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방법 논문

비 환 원 SDS-PAGE 분석 및 화학적 가교 결합으로 포유류 세포에서 이황화 물 조합에 의해 안정화 된 다이 성체 복합체를 배양에 검출

9.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/59483

⸱

2019년 5월 2일

 , 
1Department of Molecular Biology, Rowan University, School of Osteopathic Medicine and Graduate School of Biomedical Sciences

이 논문에서

요약

이황화 물 결합은 오랫동안 많은 단백질의 구조를 안정화 시키는 것으로 알려져 왔다. 이러한 고리에 의해 안정화 된 다중 이성질체 복합체를 분석 하는 간단한 방법은 비 환 원 SDS-PAGE 분석을 통해 서 이다. 여기서,이 방법은 인간 뼈 골 육 종 세포의 dUTPase OS 로부터 핵이 소 형태를 분석 하 여 예시 된다.

초록

많은 단백질의 구조는 공유 이황화 결합을 통해 안정화 됩니다. 최근 작업에서,이 결합은 또한 번역 후 변형으로 분류 되었다. 따라서, 살아있는 세포에서 이러한 변형을 연구할 수 있는 것이 중요 하다. 이러한 시스테인 안정화 다중 성체 복합체를 분석 하는 간단한 방법은 비 환 원 SDS-PAGE 분석 및 포름알데히드 가교의 2 단계 방법을 통해 서 이다. 이러한 2 단계 방법은 그 기술적 용이성 및 낮은 운용 비용으로 인해 이황화 물 결합에 의해 안정화 된 다이 성체 복합체를 발굴 하는 첫 번째 단계로 서 유리 하다. 여기서, 인간 뼈 골 육 종 세포 주는 U-2 OS는 dUTPase의 핵이 소 형태를 구체적으로 분석 함으로써이 방법을 설명 하기 위해 사용 된다.

서론

이황화 물 결합은 오랫동안 많은 단백질의 구조를 안정화 시키는 것으로 알려져 왔다. 최근 작업에서, 이러한 결합은 가역 적 번역 후 변형으로 분류 되었으며, 시스테인 기반 "산화 환 원 스위치"로 작용 하 여 단백질 기능, 위치 및 상호작용의 변조를 허용 하는1,2, 3,4. 따라서,이 수정을 연구 할 수 있는 것이 중요 합니다. 이러한 시스테인 안정화 다중 성체 복합체를 분석 하는 간단한 방법은 비 환 원 SDS-PAGE 분석을 통해5. SDS-PAGE 분석은 많은 실험실에서 사용 되는 기술로, 결과를 신속 하 고 쉽게 분석 하 고 최소한의 비용으로 해석 할 수 있으며 질량 분석기와 같은 이황화 물 결합을 식별 하는 데 사용 되는 다른 기술 보다 유리 합니다6 ,7 및 원형 중 크롬 산8.

이 방법이 연구에 도움을 주는 적절 한 기술 인지 결정 하는 한 가지 중요 한 단계는 시스테인 잔기 (들)이 존재 하는 것을 보장 하기 위해 관심 있는 단백질의 일차 서 열을 철저히 조사 하는 것 이다. 또 다른 유용한 단계는 게시 된 임의의 이전 결정 구조를 연구 하거나 생물 정보학 응용 프로그램을 사용 하 여 관심 있는 단백질의 3 차원 구조를 탐구 하 여 시스테인 잔기 (들)가 위치할 수 있는 곳을 가시화 하는 것 이다. 잔류물 (들)이 외부 표면 상에 존재 하는 경우에는 상기 구조의 내부에 묻혀 있는 시스테인 잔기가 아닌 이황화 결합을 형성 하는 것이 더 좋은 후보가 될 수 있다. 그러나 단백질이 기질 상호 작용 또는 단백질-단백질 상호작용에 따라 구조적 변화를 겪을 수 있으므로 이러한 잔류 물이 환경에 노출 될 수도 있다는 점에 유의 해야 합니다.

