Method Article

마우스 기관에서 브러시 셀의 격리 및 정량 평가

DOI:

10.3791/59496

⸱

June 12th, 2019

 ,  ,  , 
1Division of Rheumatology, Allergy and Immunology, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

브러쉬 세포는 순진한 마우스 기관에서 발견되는 희귀한 해 화학 감각 상피 세포이다. 그들의 한정된 수 때문에, 기도 면제 및 리모델링에 있는 그들의 기능적인 역할의 ex vivo 평가는 도전적입니다. 우리는 유세포에 의한 기관 브러시 세포의 격리 방법을 설명합니다.

Abstract

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기관 브러쉬 세포는 면역 및 신경계에 기도 루멘에서 신호를 전송하는 태세 해 화학 감각 상피 세포입니다. 그(것)들은 장 점막에 있는 tuft 세포, 기관에 있는 브러쉬 세포, 및 비강 점막에 있는 고독한 화학 감각 및 microvillous 세포를 포함하는 화학 감각 상피 세포의 가족의 일부입니다. 상피 구획에 있는 화학 감각 세포는 중요한 세포 내 마커 및 핵심 전사 서명을 공유합니다, 그러나 또한 중요한 전사 이질성을 표시합니다, 현지 조직 환경의 가능성이 반사. 단세포 현탁액에서 기관 브러쉬 세포의 격리는 이 희소한 상피 세포의 기능을 상세히 정의하는 데 필요하지만, 기관 브러시 세포와 신경 종말 사이의 밀접한 상호 작용으로 인해 이들의 격리가 어려울 수 있습니다. 또는 단단하고 접합부의 기도 특정 조성으로 인해. 여기서, 우리는 마우스 기관 상피로부터 브러시 세포의 분리를 위한 절차를 기술한다. 이 방법은 점막에서 기관 상피의 초기 분리를 기반으로하여 파파인이있는 상피 시트의 후속 짧은 배양을 허용합니다. 이 절차는 실행 가능한 기관 브러시 세포의 유세포 측정 선별 및 기능 분석을위한 신속하고 편리한 솔루션을 제공합니다.

Introduction

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브러쉬 세포는 미각 세포에서 발견되는 쓴 맛 수용체 및 미각 수용체 형질전환 기계의 발현을 특징으로 하는 화학 감각 상피 세포의 클래스에 속한다. 미각 세포와는 달리, 화학 감각 상피 세포는 상피 표면에 흩어져 있으며 비강 상피 1,2,기관내의 브러시 세포에서 독방 화학 감각 세포 (SCC) 및 마이크로 빌러스 세포라고합니다. 3,4,소장 5,6의터프 세포. 쓴 맛 수용체및 쓴 맛의 트랜스덕션 기계를 발현하는 상피 세포는또한 요도 7,8 및 청각 튜브9에서발견된다. 기도 브러쉬 세포는 신경 발생 및 면역 기도 반응에 있는 유일한 기능이 있습니다. 그들은 아세틸 콜린 생산 화학 감각 세포는 정족수 감지 물질10과 같은 쓴 화합물 및 세균 대사 산물로 활성화시 보호 호흡 반사를 불러 일으킨다. 기....

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Protocol

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다음 실험을 수행하기 전에 모든 동물 관리 사용 및 프로토콜이 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 승인을 받고 국립 연구 위원회의 "치료 및 사용 가이드"에 따라 수행되었는지 확인하십시오. 실험실 동물"(8 판, 2011) 및 도착 지침. 아래에 설명된 모든 절차는 브리검 및 여성 병원의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 검토하고 승인했습니다.

1. 시약의 준비

  1. 16 U/mL 디스파스 및 20 μg/mL DNase I. 37°C의 수조에서 용액을 예열하기 전에 디스파스 분말이 완전히 용해되었는지 확인하는 PBS 용액인 디스파제 소화 용액을 준비합니다.
  2. 5% 열불활성화 된 태아 소 혈청 (FBS)을 덜베코 변형 독수리 배지 (DMEM)에 첨가하여 중지 용액을 만듭니다.
  3. 티로드 I 버퍼 준비: 칼슘이 없는 HEPES-Tyrode의 완충액에 26 U/mL 파파인(48 U/mg 파파인 용액 의 20 μL/mL)과 10 μL/mL L-시스테인을 추가하십시오.
  4. 티로드 II 완충제 준비: 칼슘이 있는 HEPES-Tyrode의 완충제에 2 μL/mL leupeptin(5 mg/mL)을 추가합니다.
  5. FACS ....

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Results

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이 절차는 RNA 시퀀싱3에대한 기관 브러시 세포를 격리하기 위해 성공적으로 구현되었습니다. 2단계 프로토콜로 조직의 기관 및 소화를 분리한 후(그림1), PI로 죽은 세포를 배제한 후 형광표지된 CD45 및 EpCAM으로 세포를 수집하고 염색하였다. 전진 및 측면 산란 특성에 따라 이중을 게이팅한 후 브러시 셀을 CD45의 낮음/음수, EpCAM에 대해 양수, eGFP에 대해 양수로 정의했습니다(그림2A). 브러쉬 세포는 유세포측정에 의해 CD45저/부정 세포의 ~0.16-0.42%를 나타내고 기관당 250-600개의 세포를 차지했다(그림2B). 우리는 기관 브러쉬 세포의 우리의 간행된 광대한 면역 조직학 평가에 근거를 둔 ChAT(BAC.......

