스폰지 팁 전극 A 소설 원추형을 사용 하 여 애벌레 Zebrafish에 기록 하는 Electroretinogram

요약

여기, 선물이 애벌레 zebrafish에서 빛 갖는 electroretinogram 응답의 측정을 간소화 하는 프로토콜. 소설 원뿔 모양의 스폰지 팁 전극에 electroretinogram를 사용 하 여 신뢰할 수 있는 결과 낮은 비용으로 달성 하기 쉽게 하는 애벌레 zebrafish에 시각적 개발의 연구를 만들기 위해 도울 수 있다.

초록

제 브라 (Danio rerio) 발달 연구에서 척추 모형으로 일반적으로 사용 되 고 특히 시각적인 신경 과학에 대 한 적합 합니다. 비주얼 퍼포먼스의 기능 측정, electroretinography (에) 더 높은 척 추가 있는 종에서 잘 설립 되었습니다 이상적인 비-침략 적 방법입니다. 이 접근은 점점 zebrafish, 초기 단계에서 발달 애벌레 포함에 시각적 기능을 검토를 위해 사용 되 고 있습니다. 그러나, 애벌레 zebrafish에 날짜에 대 한 가장 일반적으로 사용 되 기록 전극 유리 제 micropipette 전극 제조, 한정 된 자원을 가진 실험실에 대 한 과제를 제시에 대 한 특수 장비를 필요로 하는. 여기, 선물이 애벌레 zebrafish에 프로토콜 사용 하 여 원뿔 모양의 스폰지 팁 전극. 새로운 전극 제조 및 핸들, 더 경제적이 고 유리 제 micropipette 보다 애벌레 눈 손상 가능성이 쉽습니다. 이전에 게시에 방법 처럼 현재 프로토콜 각각 포토 리셉터와 양극 세포 응답, a-와 b-파도를 통해 외부 망막 기능을 평가할 수 있습니다. 프로토콜은 zebrafish 애벌레, 지원 유틸리티, 감도, 및 새로운 전극의 신뢰성의 초기 개발을 통해 시각적 기능의 상세를 설명 명확 하 게 수 있습니다. 단순화 된 전극 새로운 르 그 시스템 구축 또는 기존 작은 동물에 장치는 제 브라를 사용 하 여 시각적인 신경 과학 연구자를 돕고 zebrafish 측정에 대 한 수정 모델 유기 체 때 특히 유용 하다.

서론

제 브라 (Danio rerio) 시각적인 신경 과학의 연구를 포함 하 여 널리 유전 척추 모델 되고있다. 이 종족의 증가 인기 유전자 조작, 높은 보존된 척추 영상 시스템 (신경, 해부학 적 형태와 조직, 형식과 기본 유전학), 높은 통치의 용이성 등 장점을 표시 될 수 있습니다. 그리고 축산 포유류 모델¹에 비해 저렴 한 비용. 비-침략 적 electroretinogram (에) 오래 사용 되었습니다 임상 인간의 시각 기능을 평가 하 고 비전의 크고 작은 설치류 등 애벌레 zebrafish^2,3 범위에서 계량을 실험실 속 ^{, 4 , 5}. 가장 일반적으로 분석된에 구성 요소는 a 파와 b 파, 빛 감지 대뇌와 바이 폴라 수에서 발생 하는 각각. 애벌레 zebrafish, 망막에 뚜렷한 레이어 3 일 후 수정 (dpf)에 의해 설립 되 고 터미널 포토 리셉터 콘의 형태학 synapses 4 dpf^6,7전에 성숙. 애벌레 zebrafish의 외부 망막 기능 따라서 4 dpf는 르 그 이후이 이른 나이에서 측정 가능한 것을 의미 하기 전에 설정 됩니다. 짧은 실험 주기 모델의 높은 처리량 속성 때문에 르 그에 적용 된 애벌레 zebrafish 질환 모델의 기능 평가 위한 컬러 비전 및 망막 개발 분석, 시각적 circadian 리듬 공부 그리고^8,,910,,1112마약 테스트.

