류 후드 | |||
| 대형 100 mm, 60 mm 및 소형 35 mm Ø 세포 배양 접시 | 수녀 | 150679, 150288, 150318, 각각 | |
| 자석 교반기 및 자석 스핀 바 | IKA 또는 유사한 | ||
| McIlwain 조직 초퍼 | Mickle Laboratory Engineering | ||
| 한 쌍의 세밀한 직선 집게와 한 쌍의 곡선형 집게 | 정밀 도구, 기구 또는 이와 유사한 | ||
| 것, 조직 다지기 | |||
| 메스(15번 및 11번), | |||
| 콜라겐 및 조직 조각을 옮기기 위한 두 쌍의 미세한 주걱 | 고급 도구, 기구 또는 이와 유사한 |
참고문헌
- Ramón y Cajal, S. Les nouvelles idées sur la structure du système nerveux chez l'homme et chez les vertébrés. , (1894).
- Ramón y Cajal, S. Nuevo concepto de la histología de los centros nerviosos. , (1893).
- Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Ts....
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재인쇄 및 허가
