비 환 원 SDS-PAGE 분석 및 화학적 가교 결합으로 포유류 세포에서 이황화 물 조합에 의해 안정화 된 다이 성체 복합체를 배양에 검출

요약

이황화 물 결합은 오랫동안 많은 단백질의 구조를 안정화 시키는 것으로 알려져 왔다. 이러한 고리에 의해 안정화 된 다중 이성질체 복합체를 분석 하는 간단한 방법은 비 환 원 SDS-PAGE 분석을 통해 서 이다. 여기서,이 방법은 인간 뼈 골 육 종 세포의 dUTPase OS 로부터 핵이 소 형태를 분석 하 여 예시 된다.

초록

많은 단백질의 구조는 공유 이황화 결합을 통해 안정화 됩니다. 최근 작업에서,이 결합은 또한 번역 후 변형으로 분류 되었다. 따라서, 살아있는 세포에서 이러한 변형을 연구할 수 있는 것이 중요 하다. 이러한 시스테인 안정화 다중 성체 복합체를 분석 하는 간단한 방법은 비 환 원 SDS-PAGE 분석 및 포름알데히드 가교의 2 단계 방법을 통해 서 이다. 이러한 2 단계 방법은 그 기술적 용이성 및 낮은 운용 비용으로 인해 이황화 물 결합에 의해 안정화 된 다이 성체 복합체를 발굴 하는 첫 번째 단계로 서 유리 하다. 여기서, 인간 뼈 골 육 종 세포 주는 U-2 OS는 dUTPase의 핵이 소 형태를 구체적으로 분석 함으로써이 방법을 설명 하기 위해 사용 된다.

서론

이황화 물 결합은 오랫동안 많은 단백질의 구조를 안정화 시키는 것으로 알려져 왔다. 최근 작업에서, 이러한 결합은 가역 적 번역 후 변형으로 분류 되었으며, 시스테인 기반 "산화 환 원 스위치"로 작용 하 여 단백질 기능, 위치 및 상호작용의 변조를 허용 하는^{1,2, 3,4}. 따라서,이 수정을 연구 할 수 있는 것이 중요 합니다. 이러한 시스테인 안정화 다중 성체 복합체를 분석 하는 간단한 방법은 비 환 원 SDS-PAGE 분석을 통해⁵. SDS-PAGE 분석은 많은 실험실에서 사용 되는 기술로, 결과를 신속 하 고 쉽게 분석 하 고 최소한의 비용으로 해석 할 수 있으며 질량 분석기와 같은 이황화 물 결합을 식별 하는 데 사용 되는 다른 기술 보다 유리 합니다^{6 ,7} 및 원형 중 크롬 산⁸.

이 방법이 연구에 도움을 주는 적....

프로토콜

1. Iodoacetamide를 사용 하 여 무료 시스테인 잔류물을 차단

1. Confluency OS 세포를 6cm² 접시에서 50% ~ 60%로 성장 시킵니다. 5% co2에서 37 ° c에서 10% 태아 소 혈 청 및 1% 나트륨 피 루브 산은을 함유 하는 고 혈당의최소 필수 배지.
2. 사용 직전에 10mm iodoacetamide의 신선한 스톡을 만든 다음 미사용 시 약을 버리십시오.
3. 세포 배양 배지에 직접 0.1 mM 최종 농도 iodoacetamide 추가 합니다. 접시를 실 온에서 2 분간 부드럽게 흔들어 줍니다.

2. 세포 수확

1. 세포에서 미디어를 흡입 합니다.
2. 5 mL의 차가운 인산 완충 식 염 액 (PBS)을 3 번 사용 하 여 세포를 세척 합니다. 최종 PBS 세척 용액을 흡입 한 다음 차가운 PBS 1 mL을 추가 합니다.
3. 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 접시 바닥에서 세포를 긁어 냅니다. 1 mL 파이 펫을 사용 하 여 PBS 및 세포 현 탁 액을 만들고 모든 액체를 1.5 mL 마이크로 원심 분리기 튜브에 분배 합니다.
4. 4 ° c에서 3 분 동안 7500 x....