확인 된 다이 성체 복합체는 포름알데히드를 사용 하 여 화학적 가교 결합으로 확인 될 수 있다. 포름알데히드는 높은 세포 투과성 및 짧은 가교 범위에 기인한이 검증 기술에 대 한 이상적인 교차 링커입니다 ~ 2-3 Å, 특정 단백질-단백질 상호작용의 검출을 보장 하는9,10. 여기서,이 방법은 인간 뼈 골 육 종 세포의 dUTPase OS11로부터 핵이 소 형태를 분석 하 여 예시 된다. 그러나,이 프로토콜은 그밖 세포 선, 조직 및 유기 체를 위해 적응 될 수 있습니다.

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프로토콜

1. Iodoacetamide를 사용 하 여 무료 시스테인 잔류물을 차단

  1. Confluency OS 세포를 6cm2 접시에서 50% ~ 60%로 성장 시킵니다. 5% co2에서 37 ° c에서 10% 태아 소 혈 청 및 1% 나트륨 피 루브 산은을 함유 하는 고 혈당의최소 필수 배지.
  2. 사용 직전에 10mm iodoacetamide의 신선한 스톡을 만든 다음 미사용 시 약을 버리십시오.
  3. 세포 배양 배지에 직접 0.1 mM 최종 농도 iodoacetamide 추가 합니다. 접시를 실 온에서 2 분간 부드럽게 흔들어 줍니다.

2. 세포 수확

  1. 세포에서 미디어를 흡입 합니다.
  2. 5 mL의 차가운 인산 완충 식 염 액 (PBS)을 3 번 사용 하 여 세포를 세척 합니다. 최종 PBS 세척 용액을 흡입 한 다음 차가운 PBS 1 mL을 추가 합니다.
  3. 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 접시 바닥에서 세포를 긁어 냅니다. 1 mL 파이 펫을 사용 하 여 PBS 및 세포 현 탁 액을 만들고 모든 액체를 1.5 mL 마이크로 원심 분리기 튜브에 분배 합니다.
  4. 4 ° c에서 3 분 동안 7500 x g 에서 세포를 회전 시킵니다. 세포 펠 릿 뒤에 두고 PBS를 흡입. 세포 펠 렛은 처리 될 때까지-80 ° c에서 저장 될 수 있습니다

3. 단백질의 추출

  1. DdH 2o에서 희석 된 1x 용 해 완충 액의100 µ l을 준비 하십시오 ( 재료 표참조). 사용 직전에 phenylmethylsulfonyl 불 화물 (PMSF)을 1mm 최종 농도로 추가 하십시오.
  2. 1x 용 해 완충 액의 50 µ L을 세포 펠 렛에 직접 추가 하 고 일시 중단 합니다. 얼음 위에 5 분간 배양 합니다.
  3. 40%에서 일정 한 펄스 모드를 사용 하 여 8 초 동안 초음파 처리 (초음파 분쇄기에 대 한 재료 표 참조) 얼음에 추출 물을 유지, 다른 sonicators에 대 한 필요에 따라 조정 합니다.
  4. 16000 x g에서 5 분 동안 4°c에서 추출 물을 회전 시킵니다. 상 등 액은 가용성 단백질 분 획 물 이다. 브래드포드 분석은 원하는 경우 단백질 농도를 결정 하기 위해 수행 될 수 있다.

4. 샘플 준비

  1. 가용성 단백질 추출 물의 10 µ L을 복용 하 여 1x Laemmli SDS-PAGE 버퍼에 10 µ L을 첨가 하 고 0.004%의 브로 모 페 놀 청색 및 0.125 M 트리 스-HCl, pH 6.8). 환 원 시 약을 첨가 하지 마십시오.
  2. 그 날 SDS 페이지 분석이 수행 됩니다 경우 얼음에 샘플을 유지; 장기 보관의 경우-20°c가 적합 합니다. 젤을 실행 하기 직전에, 85 ° c에서 5 분 동안 샘플을가 열 하십시오.

