방법 논문

신경계 발달 중 축산 성장과 행동을 분석하는 3-D 콜라겐 기반 하이드로겔 생성

5.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/59481

⸱

2019년 6월 25일

 , 
1Molecular and Cellular Neurobiotechnology, Institute for Bioengineering of Catalonia (IBEC), The Barcelona Institute of Science and Technology (BIST), Parc Científic de Barcelona, 2Department of Cell Biology, Physiology, and Immunology, Universitat de Barcelona, 3Center for Networked Biomedical Research on Neurodegenerative Diseases (CIBERNED), 4Institute of Neuroscience, University of Barcelona

이 논문에서

요약

여기서는 3D 매트릭스에서 축산이 자라는 동작을 분석하여 자연 발달을 모방하는 방법을 제공합니다.

초록

이 프로토콜은 자연타입 I 콜라겐을 사용하여 축산 성장을 모니터링하고 분석하기 위한 3차원(3-D) 하이드로겔을 생성합니다. 프로토콜은 쥐 꼬리 힘줄 유래 유형 I 콜라겐에 의해 형성된 3-D 하이드로겔 내부에 배아 또는 초기 산후 설치류 뇌의 작은 조각을 배양하는 데 중점을 두고 있다. 조직 조각은 하이드로겔 내부에서 배양되고 다공성 매트릭스 내부의 그라데이션을 생성하고 분자를 분비하기 위해 특정 뇌 단편 또는 유전자 변형 세포 응집체에 직면한다. 이 프로토콜의 단계는 간단하고 재현 가능하지만 개발 중에 신중하게 고려해야 할 중요한 단계를 포함합니다. 더욱이, 성장하는 축세포의 거동은 면역세포화학적 방법에 의한 고정 후 상 대비 현미경 또는 모노/다광자 형광 현미경을 사용하여 직접 모니터링하고 분석할 수 있다.

서론

축축액으로 끝나는 뉴런 축은 배아의 세포외 매트릭스(ECM)를 통해 장거리를 이동하여 특정 경로를 통해 적절한 목표에 도달합니다. 상기 성장원뿔은 축속액의 원위부분이며 세포1,2의물리적 및 분자환경을 감지하는 데 특화되어 있다. 분자 관점에서, 성장 콘은 적어도 네 개의 다른 분자 메커니즘에 의해 유도된다: 접촉 매력, 화학 매력, 접촉 반발, 및 다른 축색 유도 큐에 의해 트리거 된 chemorepulsion3,4 , 5개 , 6.접촉 매개 공정은 마이크로 패턴 기판에서 2차원(2D) 배양으로 부분적으로 모니터링할 수 있습니다(예: 줄무늬 7,8 또는 분자를 포함하는 스폿 9). 그러나, 축세포는 환경 4,5,10에서가이드포스트 세포로부터 여러 매력적이고 반발성 분자를 감지함으로써 비확산 방식으로 그들의 표적을 탐색할 수 있다. 여기에서, 우리는 분비된 분자가 축산 개발에 chemorepulsive 또는 chemo매력적인 효력을 유도하는지 검사하는 3-D 문화의 쉬운 방법을 기술합니다.

초기 연구는 3차원(3-D) 행렬에서 배양 배양을 이용한 축삭 유도 큐의 효과를 확인하기 위한 것으로, 생체 조건에서 시뮬레이션하는 그라데이션을 생성하기 위해11,12. 이 접근법은 생체 내 실험과 함께, 네가지 주요 가족인 네 가지 주요 가족인 네트린, 슬릿, 세마포린스 및 에프린4,5,6의식별을 허용하였다. 이러한 분자 큐 및 기타 인자(13)는 성장하는 축색에 의해 통합되어, 접착 복합체의 역학을 유발하고 세포골격14,15,16을통해 기계적 힘을 변환한다. 축삭 항법용 3-D 배양물에서 분자 그라데이션을 생성하기 위해, 선구적인 연구자들은 플라즈마 혈전 기판17을사용했으며, 이는 또한 organotypic 슬라이스 제제18에사용되었다. 그러나, 1958년, 3-D 콜라겐 하이드로겔을 생성하는 새로운 프로토콜은 Maximow의 장치19,배양 플랫폼으로 연구를 위해 보고되었으며, 현미경 관찰에 적합한 여러 연구에서 20. 또 다른 개척자 연구는 상처 치유 과정에서 섬유아세포의 분화를 연구하기 위한 인간 섬유아세포를 삽입하는 도구로서 콜라겐 겔을 보고했다21. 병행하여, Lumsden과 데이비스는 소 진피로부터 콜라겐을 적용하여 감각 신경 섬유22의유도에 대한 신경 성장 인자(NGF)의 가증효과를 분석하였다. 다른 회사 및 실험실에 의한 새로운 배양 플랫폼(예: 다중 웰 플레이트)의 개발로, 콜라겐배양은 이러한 새로운 장치 6,23,24,25에 적용되었다. ,26. 병행하여, 엥겔브레스-홀름-스웜 종양 세포주에서 유래된 ECM 물질의 추출물이 이들 연구를 확장하기 위해 시판되었다27.