그러나, 애벌레 zebrafish에 대 한 현재 접근에 채택 하기 어렵게 만들 수 있는 몇 가지 복잡 한 있다. 일반적으로 기록 전극^3,,45,13, 고품질 micropipette 필요로 하로 전도성 액체로 채워진 유리 제 micropipette를 사용 하 여 게시 된 애벌레 zebrafish에 프로토콜 팁³. 특수 장비, micropipette 끌어당기는 등 및 microforge, 어떤 경우에는 그들의 제조에 대 한 필요 합니다. 이 한정 된 자원 가진 실험실에 대 한 도전이 될 수 있습니다 그리고 애벌레 zebrafish 시각적 기능의 측정을 위해 사용할 수 있는 작은 동물에 시스템에 적응 하는 경우에 추가 비용을 리드. 부드럽게 하는 경우에 날카로운 micropipette 팁 애벌레 눈의 표면을 손상 수 있습니다. 또한, 전기 생리학에 대 한 상업 micropipette 홀더 고정된 실버 와이어로 구성 됩니다. 이러한 전선 고정 증가 유지 보수 비용을 선도 하는 새로운 소유자의 구입을 요구 하는 반복 사용 후 패 된다.

여기는 원뿔 모양의 스폰지 팁 기록 전극, 애벌레 zebrafish에 측정에 대 한 설립된 작은 동물에 설정을 적응에 특히 유용 합니다을 사용 하 여 르 그 방법에 설명 합니다. 전극 일반적인 폴 리 비닐 아세테이트 (PVA) 스폰지 및 기타 특수 장비 없이 괜 찮 실버 와이어를 사용 하 여 쉽게 이루어집니다. 우리의 데이터는이 새로운 전극 민감하고 안정적 4와 7 dpf 사이 애벌레 zebrafish에 망막 신경 회로의 기능 개발을 설명 하는 보여준다. 이 경제적이 고 실용적인 스폰지 팁 전극 연구원 새로운 르 그 시스템을 구축 또는 기존 작은 동물 시스템, zebrafish 연구에 대 한 수정에 유용할 수 있습니다.

프로토콜

모든 electroretinogram (에) 절차 동물의 사용 그리고 배려에 대 한 호주 국민 건강 및 의료 연구 위원회 코드의 규정에 따라 수행 했다와 기관 동물 윤리 위원회에 의해 승인 된 멜버른의 대학입니다.

1. 버퍼 준비

1. 준비 하는 금붕어 벨의 버퍼 (1.25 M NaCl, KCl 26mm, 25mm CaCl₂, 10 m m MgCl₂, 100 mM 포도 당, 100 mM HEPES) x 10 역삼 투 (RO) 물을 사용 하 여. PH 7.8에 버퍼를 조정 하 고 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 버퍼를 소독. 4 ° C에서 10 배 버퍼 솔루션 주식³으로 저장 합니다.
   참고: 벨의 버퍼 x 10은 3 개월 이내에 사용 되어야 한다.
2. 실험 당일, 역방향 삼 투 물을 사용 하 여 금붕어 벨의 버퍼 x 10을 diluting 하 여 금붕어 벨의 버퍼 x 1을 확인 합니다.
   참고: 금붕어 벨의 버퍼 x 1는 PVA 스폰지, 스폰지 애벌레 zebrafish의 배치에 대 한 사용을 포함 하 여 그리고 기록 전극 끝에 스폰지를 포화 하는 데 사용 됩니다.