5. 생체 내 내 생 단백질의 포름알데히드 가교-2 OS 세포

  1. Confluency OS 세포를 175에서 70 ~ 80% 의 플라스 크로 성장 시키십시오 (섹션 1 참조).
  2. 포름알데히드 가교 반응을 수행
    1. 연기 두건에서, 분 취 액는 상업적인 근원에서 구입 된 37% 포름알데히드 해결책입니다. 포 름 알 데히드를 배지에 직접 첨가 하 여 final 농도 1%로 하 고 실 온에서 15 분간 부드럽게 교 반 하 여 배양 한다.
    2. 반응을 해소 하기 위해, 1.25 M 글리신을 0.125 M의 최종 농도에 추가 하 고 5 분 동안 로커에 부드러운 동요와 함께 실 온에서 배양 한다.
  3. 5 mL의 차가운 PBS로 세포를 세 번 씻으십시오. 최종 PBS 세척 용액을 흡입 하 고 10 mL의 PBS를 추가 합니다. 세포 스 크레이 퍼를 사용 하 여 플라스 크의 바닥에서 세포를 긁어 냅니다.
  4. 10ml의 파이 펫을 사용 하 여 PBS 및 세포 현 탁 액을 그리고 모든 액체를 15ml 원추형 원심 분리기 튜브에 넣습니다. 500 x g 에서 4 ° c에서 2 분 동안 세포를 회전 시킵니다. 세포 펠 릿 뒤에 두고 PBS를 흡입.

6. 핵의 분별

  1. 균질 화 완충 액 10ml를 준비 하십시오: 0.25 M 자당, 1mm EDTA, 10mm 헵, 및 0.5% BSA의 pH 7.4. 사용 직전에 PMSF를 추가 하 여 1mm 최종 농도와 3mL의 핵 서 스 펜 션 완충 액 (0.1%의 트리톤 X-100을 PBS에 첨가).
  2. 5 mL 균질 화 완충 액을 세포 펠 렛에 직접 추가 하 고 완전히 중단 하십시오. 500 x g 의 현 탁 액을 4°c에서 2 분 동안 원심 분리 한 다음 상층 액을 버립니다.
  3. 5 mL의 균질 화 완충 액에서 펠 릿을 정지 시킵니다. 꼭 맞는 유리 테 플 론 균질 기를 사용 하 여 10 스트로크/500 rpm으로 세포를 균질 화 하십시오.
  4. 1500 x g 에서 현 탁 액을 4°c에서 10 분 동안 원심 분리 한 다음 상층 액을 버립니다.
    참고: 10 분 동안 1만 x g 에서 원심 분리를 통해 미토 콘 드리 아를 분리할 때 상층 액을 사용 하십시오.
  5. 1 mL 핵 서 스 펜 션 완충 액에서 펠 렛을 일시 중단 하 고 10 분간 얼음을 배양 합니다.
  6. 600 x g 에서 원심 분리기를 10 분간 상층 액을 버리십시오.
  7. 1 mL 핵 서 스 펜 션 완충 액으로 펠 렛을 정지 시키고 다시 원심 분리기. 상층 액을 버리십시오. 최종 펠 릿은 고립 된 핵이 될 것입니다.

7. 단백질의 추출

  1. 1 배 용 해 완충 액의 25 µ L을 세포 펠 렛에 직접 추가 하는 것을 제외 하 고 4 절을 반복 하 여 현 탁 한다.

8. 샘플 준비

  1. 각 가용성 단백질 추출 물 10 µ L을 복용 하 여 SDS-PAGE 용 샘플 2 개를 준비 하 고 2x Laemmli SDS 샘플 버퍼 10 µ을 추가 하 고 2 진단을 (BME)의 µ L을 첨가 합니다.
  2. 37 ° c에서 5 분 동안 1 개의 샘플을가 열 하 고, 98 ° c에서 15 분 동안 제 2 샘플을가 하 여 포름알데히드 크로스 링크를 역전 시켰다.