결과

핵 dUTPase는 각각의 단량체 성 단백질 (¹¹)의 제 3 아미노산에 위치 하는 두 개의 시스테인 잔기의 상호작용을 통해 안정한이 량 체 구성을 형성 하는 분 자간 디 설파 이드 결합을 형성할 수 있다. 이는 도 1a, B에 설명 되어 있다. 이 이황화 결합이 감소 된 환경에서 이주 이상으로 인 한 비 특이 적 상호작용을 보장 하기 위해, t는 적절 한 제어의 포함이 필수적 이었다. 핵 dUTPase은 인 간에 게 존재 하는 4 개의 isoforms 중 하나입니다. 4 개의 isoforms 중 3 개는 공통의 촉매 코어 (^11,12)를 공유 하면서 고유한 아미노 말단 도메인을 가진다. 웨스턴 블 롯에서 볼 수 있듯이, 수확 시에 인간 세포.......

토론

여기에 설명 된 방법은 이황화 물 결합을 통해 안정화 된 다이 성체 복합체의 분석을 위한 바로 앞 프로토콜을 제공 한다. 이 프로토콜은 다른 세포 배양 라인, 조직 및 유기 체에 쉽게 적용 될 수 있어 광범위 한 응용 분야에 적합 합니다.

이 절차의 중요 한 단계는 이황화 물 연결이 추출 절차의 결과를 보장 하는 것입니다. 임의의 자유 시스테인 잔기는 iodoacetamide¹³을 사용 하 여 차단할 수 있다. 이 알킬화제 에이전트는 그들의 티 올 그룹 이더라도 시스테인 잔기에 공유 결합, 새로운 이황화 결합의 형성을 차단. 그러나,이 제제는 치료 시에 이황화 결합이 존재 하는 경우이를 방해 하지 않을 것 이다. Iodoacetamide의 최적화는 농도와 시간의 변화를 이용 하 여 수행 될 수 있다. 그러나이 시 약에 노출 되 면 세포가 사 멸 될 수 있습니다.

도움이 될 수 있는이 프로.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
16% 프리캐스트 TGX 젤	ThermoFisher	Xp00160
175 cm2 플라스크	셀 스타	658175
18CO	ATCC	CRL-1459
6 cm2 접시	VWR	10861-588
A549	ATCC	CCL-185
Amersham ECL 감지 키트	GE
블롯 전달 장치	Biorad	153BR76789
BME	Sigma Aldrich	M3148
Bradford 단백질 시약	Biorad	5000006
Bromophenol Blue
BSA	세포 신호	99985
세포 용해 완충	세포 신호	9803
원심분리기	Eppendor	5415D
DMEM	Gibco	11330-032
드릴
EDTA	시그마 Aldrich	M101
전기영동 장치	Invitrogen	A25977
매우 두꺼운 웨스턴 블로팅 페이퍼	ThermoFisher	88610
Fetal 소 혈청	Gibco	1932693
포름 알데히드	ThermoFisher	28908
유리 - 테프론 균질화 기
글리세롤	시그마 알드리치	65516
글리신	RPI	636050
열 블록	덴빌	10285-D
헥스	시그마 알드리치	H0527
염산	VWR	2018010431
요오드 아세트 아미드	ThermoFisher	90034
Kimwipe	Kimtech	34155
메탄올	Pharmco	339000000
무지방 분유	세포 신호	99995
PBS	시그마 Aldrich	P3813
PMSF	Sigma Aldrich	329-98-6
Posi-click tube	Denville	C2170
전원 공급 장치	Biorad	200120
Prestained marker	ThermoFisher	26619
PVDF 멤브레인	Biorad	162-0177
Rocker	Reliable Scientific	55
Saos2	ATCC	HTB-85
SDS	Biorad	161-0302
2차 항체	세포 신호	70748
소형 세포 스크레이퍼	Tygon	S-50HL 클래스 VI
염화나트륨	RPI	S23020
피루브산	나트륨 Gibco
Sonicator	Branson	450
블로팅용 스폰지 패드	Invitrogen	E19051
교반 플레이트	Corning	PC353
설탕	시그마 Aldrich	S-1888
Tris Base	RPI	T60040
Tris 완충 식염수, 트윈 20 포함, pH 7.5	Sigma Aldrich	SRE0031
Tris-Glycine 러닝 버퍼	VWR	J61006
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416
U-2 OS	ATCC	HTB-96
X선 필름	ThermoFisher	34090

16817200