최근에는 3D 하이드로겔(예: 콜라겐, 피브린 등)을 사용하여 축세포 유도에 가제적 역할을 하는 분자 구배를 생성하기 위한 여러 프로토콜이 개발되었습니다. 28.대안적으로, 후보 분자는 다공성 매트릭스(예를 들어, NGF29)에서상이한 농도로 고정화될 수 있거나 또는 3-D 하이드로겔 세포 응집체의 작은 영역에서 배양하여 생성된 분자를 분비하여 방사형을 생성할 수 있다. 그라데이션 4,23,24,25,26. 마지막 가능성은 이 프로토콜에 설명됩니다.

여기에 제시된 절차는 배아 마우스 뇌의 3-D 하이드로겔 배양에서 축색 성장의 분석을 기반으로 쉽고 빠르며 매우 재현 가능한 방법입니다. 다른 방법과 비교하여, 프로토콜은 훈련되지 않은 연구자에게 적합하며 짧은 훈련 (1-2 주) 후에 완전히 개발 될 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 우리는 먼저 유전자 변형 세포 응집체가 배아 신경 조직 의 앞에 배양되는 3-D 행렬을 생성하기 위하여 성숙한 쥐 꼬리에서 교원을 격리합니다. 이 세포 응집체는 성장하는 축색에 대한 반응을 유도하는 후보 분자의 방사형 화학 구배를 형성합니다. 마지막으로, 성장하는 축색에 대한 분자의 효과에 대한 평가는 상 대비 현미경 또는 대안적으로 면역 세포화학적 방법을 사용하여 쉽게 수행될 수 있다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

모든 동물 실험은 바르셀로나 대학의 동물 실험 윤리위원회 (CEEA)의 지침과 프로토콜에 따라 수행되었으며,이 연구에서 설치류의 사용을위한 프로토콜은 CEEA에 의해 검토되고 승인되었습니다. 바르셀로나 대학 (CEEA 승인 #276/16 과 141/15).

1. 쥐 꼬리 콜라겐의 정화

  1. 윤리적 지침에 따라 동물을 희생한 후 성인 스프라그-Dawley 쥐 꼬리(8-9주)를 수집하고 95% 에탄올로 헹구십시오. 2-4 개의 꼬리를 얼음 (4 °C)에 놓고 그 과정에서 얼음으로 덮어 두십시오.
  2. 꼬리 힘줄을 얻으려면, 지혈을 사용하여 꼬리의 가장 꼬리 척추에 꼬리를 고정하고 첫 번째에서 5-7mm 주위에 배치 두 번째 지혈로 꼬리를 압축합니다. 두 개의 지혈로 날카롭게 비틀어 꼬리를 부러뜨리세요. 이렇게 하려면 척추가 부러지때까지 여러 번 접고 펼칩니다.
  3. 척추가 나올 때 힘줄을 칼집에서 분리하기 위해 지혈으로 천천히 당깁니다. 이 순간, 작은 가위로 힘줄을 잘라. 이 힘줄 조각을 멸균 100mm 페트리 접시에 얼음에 보관하십시오.
  4. 힘줄이 완전히 추출 될 때까지 꼬리의 나머지 부분에 대한 클램핑 및 슬라이딩을 반복합니다.
  5. 획득한 모든 꼬리에 대해 1.2-1.4 단계를 반복합니다.
  6. 현미경으로 힘줄을 관찰하십시오. 작은 가위로 자르고 직선 미세 집게로 잡고 힘줄의 순도를 개선하고 힘줄을 초순수로 3 회 헹구십시오.
  7. 젖은 힘줄 3-4g을 수집합니다. 200-250 mL 유리 원추형 플라스크에서 4 °C에서 3 % 빙하 아세트산의 150 mL에서 힘줄을 24-36 시간 동안 부드럽게 저어줍니다.
  8. 원심분리기 20,000 x g : 1 시간. 병렬로, 길이 약 10-15cm의 조각을 절단하여 투석 튜브 멤브레인을 준비하고 1mMM에 의해 1mM에 함유 된 초순수 (EDTA)에서 15 분 동안 끓입니다. 그 후, 초순수로 투석 막을 부드럽게 헹구십시오.
  9. 원심분리 후, 투석 튜브 막에서 상판액을 데인션으로 수집한다. 펠릿에는 산성 불용성 물질 (비 콜라겐 단백질)이 포함되어 있으며 상급 물질에는 수용성 콜라겐 단백질이 포함되어 있습니다.
  10. 2-5 L 유리 비커에서 멸균 0.1x 최소 필수 미디엄 이글(MEM), pH 4.0의 2L에 대해 상황을 투석합니다. 3 일 동안 투석하십시오. 사용하기 전에 하루에 두 번 0.1x MEM 솔루션을 변경하여 모든 변경 시 pH를 확인하십시오. pH가 기본으로 바뀌면 pH가 4.0이 될 때까지 0.1 M 아세트산 몇 방울로 수정하십시오.
  11. 투석 후, 투석 콜라겐 용액에 항생제 (페니실린 / 스트렙토 마이신 (Pen-Strep)의 1.5 mL)를 추가하십시오. 콜라겐 스톡 용액의 5 mL aliquots를 만들고 4 °C에 보관하십시오.
    참고: 이 시점부터 모든 취급 절차는 층류 후드의 멸균 조건하에서 수행되어야 합니다.
  12. 다음 단계에 따라 제조된 콜라겐 스톡 용액의 겔화 테스트를 진행한다.
    1. 스톡 콜라겐은 일반적으로 너무 농축되어 있기 때문에, 0.1x MEM, pH 4.0으로 주식을 희석시킴으로써 3가지 작업 희석(75%, 50%, 25% 콜라겐 용액)을 준비한다. 각 작업 희석에 권장되는 최종 부피는 5 mL입니다. 각 조건에서, 단백질 색색 분석법을 사용하여 단백질 농도를 확인한다.
    2. 빈 1.5 mL 원추형 원심분리튜브(각 작동 희석에 대해 하나씩), MEM 튜브 10x, 중탄산나트륨 용액 7.5%, 얼음위에 콜라겐의 다양한 작용 희석액을 놓습니다. 냉각될 때까지 기다립니다.
    3. 감기(4°C) 원심분리튜브에 40-50 μL의 10x MEM을 넣습니다. 다음으로, 중탄산나트륨 용액 7-8 μL과 부드럽게 섞으세요.
    4. 이 튜브에 다른 콜라겐 희석제 중 하나의 310-330 μL을 추가하고 거품 형성을 피피피펫과 부드럽게 섞습니다. 콜라겐-MEM-중탄산나트륨 혼합물을 얼음(4°C)에 적어도 5분 동안 보관하십시오.
    5. 35 mm 페트리 접시에 혼합물의 피펫 10-25 μL.
    6. 하이드로겔의 겔화가 관찰될 때까지 37°C로 설정된 CO2 인큐베이터에 페트리 접시를 놓는다(±15-20분).
    7. 다른 페트리 접시에 남아있는 콜라겐 희석에 대해 1.12.3-1.12.6 단계를 반복합니다.
    8. 최상의 결과를 렌더링하는 콜라겐 작업 희석을 선택합니다.
      참고: 가장 좋은 겔화 하이드로 겔은 균일 한 반투명 질감, 회색 색상을 가져야하며 울퉁불퉁하거나 끈적하지 않아야합니다. 우리의 경험에서, 3:1 (콜라겐: 0.1x MEM)의 희석은 최상의 실험 결과를 생성합니다.