9. SDS 페이지 분석

  1. 1L(1l의 1 리터) 트리 스 글리신 실행 버퍼 (25mm 트리 스, 192 mM 글리신, 0.1%)를 준비 합니다.
  2. SDS 페이지 실행 장치를 설정 합니다.
    참고:     이 프로토콜은 16% 프리 캐스트 TGX SDS 페이지를 사용 합니다. 모든 백분율 젤을 사용할 수 있습니다.
    1. 제조업체 프로토콜에 따라 젤이 저장 된 패키지를 열고 카세트를 제거 하십시오.
    2. 카세트 밑면에서 우물과 테이프를 감싸는 빗을 제거 하십시오.
    3. 실행 장치에 젤을 놓습니다.
    4. 우물이 액체에 잠길 때까지 1x 실행 버퍼로 챔버를 채 웁 니다. 플라스틱 파이프를 사용 하 여 실행 중인 버퍼로 우물을 헹 굽 니다.
  3. 10 µ L prestained 표준 마커와 함께 젤에 샘플을 로드 합니다.
  4. 젤의 바닥에서 약 1cm의 염료 전면이 될 때까지 200 V에서 젤을 실행 합니다.

10. 웨스턴 블랏

  1. 1L의 1x 트랜스퍼 버퍼 (25mm 트리 스, 192의 글리신, 20% 메탄올)를 준비 하 고 사용 하기 전까지 4°c에서 보관 하십시오.
  2. 조심 스럽게 젤을 제거 하 고 카세트를 엽 니. 면도기를 사용 하 여 스태킹 젤을 조심 스럽게 자르고 버립니다. 한 모서리를 사용 하 여 젤을 들고 전송 버퍼가 있는 트레이에 올려 놓고 5 분간 부드럽게 흔들어 줍니다.
  3. 젤이 흔들 리는 동안 얼음 블록 (-20°c에 저장 된)을 이송 탱크에 넣고 전송 버퍼를 ¾ 전체에 추가 합니다.
  4. 30 초 동안 100% 메탄올에 담가 폴 리 불 화물 (PVDF) 멤브레인을 적셔.
  5. 5 분이 지나면 전송 버퍼가 있는 트레이에 전송을 설정할 준비를 합니다. 전송 버퍼는 블 럿을 완전히 서브 머지 하기에 충분 해야 합니다. 다음과 같이 블 롯 전송을 설정 합니다. 하단에서 카세트 홀더의 바닥 (검은색); 그런 다음 두꺼운 스폰지, 여분의 두꺼운 종이, 폴 리 아크릴 아 미드 젤, PVDF 멤브레인, 여분의 두꺼운 종이 및 두꺼운 스폰지; 그런 다음 마지막 카세트 홀더 (흰색)의 상단에.
  6. 카세트를 잠그고 양극과 겔을 향해 PVDF 멤브레인을 음극 쪽으로 향하게 하 여 장치를 이송 탱크에 놓습니다. 전송이 완전히 잠길 때까지 전송 버퍼를 사용 하 여 장치를 맨 위로 끕니다.