2. 전극 준비

1. 원뿔 모양의 스폰지 기록 전극 준비.
   1. 백 금 전극 리드 확장에서 남성 끝을 잘라 고 10mm 메스 블레이드를 사용 하 여 외부 소계 절연 코팅의 끝에서 제거 합니다. 알아서 하지 전극 리드의 내부 와이어를 손상.
   2. 실버 와이어 (0.3 m m 직경)의 40 m m 길이 잘라 하 고 안전 하 게 노출된 내부 와이어와 함께 실버 와이어 entwining 여 이것을 전극 리드에 연결. 실버 와이어 노출 (그림 1A)의 ~ 15 m m 길이 떠나 단 열 테이프를 사용 하 여 관절을 싸는.
   3. 60 9 V DC 소스를 사용 하 여 염화와 노출된은 와이어를 전기 도금 신호 전도 개선 하기 위해 s. 일반적인 염 분에 노출 된 실버 팁을 담가 그리고 배터리의 긍정적인 터미널에 다른 쪽 끝을 연결. 배터리의 부정적인 터미널에 다른 와이어를 연결 하 고 염 분²로 와이어의 다른 쪽 끝을 담가.
      참고: 또는, 표 백제 솔루션 (활성 성분 42 g/L 나트륨도 발견 됐 죠)에 1 시간 동안 그것을 몸을 담글 하 여 실버 와이어 인터네셔널.
   4. PVA의 ~ 20 m m x 20 m m 스퀘어 콘 (그림 1A)를가 위를 사용 하 여 스폰지를 잘라. 벨의 버퍼 x 1를 사용 하 여 스폰지 포화. 접 안 렌즈에 눈금 막대와 현미경, 메스 블레이드 사용 하 여 모양 ~ 40 µ m 직경 원뿔의 꼭대기. 공기 건조 흡수 성 종이 조직에 원뿔 모양의 스폰지까지 고체.
      참고: PVA 스폰지 포화 상당히 확장, 따라서 원뿔의 꼭대기를 형성 하기 전에 스폰지 염 분으로 포화 처음은 중요 하다.
   5. Chloriding, 후 공기 건조 5 분 삽입에 대 한 흡수 성 조직에 실버 와이어는 콘의 기지를 통해 건조, 고체, 원뿔 모양의 PVA 스폰지에 실버 와이어. 어떤 과잉 노출된 금속 태양광 아티팩트 (그림 1B-C)을 줄이기 위해 마스크 테이프를 사용 하 여 보 온.
      참고: 각 실험 세션 후 실버 와이어에서 스펀지를 제거 합니다. 재사용에 대 한 역방향 삼 투 물 및 건조 공기를 사용 하 여 스폰지를 씻어. 최적의 신호 컬렉션을 보장 하기 위해 실버 와이어의 단일 사용은 권장 된다. PVA 스폰지 5 번 이상 재사용 하지.
   6. 실험의 날, 벨의 버퍼 완전히 스폰지를 포화 하 적어도 15 분 동안 x 1으로 기록 전극의 스폰지 팁을 담가.
2. 스폰지 팁을 연결 하지 않고도 하지만, 위에서 설명한 대로 참조 전극을 준비 합니다.
3. 접지 전극을 상업적으로 가져옵니다.

3. 제 브라 준비

1. 다크 적응 zebrafish 애벌레 하룻밤 (> 8 h) 15 mL 튜브에 zebrafish를 배치 하 여 녹음 전에 (< 튜브 당 20 애벌레) 어두운 인큐베이터에 알루미늄 호 일에 싸여. 충분 한 산소 공급을 보장 하기 위해 뚜껑을 제거 합니다.
2. 녹화 당일, 애벌레를 포함 하는 호 일에 싸서 팔 콘 튜브에 뚜껑을 강화 하 고 튜브 빛-증거 인지 확인 합니다. 애벌레에 연구소를 전송 합니다.
3. 발광 다이오드 (LED; 17.4 cd.m^-2, λ_최대 600 nm)에서 희미 한 붉은 조명으로 어둠 속에서 배양 접시에 생선을 붓는 다. 광선이 수건을 사용 하 여 가벼운 노출을 최소화 하기 위해 접시를 커버.

4. 스폰지 플랫폼 준비

1. 35 mm 페 트리 접시에 snugly에 맞게 건조 PVA 스폰지의 사각형 컷. 스폰지의 두께 페 트리 접시의 깊이를 대략 동일 해야 확인 하십시오.
2. 기준 전극의 실버 와이어에 맞게 스폰지의 한쪽 끝을 통해 수직으로 작은 상처를 확인 하십시오.
3. 금붕어 벨의 버퍼 포화 될 때까지 x 1에 PVA 스폰지를 적시 게. 그런 다음, 깨끗 한 35 mm 페 트리 접시에 스폰지를 놓습니다. 솔루션 가벼운 손가락 보도에 대 한 응답에 스폰지에서 발산 될 때까지 여분의 액체를 흡수 하는 종이 타월을 사용 합니다.