2. 세포 (COS1)의 준비는 3-D 콜라겐 하이드로 겔에서 후보 분자를 분비하기 위해 유전자 변형 응집체

  1. 플레이트 2 x 106 COS1 세포를 35 mm 페트리 접시에 넣고 100 mL의 D-MEM으로 구성된 완전한 배양 배지로 배양하여 열불활성화 된 태아 소 혈청, 0.5 % (wt / vol) 글루타민 및 1 % (wt / vol) 펜 / 스트렙 세포 배양 하룻밤 사이에 70-80 %의 합의에 도달하기 위해 인큐베이터. 각 형질 전환 절차에 대해 페트리 접시 를 준비합니다.
  2. 다음날 COS1 세포를 제조사의 지시에 따라 리포솜 계 형질전환 방법을 사용하여 후보 분자(Netrin-1 또는 Sema3E)를 코딩하는 DNA를 가진 트랜스펙트.
    1. 이렇게 하려면 250 μL의 무혈청 배지와 DNA(조건당 1-2 μg)를 1.5 mL 원심분리기 튜브(DNA 튜브)에 혼합하고 혼합합니다. 5분 동안 실온(RT)에서 배양. 240 μL의 혈청 프리 배지 및 10 μL의 리포좀 형혈 시약에 첨가하여 제2 튜브(리포좀 튜브)를 준비한다. RT에서 5분 동안 배양합니다.
    2. 배양 후, DNA-튜브의 함량을 리포좀 튜브에 넣고 부드럽게 섞는다. 이제 RT에서 15 분 동안 배양. 배양 된 세포의 배지를 혈청이없는 배지의 1.5 mL로 교체하고 DNA -리포솜 혼합물을 페트리 접시에 천천히 떨어 뜨립니다. CO2 세포 배양 인큐베이터에서 3시간 동안 배양한다.
  3. 3h의 형질전환 배양 후, 배지를 완전한 배양 배지로 대체하고 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양한다.
  4. 다음날, 0.1 M 덜베코의 인산 완충 식염수(D-PBS)로 세포를 헹구고, 트립신-EDTA(CO2 인큐베이터에서 5-15분 동안 각 접시당 800 μL)로 배양을 치료하고, 완전한 배양 배지 15 mL로 분리된 세포를 수집합니다.
  5. 세포를 130 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심 분리 후, 매체를 제거하고 얼음에 COS1 세포를 포함하는 펠릿을 보존.
  6. 1.12.3-1.12.6 단계를 반복하여 콜라겐 작동 혼합물을 준비한다.
  7. 형질감염된 세포의 펠릿에 콜라겐 혼합물100-150 μL을 넣고 이 혼합물을 위아래로 파이프팅하여 부드럽게 혼합하고 페트리 접시(직경 35 mm)에 45-50 μL을 퍼뜨리고 길이 약 1-1.5 cm의 콜라겐 세포 밴드를 형성합니다. 겔화(±15-20분)가 관찰될 때까지접시를 37°C(5% CO2)에서 인큐베이터에 놓습니다.
  8. 제2 배양접시에 대조세포(모의형형질)를 함유하고 인큐베이터(±15-20분)에 플레이트를 넣고 겔화시 3-4 mL의 온난화(37°C) COS1 완전 배양배지를 겔화한 각 접시에 첨가하여 준비한다. 콜라겐-세포 스트립을 CO2 세포 배양 인큐베이터에 보관한다. 그 후, 콜라겐 세포 스트립을 잘라 미세한 메스 또는 조직 다기를 사용하여 작은 정사각형 조각(길이 400 내지 500 μm)을 생성한다.
  9. 동일한 형질전환 상태에서 뉴런 배양 배지(NCM)의 3-3.5 mL를 함유하는 페트리 접시로 모든 절편을 옮기고 해부 현미경으로 조각의 품질을 확인한다. 다시, CO2 세포 배양 인큐베이터에 보관한다.
    참고: 신경 배양 배지는 1-5%(vol/vol) 열 불활성화 말 혈청, 2 mM 글루타민, 0.5% (wt/vol) 포도당, 1% (wt/vol) 펜-스트렙 용액 및 0.044%(wt/vol) NaHCO3를포함하는 신경기저 배지로 구성된다. pH가 7.2-7.3 사이인지 확인합니다.