  7. 장치를 교 반 플레이트 위에 놓습니다. 장치에 교 반 막대를 추가 하 고 125 rpm에서 교 반을 시작 하십시오.
  8. 60 분 동안 100 V에서 실행 하십시오.
  9. 전송이 실행 되는 동안, 트리 스 완충 식 염 액에 용 해 된 5% 분말 우유 용액을 트윈-20, pH 7.5 (TBST)로 준비 하십시오.
  10. 장치를 해체 하 고 멤브레인을 제거 하 고 어느 쪽이 젤과 접촉 했습니까? 나머지 단계를 위해이 측면이 용지함에 남아 있는지 확인 합니다.
  11. 트리 스 완충 식 염 수가 2 분 동안 멤브레인을 담근 다음, 실 온에서 30 분 동안 5% 우유 TBST 용액 5Ml를 배양 하 여 멤브레인을 차단 하였다.
  12. 우유를 신선한 4 mL의 5% 우유 TBST 용액으로 교체 하 고 일차 항 체를 적절 한 희석 액에 첨가 하십시오 (이 경우, 우리의 희석은 dUTPase 항 체의 경우 1:2000 이며, 4 ° c에서 부드러운 락으로 밤에도 배양 됩니다.
  13. 다음날, 4 ° c 로커에서 실 온 로커로의 블랏을 제거 하 고 1 차 항 체 용액을 폐기 한다.
  14. 충분 한 액체를 사용 하 여 3 번의 세척, 5 분 각, 천천히 흔들 다음, 충분히 액상을 이용 하 여 TBST로 빠르게 세척 하십시오.
  15. 마지막 세척 후 5% 우유 TBST 용액 5Ml를 추가 하 고 15 분 동안 블 롯을 흔들어 버린 다음 버리십시오.
  16. 원하는 농도로 5% 우유 TBST에 희석 된 2 차 항 체를 추가 합니다. (이 경우, 1:5000 mL의 염소 항 토끼 희석 5% 우유-TBST 솔루션)
  17. 1 시간 동안 흔들어 실 온에서 배양 한 후 용액을 버리십시오.
  18. 그 다음에는 TBST로 세 번의 빠른 세척을 하 고 3 개의 세척을 5 분간 각각 천천히 흔들어 마지막 세척을 버리고 5 mL의 TBS를 추가 하십시오.
  19. 1:1 혼합 된 ECL 화학 발광 검출 용액 (각 시 약 1 mL을 최종 부피 2ml)로 제조 하 고이를 1 분 동안이를 블 럿에 직접 첨가 한다.
  20. 핀셋을 사용 하 여 멤브레인을 제거 하 고 실험실 와이프로 모서리를 살짝 적셔 여분의 용액을 제거 하십시오. 멤브레인을 수축 랩에 놓고 단백질 면을 x 선 카세트에 올려 놓으십시오.
  21. 멤브레인을 엑스레이 필름에 노출 시킵니다. 노출 시간은 다를 수 있습니다.