5. 동물 및 전극 위치

1. 애벌레 금붕어 벨의 버퍼 x 1에 희석 0.02 %tricaine 사용 하 여 anesthetize
2. 3 mL 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 전송 종이 타월 (²~ 3 cm)의 광장에는 마 취 유 충.
3. 집게를 사용 하 여 촉촉한 스폰지 플랫폼에 유 충을 포함 하는 종이 타월을 놓습니다. 벨의 버퍼에 배어 좋은 브러시를 사용 하 여 유 충의 위치를 조정. 그 한쪽 눈 위쪽으로 직면 유 충 아래 종이 타월의 광장에서 가까운 액체에서 고립 된 확인 합니다.
4. 유 충에 녹음을 통해 촉촉한 유지 하 아이 젤 보습과 머리를 제외 하 고 애벌레 몸 유약.
5. 패러데이 케이지 (그림 1D) 안에 위치한 Ganzfeld 그릇 빛 자극 앞 작은 물이 열 플랫폼에 스폰지 플랫폼 페 트리 접시를 놓습니다.
   참고: 스폰지와 애벌레 시체의 온도의 유지 보수 안정 르 그 신호를 보장합니다.
6. 플랫폼 스폰지 (그림 1D)에서 만든 컷에 참조 전극을 삽입 합니다.
7. 패러데이 케이지를 상업적으로 얻은 접지 전극을 연결 합니다.
8. 전극 홀더를 기록 전극 연결 및 보안 stereotaxic 팔 micromanipulator (그림 1D)의 홀더. 3 mL 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 다시 채도 대 한 전극의 스폰지 팁에 벨의 솔루션 x 1의 한 방울을 똑.
9. 전극의 배치에 대 한 르 그 플랫폼 위에 패러데이 케이지 현미경을 놓습니다.
   참고: 조명은 dark-adaptation를 유지 하면서 dim 적색 LED (17.4 cd.m^-2, λ_최대 600 nm) 유 충의 관측을 허용 하 고 활성 전극의 배치에 의해 제공 되어야 한다.
10. 현미경 애벌레의 관찰 수 있도록 스폰지 플랫폼의 위치를 조정 합니다. 다음, 흡수 성 직물을 사용 하 여 전극 스폰지 팁에서 과잉 액체를 제거.
11. (그림 1E) 애벌레 zebrafish 눈의 중앙 각 막 표면을 부드럽게 이어지도록 합니다 활성 전극 위치.
12. Ganzfeld 그릇 스폰지 플랫폼으로 이동 하 고 유 충은 그릇에 의해 보호 확인 합니다.
13. 외부 전자기 소음을 줄이기 위해 패러데이 케이지를 닫습니다.

6. Electroretinogram 기록

1. 특정에 시스템의 컴퓨터 소프트웨어를 사용 하 여 자극을 실행 하 고 데이터를²아래 권장 하는 설정에 따라 (자세한 재료의 표 참조).
   1. 수집 소프트웨어에서 창 (2, 560 점)을 기록 한 650 ms 이상 4 KHz을 시스템의 샘플링 속도 설정 합니다.
   2. 1000 × 시스템의 이득을 설정 합니다.
   3. 1-300 hz 시스템의 대역 통과 필터링을 설정 합니다.
   4. 노치 필터를 사용 하 여 60 Hz (또는 지역 유틸리티 주파수에 따라 50 Hz) 감소 잡음.
      참고: 이상적인 소음 수준 ± 10 µ V 보다 더 이상 이어야 한다.
2. 아래 설명 된 절차를 사용 하 여 데이터 컬렉션을 시작 합니다.
   1. 단일 테스트-플래시 (0.06 로그 cd.s/m²)를 사용 하 여 테스트 응답 전극의 위치를 평가 하기 위해 눈을 측정.
      참고: B 파 진폭 4 dpf 애벌레에 25 µ V 보다 큰 테스트 플래시의이 강도 발생 한다. 강력한 응답, 측정 될 수 없는 경우 다음 전극 위치 고 다른 전극에 위치 잘 확인 플래시 테스트.
   2. 어두운 동물 허용 다음 테스트-플래시, 녹음 하기 전에 완전 한 어둠 속에 3 분에 대 한 적응.
   3. 현재 밝은 빛 농도를 주차에서 깜박입니다.
   4. 전체 평균 신호 신호-잡음 레벨에 따라 반복 됩니다.
      참고: 일반적으로, 더 많은 주차 가벼운 수준 (3 개 이상의 반복) 신호와 밝은 가벼운 수준 (일반적으로 반복 1) 적은 평균. 점차적으로 60 10에서 간 자극 간격을 길게 밝은 게 흐릿한 빛이 수준에서 s. 샘플 프로토콜은 표 1에 표시 됩니다.
   5. 녹음 후 고통 없이 0.1 %tricaine 사용 하 여 애벌레를 죽 일.

7입니다. 분석

1. 초기 부정적인 파를 구 유에서 한 파 진폭 및 긍정적인 b-웨이브 피크 부정적인-파 여 물통에서 b 파 진폭 측정 합니다.
2. 파의 여 물통을 b 파의 피크 자극 발병에서 a-와 b-웨이브 암시적 시간을 각각 측정.