3. 배아배전의 생성

  1. 일상적인 멸균 지침에 따라 오토클레이브를 사용하여 수술 도구(가위, 메스 블레이드 손잡이, 직선 및 곡선 집게)를 살균합니다. 행적으로 행적으로 행크의 균형 소금 용액 - 포도당 버퍼의 500 mL와 HBSS-G의 10mL를 포함하는 4-5 페트리 접시 (100mm 직경)를 준비합니다. 이 판을 얼음(4°C)에 놓습니다.
  2. 승인된 윤리적 절차에 따라 멸균 부위 밖에서 임신한 암컷 쥐(배아일 16.5)를 희생한다. 복강에서 가위로 배아 뿔을 자르고 차가운 HBSS-G가 들어있는 큰 페트리 접시에 넣습니다.
  3. 접시를 층류 후드에 놓고 직선 집게로 배아를 추출합니다. 차가운 HBSS-G가 들어있는 새로운 접시에 넣습니다. 다음으로, 작은 집게를 사용하여 배아의 피부를 제거하고 조심스럽게 곡선 및 직선 집게를 사용하여 뇌를 해부. 차가운 HBSS-G가 들어있는 접시에 넣습니다.
  4. 해부 현미경으로, 메스 또는 미세 가위로 두 반구를 분리하고 미세 한 집게로 뇌 조각에서 뇌, 수막 및 혈관을 제거하기 위해 중간선을 따라 반으로 뇌를 잘라냅니다.
  5. 3.3-3.4단계를 나머지 배아와 함께 반복한다. 조직의 품질을 보존하기 위해 2 시간 이상 해부를 지연시키지 마십시오.
  6. 100 % 에탄올 (특히 폴리테트라 플루오로에틸렌 (PTFE) 절단 판과 면도날)으로 조직 헬기의 모든 부분을 청소하십시오. 티슈 헬기를 UV 조명 아래에 있는 라미나 플럭스 후드에 15분 동안 보관하십시오.
  7. 각 조직 조각 (예를 들어, 해마피질)을 조직 헬기의 절단 판으로 옮긴다. 해마의 경우 면도날에 수직으로 놓고 두께가 450-500 μm의 조직 절편을 얻습니다.
  8. 완전한 NCM 3-4 mL로 35mm 페트리 접시를 준비하고 티슈 헬기 접시에서 페트리 접시로 티슈 조각을 옮김을 옮김을 옮김을 준비합니다. 관심 지역이 해부되기 때문에 많은 요리가 필요할 수 있습니다.
  9. 미세 텅스텐 바늘을 사용하여 전체 NCM에서 조직 해부를 완료합니다. 해부 현미경에서 얻은 조각의 품질을 확인합니다. 층이 암흑 시야 광학에서 명확하게 식별 가능한지 확인하고 텅스텐 바늘로 관심 영역 (예 : 해마의 CA 영역)을 해부하십시오. 손상된 조각을 버리십시오. CO2 인큐베이터에서 완전한 NCM 배지에 해마 박자를 유지한다.