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Discussion

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우리는 40 분 동안 고용량 디스파스 치료의 조합과 짧은 파파인 치료 (30 분)가 기관 소화 및 브러시 세포 격리를위한 최적의 프로토콜을 제공한다는 것을 발견했습니다. 이 조합은 광범위한 소화를 방지하고 대체 프로토콜에 비해 브러시 셀의 가장 높은 수율을 생성합니다.

조혈 세포를 추출하는 폐 소화는 콜라게나아제 IV15와같은 가벼운 소화 효소에 고전적으로 의존해 왔지만 상피 세포의 분리는 더 복잡한 프로토콜을 필요로 한다. 상피 세포의 단세포 현탁액은 서로 및 지하 막에 결합하는 접합부와 세포 자체의 약점 때문에 단단하고 부착하기 때문에 달성하기가 더 어렵습니다. 상피 세포 소화를 위한 대부분의 프로토콜은 2개의 단계를 관련시킵니다 - 첫번째 단계는 지하 막에서 상피의 분리이고 상피 세포를 서로 붙이는 단단한 접합및 desmosomes를 방해하는 후속 단계가 뒤따릅니다 16세 ,

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

브리검 여성 인간 면역학 센터 플로우 코어의 아담 치코인(Adam Chicoine)에게 유동 세포 측정 분류에 도움을 주신 것에 대해 감사드립니다. 이 작품은 건강 보조금 R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (N.A.B), U19 AI095219 (N.A.B., L.G.B), 및 K08 AI132723 (L.G.B), 및 알레르기, 천식 및 면역학의 미국 아카데미 (AAAAI)/ 미국 폐 알레르기 호흡기 질환 상 (N.A.B.), AAAI 재단 교수 개발 상 (L.G.B.), 스티븐과 주디 케이 젊은 혁신상 (N.A.B.), 여성 의사 과학자의 경력 개발을위한 조이셀린 C. 오스틴 기금에 의해 (L.G.B.), 그리고 에 의해 비닉 가족(L.G.B.)의 후원금 기부.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
항체
Anti-GFP (Polyclonal goat Ig)Abcamcat# ab5450
APC anti-mouse CD326 (EpCAM)  (깨8.8)바이오레전고양이#118214
APC 쥐 IgG2a, k 동형 대조군바이오레전고양이#400511
DAPI바이오레전고양이#422801
당나귀 안티 염소 IgG (H+L) 고도 교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor 488Life Technologies/Molecular Probescat#A-11055
Normal Goat IgGR& D Systemscat#AB-108-C
Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11)Biolegendcat#103126
Pacific Blue Rat IgG2b, k isotype controlBiolegendcat#400627
TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) 항체Biolegendcat#101320
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
DispaseGibcocat# 17105041 
DNase I시그마 cat# 10104159001
HEPES-Tyrode' 칼슘이 없는 s 완충액(10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0.4 mM NaH2PO4, 0.25% BSA, 5.5 mM 포도당. 18.2 메가 옴의 물에서 준비하고 0.22 &마이크로를 통해 여과; m 필터Boston BioProductscat# PY-912
Tyrode' s 용액(HEPES 완충) 140mM NaCl, 5mM KCl, 25mM HEPES, 2mM CaCl2, 2mM MgCl2 및 10mM 포도당. 18.2 메가 옴의 물에서 준비하고 0.22 &마이크로를 통해 여과; M 필터. BostonBioProductscat# BSS-355
L-CysteineSigmacat# C7352
Leupeptin trifluoroacetate saltSigmacat# L2023
Papain from papaya latexSigmacat# P3125
Propidium iodide Sigmacat# P4170
실험 모델: Organisms/Strains
ChATBAC-eGFP (B6. Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J)The Jackson Laboratory7902
Equipment
LSM 800 with Airyscan confocal system  에   Zeiss Axio Observer Z1 도립 현미경Zeiss
LSRFortessaBD647465
Disposable equipment
1.5 mL sterile tubeThomasScientific1157C86
5 mL 포이스테렌 라운드 바텀 튜브, 12 mm x 75 mm 스타일Falcon14-959-1A
50 mL 폴리 프로필렌 원뿔형 튜브, 30 mm x 115 mm 스타일Falcon352098
Feather 일회용 메스 no.12Fisher ScientificNC9999403
페트리 접시, 100 mm x 15 mm 스타일Falcon351029
멸균 세포 여과기, 100 μ m피셔브랜드고양이#22363549
드 드 드

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tizzano, M., et al. Nasal chemosensory cells use bitter taste signaling to detect irritants and bacterial signals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 3210-3215 (2010).
  2. Genovese, F., Tizzano, M.

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Tracheal Brush CellsEpithelial IsolationPapain DigestionFlow Cytometric SortingDispase TreatmentCell ViabilityChAT eGFP ReporterFACS BufferPropidium IodideEpCAM Positive

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