결과

이 섹션에 측정 한 매일 4에서 7 dpf에 대 한 대표적인 결과를 제공 합니다. 4 dpf에 응답 강력한 a-와 b-파 구성 요소, 각각 대뇌와 양극 세포에서 발생 하는 표시. 각 나이에 테스트, b 파의 진폭 증가 빛의 강도 (그림 2; 그림 3). 특히, 나 이와 함께 증가 하는 주차 섬광에 애벌레 zebrafish 망막의 감도. A-와 b-웨이브 명확한 신호 했다 더 오래 된 애벌레 (그림 2)에 대 한 이러한 농도에 탐지 하는 반면-1.61 cd.s/m² 4 dpf, 로그 보다 낮은 농도에서 인식할 수 없었다. B 파 응답 4와 5의 dpf 사이 크게 성장 (P < 0.0001; 그림 2A -B;

토론

에 르 그 같은 기능 해독 애벌레 zebrafish^8,9,,1214를 공부 하는 데 사용 하는 도구 제품군에 점점 더 중요 한 되 고 있습니다. 작은 크기로 인해 애벌레 zebrafish 눈의, 유리 micropipettes 전극 가장 게시 프로토콜^3,4,5,,89 에 기록으로 적응 되어 ^{, 12 , ...}

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.22 & 마이크로; m 필터	Millex GP	SLGP033RS	필터 10× 살균 용 금붕어 링거의 버퍼
1 mL 주사기	Terumo	DVR-5175	30G × ½ " 바늘을 사용하여 전극 스폰지 팁에 식염수 방울을 추가하여 ERG 신호의 건조 및 노이즈 증가를 방지합니다.
30 G &시간; ½ " 바늘	Terumo	NN*3013R	식염수 toteh sopnge 팁 전극을 추가합니다.
바이오앰프	ADInstruments	ML135ERG	신호 증폭용.
표백제 솔루션	King White	9333441000973	은색 전극 염소화의 대체 방법. 활성 성분 : 42g / L 차아 염소산 나트륨.
순환 수조	Lauda-Ko?nigshoffen	MGW Lauda	온수 플랫폼을 만드는 데 사용됩니다.
전극 리드	Grass Telefactor	F-E2-30	은선 전극을 증폭기에 연결하기 위한 백금 케이블.
패러데이 케이지	측광 솔루션 국제		신호 대 잡음비를 개선하기 위해 어두운 적응을 유지하고 Ganzfeld 설정을 포함합니다.
Ganzfeld Bowl	광도 측정 솔루션 International		맞춤형으로 설계된 광 자극기: 직경 36mm, 조리개 크기 13cm.
Luxeon LED	필립스 라이트 Co.		광 자극용: 20개의 5W 및 1개의 1W LED.
Micromanipulator	Harvard Apparatus	BS4 50-2625	실험 중 기록 전극을 잡습니다.
Microsoft Office Excel	Microsoft	버전 2010	데이터 분석을 위한 스프레드시트 소프트웨어.
모이스처라이징 아이 젤	GenTeal Gel	9319099315560	탈수를 방지하기 위해 녹음 중 제브라피쉬 유충을 덮는 데 사용됩니다. 활성 성분 : 0.3 % Hypromellose 및 0.22 % carbomer 980.
파스퇴르 피펫	Copan	200C	유충 제브라피쉬를 조심스럽게 옮기는 데 사용됩니다.
파워랩 데이터 수집 시스템	ADInstruments	ML785	LED를 제어하여 자극을 생성합니다.
PVA 스폰지	MeiCheLe	R-1675	유충 제브라 피쉬의 배치 및 원뿔 모양의 전극 ti
식염수 용액	Aaxis Pacific	13317002	은선 전극 전기 도금을 위해.
Scope Software	ADInstruments	버전 3.7.6	Powerlab 시스템을 통해 자극을 동시에 트리거하고 데이터
Silver (가는 원형 와이어)	A& E 금속	0.3mm	ERG 전극을 기록하고 참조하기 위해 사용됩니다.
실체 현미경	라이카	M80	원뿔 모양의 스폰지 정점(접안렌즈에 눈금 막대 포함)의 모양을 만들고 측정하는 데 사용됩니다. 전극 배치를 위해 패러데이 케이지에 배치됩니다.
트리카인	시그마-알드리치	E10521-50G	제브라피쉬 유충 마취용.
수온식 플랫폼	맞춤 제작		ERG 기록 중 스폰지 플랫폼과 유충 몸체의 온도를 유지하기 위해