4. 콜라겐 하이드로겔3D 공동배양준비

  1. 여러 개의 멸균 된 4 웰 배양 플레이트를 층류 후드에 놓고 1.12.2-1.12.6 단계에서 이전에 표시된 바와 같이 콜라겐 작업 혼합물을 준비합니다.
  2. 하이드로겔 혼합물의 15-20 μL을 웰 의 바닥에 놓고 원형 콜라겐 베이스를 생성합니다. 나머지 웰에 대해 이 단계를 반복합니다. 하이드로겔 염기에서 과도한 액체 증발을 방지하기 위해 5 개 이상의 플레이트를 동시에 준비하지 마십시오.
  3. 완전한 겔화 (± 15-20 분)가 관찰 될 때까지 인큐베이터에 접시를 보관하고 겔화가 완료 된 경우에만 인큐베이터에서 접시를 꺼냅니다. 겔화 된 콜라겐의 품질을 확인하십시오.
  4. 작은 COS1 셀 골재조각을 파이펫으로 옮김으로 옮김을 옮겼습니다. 하이드로겔 베이스에 놓고 하나의 배전 크기로 세포 골재에 가까운 피펫으로 조직 조각을 동일한 베이스에 놓습니다.
  5. 1.12.2-1.12.6 단계에서와 같이 얼음에 새로운 작동 콜라겐 혼합물을 준비하십시오.
  6. 이 새로운 혼합물의 15-20 μL을 부드럽게 피펫하고 배전 및 세포 골재를 덮는다. 샌드위치 와 같은 하이드로 겔 배양이 관찰됩니다. 이 순간, 미세 텅스텐 바늘로 이식을 다시 배향 (COS1 세포 골재를 만지지 마십시오!), 그래서 ± 500-600 μm에서 세포 집계에 직면.
  7. 겔화가 관찰될 때까지 플레이트를 인큐베이터로 되돌려(±10-15 분), 완전한 NCM의 0.5 mL을 2% B27 보충제로 보충하고 인큐베이터에서 36 내지48시간 동안 배양을 유지한다(37°C, 5% CO2).

5. 이식 세포 골재 공동 배양 및 면역 세포 화학 절차의 고정

  1. 36-48시간 의 배양 후, 배지를 제거하고 0.1 M 인산완충식염수(PBS), pH 7.3으로 헹구었다. 그 후, 4°C에서 0.1 M 인산완충(PB), pH 7.3에서 4% 파라포름알데히드로 1시간 동안 배양체를 고정한다.
  2. 고정제를 제거하고 0.1 M PB, pH 7.3에서 배양액을 3-4회(각 10-15분)로 부드럽게 헹구십시오.
  3. 하이드로겔 샌드위치를 주걱이나 집게로 우물 바닥에서 분리합니다. 0.1 M PBS를 함유한 6웰 배양 플레이트에 0.5% 비이온성 세제를 함유한 미세 페인트브러시로 콜라겐 블록을 옮김을 옮김.
  4. 완만한 교반을 가진 RT에서 2-3시간 동안 차단 용액에 자유 부유 하이드로겔(10% 혈청, 0.5% 비이온 계면활성제, 0.2% 젤라틴 0.2% 0.2% +0.1 M PBS)을 배양하였다.
  5. 0.1 M PBS로 3회(각각 10-15분)를 헹구고 0.5% 비이온계면활성제를 함유하였다.
  6. 5% 혈청, 0.5% 비이온 계면활성제, 0.2% 젤라틴 및 0.02% 아지드 나트륨을 함유하는 PBS에서 희석된 원발성 항체와 배양한다. 쉐이커상에서 4°C에서 36-48시간 동안 1차 항체와 배양한다.
    참고: 일반적으로 III β-tubulin 클래스(α-TUJ-1)(희석된 1:2,000)에 대하여 항체는 3-D 하이드로겔 배양물에서 축산 성장을 정의하기 위하여 이용된다.
  7. 배양 후 5.5 단계에서와 같이 헹네하십시오.
  8. RT에서 4 시간 동안 이차 항체와 배양 (또는 6-7 h 에서 4 °C) 쉐이커에 5 % 혈청, 0.5 % 비 이온 계면 활성제 및 0.2 % 젤라틴을 희석시켰다. 이 실험에서 말 항마우스 생체항체(희석1:200)가 사용된다.
  9. 5.5에서와 같이 헹위합니다.
  10. 아비딘-비오틴 복합체(ABC) 용액1:100을 5% 혈청, 0.5% 비이온 계면활성제 및 0.2% 젤라틴을 함유하는 PBS에서 희석하여 4°C에서 2일 동안 배양하였다. 또는 고추냉이 과산화아제(HRP)-태그가 붙은 스트렙타비딘(희석 1:300-400)을 동일한 완충액으로 사용하십시오.
  11. 5.5에 기재된 바와 같이 헹위합니다.
  12. 0.1 M 트리스-HCl 버퍼, pH 7.6 을 1시간 동안 배양액을 여러 번 헹급한다.
  13. 0.1 M 트리스-HCl, pH 7.6에서 3,3′-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드(DAB) 용액의 0.03%로 배양한다.
  14. 1% H2O2의 5-8 μL을 추가하고 10-15 분 기다립니다. 4-10x 목표를 사용하여 현미경으로 DAB의 발달을 모니터링하십시오.
  15. 0.1 M Tris-HCl 버퍼, pH 7.6으로 DAB 용액을 제거하여 반응을 멈춥시다.
  16. 30분 동안 PBS에서 배양을 헹구고(여러 가지 변경).
  17. 하이드로겔을 수성 기반 마운팅 매체를 사용하여 유리 슬라이드에 장착합니다.
  18. Sholl 분석 플러그인 또는 ImageJ 소프트웨어(30)에 대한 NeuriteJ 플러그인을 사용하여 하이드로겔내부의 축산의 길이 및 분포를 분석한다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