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결과

핵 dUTPase는 각각의 단량체 성 단백질 (11)의 제 3 아미노산에 위치 하는 두 개의 시스테인 잔기의 상호작용을 통해 안정한이 량 체 구성을 형성 하는 분 자간 디 설파 이드 결합을 형성할 수 있다. 이는 도 1a, B에 설명 되어 있다. 이 이황화 결합이 감소 된 환경에서 이주 이상으로 인 한 비 특이 적 상호작용을 보장 하기 위해, t는 적절 한 제어의 포함이 필수적 이었다. 핵 dUTPase은 인 간에 게 존재 하는 4 개의 isoforms 중 하나입니다. 4 개의 isoforms 중 3 개는 공통의 촉매 코어 (11,12)를 공유 하면서 고유한 아미노 말단 도메인을 가진다. 웨스턴 블 롯에서 볼 수 있듯이, 수확 시에 인간 세포...

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토론

여기에 설명 된 방법은 이황화 물 결합을 통해 안정화 된 다이 성체 복합체의 분석을 위한 바로 앞 프로토콜을 제공 한다. 이 프로토콜은 다른 세포 배양 라인, 조직 및 유기 체에 쉽게 적용 될 수 있어 광범위 한 응용 분야에 적합 합니다.

이 절차의 중요 한 단계는 이황화 물 연결이 추출 절차의 결과를 보장 하는 것입니다. 임의의 자유 시스테인 잔기는 iodoacetamide13을 사용 하 여 차단할 수 있다. 이 알킬화제 에이전트는 그들의 티 올 그룹 이더라도 시스테인 잔기에 공유 결합, 새로운 이황화 결합의 형성을 차단. 그러나,이 제제는 치료 시에 이황화 결합이 존재 하는 경우이를 방해 하지 않을 것 이다. Iodoacetamide의 최적화는 농도와 시간의 변화를 이용 하 여 수행 될 수 있다. 그러나이 시 약에 노출 되 면 세포가 사 멸 될 수 있습니다.

도움이 될 수 있는이 프로...

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공개 사항

저자는이 원고의 내용과 이해 상충이 없음을 선언 합니다.

감사의 글

이 원고를 편집 하는 데 도움이 되는 모든 노력을 dUTPase 다 클론 항 체와 Kerri Ciccaglione의 정화를 위해 제니퍼 피셔 박사에 게 전 하는 노력에 감사 드립니다. 이 연구는 뉴저지 보건 재단의 보조금으로 부분적으로 지원 되었습니다 (보조금 #PC 11-18).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
16% 프리캐스트 TGX 젤ThermoFisherXp00160
175 cm2 플라스크셀 스타658175
18COATCCCRL-1459
6 cm2 접시VWR10861-588
A549ATCCCCL-185
Amersham ECL 감지 키트GE
블롯 전달 장치Biorad153BR76789
BMESigma AldrichM3148
Bradford 단백질 시약Biorad5000006
Bromophenol Blue
BSA세포 신호99985
세포 용해 완충세포 신호9803
원심분리기Eppendor5415D
DMEMGibco11330-032
드릴
EDTA시그마 AldrichM101
전기영동 장치InvitrogenA25977
매우 두꺼운 웨스턴 블로팅 페이퍼ThermoFisher88610
Fetal 소 혈청Gibco1932693
포름 알데히드ThermoFisher28908
유리 - 테프론 균질화 기
글리세롤시그마 알드리치65516
글리신RPI636050
열 블록덴빌10285-D
헥스시그마 알드리치H0527
염산VWR2018010431
요오드 아세트 아미드ThermoFisher90034
KimwipeKimtech34155
메탄올Pharmco339000000
무지방 분유세포 신호99995
PBS시그마 AldrichP3813
PMSFSigma Aldrich329-98-6
Posi-click tubeDenvilleC2170
전원 공급 장치Biorad200120
Prestained markerThermoFisher26619
PVDF 멤브레인Biorad162-0177
RockerReliable Scientific55
Saos2ATCCHTB-85
SDSBiorad161-0302
2차 항체세포 신호70748
소형 세포 스크레이퍼TygonS-50HL 클래스 VI
염화나트륨RPIS23020
피루브산나트륨 Gibco
SonicatorBranson450
블로팅용 스폰지 패드InvitrogenE19051
교반 플레이트CorningPC353
설탕시그마 AldrichS-1888
Tris BaseRPIT60040
Tris 완충 식염수, 트윈 20 포함, pH 7.5Sigma AldrichSRE0031
Tris-Glycine 러닝 버퍼VWRJ61006
Triton X-100Sigma AldrichT8787
Tween 20Sigma AldrichP9416
U-2 OSATCCHTB-96
X선 필름ThermoFisher34090
16817200

참고문헌

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  8. Kelly, S. M., Price, N. C. The use of circular dichroism in the investigation of protein structure and function. Current Protein and Peptide Science. 1 (4), 349-384 (2000).
  9. Klockenbusch, C., Kast, J. Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 927585(2010).
  10. Gavrilov, A., Razin, S. V., Cavalli, G. In vivo formaldehyde cross-linking: it is time for black box analysis. Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 163-165 (2015).
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  13. Macpherson, L. J., et al. Noxious compounds activate TRPA1 ion channels through covalent modification of cysteines. Nature. 445 (7127), 541-545 (2007).
  14. Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. Chromatin immunoprecipitation (ChIP). Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (9), (2009).

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