여기에서, 우리는 배아 마우스 신경계의 3-D 하이드로겔 콜라겐 배양에서 축색 성장을 연구하기 위하여 널리 접근가능한 방법론을 제시합니다. 이를 위해, 우리는 괴수의 쥐 꼬리로부터 콜라겐을 분리하여 배아 뉴런 조직(예를 들어, 해마의 CA 영역)과 대면한 Netrin-1 또는 Sema3E를 발현하는 유전자 변형 세포 응집체를 배양하는 3-D 매트릭스를 생성하였다. 이들 세포 응집체는 콜라겐 매트릭스 내부에 후보 분자의 방사형 분포구배를 형성하였다. 마지막으로, 상이한 분자에 대한 뉴런 반응을 평가하기 위해, 우리는 면역세포화학적 방법(예를 들어, α-TUJ-1)을 사용하여 배양을 표지하고 간단하고 쉬운 정량화 방법을 적용하여, 퍼팅의 효과를 결정하기에 충분한 데이터를 획득하였다. 축색 행동에 후보자.

우리의 실험에서, 해마 축색이 Netrin-1에 직면했을 때, 이 축색은 Netrin-1의 근원을 향해 우선적으로 성장했는데, 이는 네트린-1이 이 축산에 대한 화학적 매력적인 분자...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

개발 축색의 성장은 주로 침략적이며 ECM 분해 및 리모델링을 포함합니다. 여기에 제시된 절차를 사용하여, 연구원은 축세포 (또는 세포)가 생체 내에서와 같이 유전자 변형 세포에 의해 분비되는 화학 구배에 반응할 수 있는 천연 유형 I 콜라겐에 의해 형성된 균질한 3-D 매트릭스를 얻을 수 있다. 매력적이거나 억제 큐(단백질, 지질 등)의 구배에 대한 상이한 축삭 반응은 특정 대조군(모의 형질감염 세포)과 쉽게 비교될 수 있다. 장점으로, 우리는 힘줄을 분리하기 쉽고 실제로 그들은 동물 실험의 잔재가 될 수 있음을 언급해야합니다. 또한, 힘줄은 피부 나 폐(31)와같은 다른 조직에 비해 고농도의 콜라겐이다.

여기에 제시된 방법론은 수행하기가 간단하지만 프로세스 중에 특별한 주의가 필요한 몇 가지 단계가 있습니다. 콜라겐 추출과 관련하여, 콜라겐 순도와 겔화의 질을 향상시키기 위해 꼬리 힘줄에서 원치 않는 혈관과 피부 이물질을 제거하는 것...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

저자는 편집 조언과 기술 지원에 대한 M. 세구라 펠리우에 대한 톰 요한난 에게 감사드립니다. 이 작품은 CERCA 프로그램과 혁신의 학과의 대학 및 연구위원회에 의해 투자되었다, 대학, 일반 카탈루냐의 기업 (SGR2017-648). 이 작품은 연구의 스페인 정부에 의해 투자되었다, 혁신과 대학 (MEICO) BFU2015-67777-R 및 RTI2018-099773-B-100, 스페인 프리온 네트워크 (프리오네트 스페인 AGL2017-90665-REDT), 그리고 연구소 카를로스 III, CIBERNED ( PRY-2018-2).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Material
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets (DAB)SigmaD5905
Adult Sprague-Dawley rats (8-9 weeks) Criffa-Credo, Lyon, France
Avidin-biotin-peroxidase complex (ABC)Vector LabsPK-4000
B27 무혈청 보충제 50x Invitrogen17504-044
Bicinchoninic acid (BCA) 단백질 분석 키트Pierce23225
cDNA 플라스미드 벡터,
COS1 세포주ATTCCRL-1570
D-(+)-글루코스Sigma16325
D-(+)-글루코스(물 내 45% 용액) 완전한 Neurobasal 배지SigmaG8769
COS1 배양 배지용 D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1x )Invitrogen41966-029
Dulbecco' s 인산염 완충 식염수 10x (Ca2+ 및 Mg2++) (D-PBS) 배양을 위한Invitrogen14200
에탄올 머크108543
에틸렌디아민테트라아세트산 이수화물 디소듐 염 (EDTA)시그마E5134
형광 장착 매체 (예: Fluoromount-G 또는 유사)전자 현미경 과학 (EMS)17984-25
젤라틴 분말 시그마G1890
빙초산 (Panreac, cat. no. 211008)Panreac211008
Hank' S 균형 잡힌 소금 용액 Invitrogen24020083
열 비활성화 태아 소 혈청 Invitrogen10108-165
열 비활성화 말 세럼 Invitrogen26050-088
과산화수소 (H2O2, 물 중 32 - 33%)완전한
L-glutamine 200 mM 용액 (100x)Invitrogen25030-024
Lipofectamine 2000 시약Invitrogen11668-019
임산부 암컷 생쥐 (배아 일 12.5 - 16.5; E12.5-16.5) Criffa-Credo, Lyon, France
수정된 최소 필수 매체 독수리 (MEM)Invitrogen11012-044
Class III β-tubulin (clone TUJ-1)Biolegend801201
N-2 보충제 100x에Invitrogen17502-048
Neurobasal medium Invitrogen21103049
파라포름알데히드Merck1,040,051,000
페니실린/스트렙토마이신 용액 100x Invitrogen15140-22
인산염 완충 식염수 10x (PBS) 면역세포화학을 위한InvitrogenAM9624
이차 항체: 바이오틴화된 말 항-마우스 Vector LabsBA-2000
무혈청 매체 (Opti-MEM)Invitrogen11058-021
아지드화나트륨 Panreac162712
중탄산 나트륨 용액 7.5% Invitrogen25080-094
멸균 배양 등급 H2O 시그마W3500
트리톤TM X-100 시그마X100
트리즈마 베이스 SigmaT1503
Trypsin-EDTA (Trypsin (0.05% (wt/vol) with EDTA (1x)Invitrogen25300-054
Equipment
1 큰 곡선 가위와 1개의 작은 곡선 가위;정밀한 도구 기구 또는 유사한
1.5 mL 원뿔형 원심분리기 튜브 Eppendorf 또는 이와 유사한
15 mL 코니컬 원심분리기 튜브 Corning 또는 이와 유사한
2개의 지혈제   세밀한 도구 기구 또는 유사
2개의 작은 직선 해부 가위고급 도구 기구 또는 유사한
200 mL 원심분리 튜브, 원심분리용Nalgene 또는 유사한
200 mL 멸균 유리 원뿔형 플라스크,
2 L 유리 비커
4- 및 6-웰 배양 플레이트 Nunc176740 및 140675
자동 피펫 펌프 및 일회용 10 mL 및 25 mL 필터 함유 멸균 플라스틱 피펫.Gilson, Brand, Eppendorf 또는 이와 유사 
자동 피펫, 멸균 필터 팁 및 최신 멸균 팁 Gilson, Eppendorf 또는 이와 유사한
각도 고정 로터가 있는 벤치 탑 마이크로 원심분리기 Eppendorf, Beckman Coulter 또는 이와 유사한
스윙 버킷 로터가 있는 벤치탑 냉장 원심분리기(1.5, 15 및 50 mL 튜브 어댑터 포함)Eppendorf, Beckman Coulter 또는 이와 유사한
세포 배양 인큐베이터(37 °); C, 5% CO2 및 95% 공기
투석 튜빙 셀룰로오스 막SigmaD9402
투석 튜빙 클로저 SigmaZ37101-7
일회용 유리 피펫
암시야 광학이 있는 해부 현미경 Olympus SZ51 또는 동급 
고속 냉장 Beckman Coulter 원심분리기 또는 이와 유사한 각도 고정 로터
층류 후드
대형 100 mm, 60 mm 및 소형 35 mm Ø 세포 배양 접시 수녀  150679, 150288, 150318, 각각
자석 교반기 및 자석 스핀 바IKA 또는 유사한
McIlwain 조직 초퍼Mickle Laboratory Engineering
한 쌍의 세밀한 직선 집게와 한 쌍의 곡선형 집게 정밀 도구, 기구 또는 이와 유사한
것, 조직 다지기
메스(15번 및 11번),
콜라겐 및 조직 조각을 옮기기 위한 두 쌍의 미세한 주걱고급 도구, 기구 또는 이와 유사한
, , Neurobasal 및 COS1 배지용 Sigma 316989 대한 단클론 항체;, 용 면도날,, 것

참고문헌

  1. Ramón y Cajal, S. Les nouvelles idées sur la structure du système nerveux chez l'homme et chez les vertébrés. , (1894).
  2. Ramón y Cajal, S. Nuevo concepto de la histología de los centros nerviosos. , (1893).
  3. Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), 001834(2010).
  4. Tessier-Lavigne, M., Goodman, C. S. The molecular biology of axon guidance. Science. 274 (5290), 1123-1133 (1996).
  5. Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
  6. Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (6), 001727(2011).
  7. Rosentreter, S. M., et al. Response of retinal ganglion cell axons to striped linear gradients of repellent guidance molecules. Journal of Neurobiology. 37 (4), 541-562 (1998).
  8. Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nature Protocols. 2 (5), 1216-1224 (2007).
  9. von Philipsborn, A. C., et al. Growth cone navigation in substrate-bound ephrin gradients. Development. 133 (13), 2487-2495 (2006).
  10. Chen, H., He, Z., Tessier-Lavigne, M. Axon guidance mechanisms: semaphorins as simultaneous repellents and anti-repellents. Nature Neuroscience. 1 (6), 436-439 (1998).
  11. Jessell, T. M., Sanes, J. R. Development. The decade of the developing brain. Current Opinion in Neurobiology. 10 (5), 599-611 (2000).
  12. Serafini, T., et al. The netrins define a family of axon outgrowth-promoting proteins homologous to C. elegans UNC-6. Cell. 78 (3), 409-424 (1994).
  13. Charron, F., Tessier-Lavigne, M. Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance. Development. 132 (10), 2251-2262 (2005).
  14. Fournier, M. F., Sauser, R., Ambrosi, D., Meister, J. J., Verkhovsky, A. B. Force transmission in migrating cells. Journal of Cell Biology. 188 (2), 287-297 (2010).
  15. Dent, E. W., Gertler, F. B. Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance. Neuron. 40 (2), 209-227 (2003).
  16. Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).
  17. Castellani, V. B. Protocols for Neuronal Cell Culture. , Humana Press Inc. (2001).
  18. Gahwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
  19. Bornstein, M. B. Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes. Laboratory Investigation. 7 (2), 134-137 (1958).
  20. Billings-Gagliardi, S., Wolf, M. K. A simple method for examining organotypic CNS cultures with Nomarski optics. In Vitro. 13 (6), 371-377 (1977).
  21. Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Science. 76 (3), 1274-1278 (1979).
  22. Lumsden, A. G., Davies, A. M. Earliest sensory nerve fibres are guided to peripheral targets by attractants other than nerve growth factor. Nature. 306 (5945), 786-788 (1983).
  23. Chedotal, A., et al. Semaphorins III and IV repel hippocampal axons via two distinct receptors. Development. 125 (21), 4313-4323 (1998).
  24. Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
  25. Klein, R. Eph/ephrin signaling in morphogenesis, neural development and plasticity. Current Opinion in Cell Biology. 16 (5), 580-589 (2004).
  26. Wang, K. H., et al. Biochemical purification of a mammalian slit protein as a positive regulator of sensory axon elongation and branching. Cell. 96 (6), 771-784 (1999).
  27. Emonard, H., Grimaud, J. A., Nusgens, B., Lapiere, C. M., Foidart, J. M. Reconstituted basement-membrane matrix modulates fibroblast activities in vitro. Journal of Cell Physiology. 133 (1), 95-102 (1987).
  28. Knapp, D. M., Helou, E. F., Tranquillo, R. T. A fibrin or collagen gel assay for tissue cell chemotaxis: assessment of fibroblast chemotaxis to GRGDSP. Experimental Cell Research. 247 (2), 543-553 (1999).
  29. Kapur, T. A., Shoichet, M. S. Immobilized concentration gradients of nerve growth factor guide neurite outgrowth. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 68 (2), 235-243 (2004).
  30. Torres-Espin, A., Santos, D., Gonzalez-Perez, F., del Valle, J., Navarro, X. Neurite-J: an image-J plug-in for axonal growth analysis in organotypic cultures. Journal of Neuroscience Methods. 236, 26-39 (2014).
  31. Balestrini, J. L., et al. Comparative biology of decellularized lung matrix: Implications of species mismatch in regenerative medicine. Biomaterials. 102, 220-230 (2016).
  32. Qian, J., et al. Kinetic Analysis of the Digestion of Bovine Type I Collagen Telopeptides with Porcine Pepsin. Journal of Food Science. 81 (1), 27-34 (2016).
  33. Eyre, D. R., Weis, M., Hudson, D. M., Wu, J. J., Kim, L. A novel 3-hydroxyproline (3Hyp)-rich motif marks the triple-helical C terminus of tendon type I collagen. Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 7732-7736 (2011).
  34. Garnotel, R., et al. Human blood monocytes interact with type I collagen through alpha x beta 2 integrin (CD11c-CD18, gp150-95). Journal of Immunology. 164 (11), 5928-5934 (2000).
  35. Montolio, M., et al. A semaphorin 3A inhibitor blocks axonal chemorepulsion and enhances axon regeneration. Chemistry and Biology. 16 (7), 691-701 (2009).
  36. Garcia-Gareta, E. Collagen gels and the 'Bornstein legacy': from a substrate for tissue culture to cell culture systems and biomaterials for tissue regeneration. Experimental Dermatology. 23 (7), 473-474 (2014).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

3D

관련 논문