여기서, 우리는 짧은 합성 DNA 및 RNA 올리고뉴클레오티드 및 정제된 Pol II를 필요로 하는 RNA 폴리머라제 II(Pol II) 신장 복합체의 조립을 기술한다. 이들 복합체는 Pol II 신장 복합체와 관련된 전사체의 기본 공동 전사 처리를 연구하는 데 유용하다.
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이 논문에서
요약
초록
진핵 mRNA 합성은 성숙한 mRNA를 형성하기 위하여 전구체 RNA의 다중 소단위 효소 RNA 폴리머라제 II 및 공동 전사 상한 및 접합에 의해 전구체 RNA내로 DNA 템플릿의 전사를 요구하는 복잡한 생화확적인 프로세스이다. mRNA 합성 동안, RNA 폴리머라제 II 신장 복합체는 성숙한 mRNA를 생성하는 캡핑, 접합 및 3'-처리 효소뿐만 아니라 촉매 활성을 조절하는 전사 인자의 큰 집합에 의해 조절을 위한 표적이 된다. mRNA 합성의 본질적인 복잡성 때문에, 그것의 각종 공동 전사 단계의 격리 그리고 조사를 가능하게 하는 간단한 실험 시스템은 중대한 유용성이 있습니다.
이 문서에서는, 우리는 공동 전사 RNA 상한을 조사하기에 적합한 1개의 간단한 실험 시스템을 기술합니다. 이 시스템은 정제 된 폴리머 라제 및 인공 전사 기포에서 조립 된 정의 된 RNA 폴리머 라제 II 신장 복합체에 의존합니다. 생체 생리DNA를 통해 고정화될 때, 이 RNA 폴리머라제 II 신장 복합체는 연신복합체가 캡핑 효소를 모집하고 조절하는 공동 전사 RNA 캡핑 및 메커니즘을 해부하기 위한 용이한 방법론을 제공합니다. 공동 전사 RNA 캡핑. 우리는 이 시스템이 RNA 중합효소 II 신장 복합체에 결합된 mRNA 성숙의 그밖 단계에서 역할을 가진 단백질 또는 단백질 복합체의 모집 및/또는 집합을 공부하기 위해 적응될 수 있었다는 것을 예상합니다.
서론
진핵 메신저 RNA (mRNA) 합성은 RNA 폴리머라제 II에 의해 처리되지 않은 전구체 RNA의 합성및 성숙한 mRNA를 산출하기 위하여 전구체 RNA의 처리를 관련시키는 정교한 생화확적인 프로세스입니다. 캡핑, 접합 및 폴리아데닐화의 RNA 처리 단계는 대체로 공동 전사적으로 수행된다. Pol II 신장 복합체는 많은 RNA 처리 효소의 활동을 모집하고 조율하는 발판역할을 합니다. 따라서, 성숙한 진핵 mRNAs가 생성되는 방법의 우리의 궁극적인 이해는 신장 복합체에 근본적인 모집을 근본적인 생화학 기계장치의 해부를 허용하는 실험 적인 시스템의 발달에 크게 의지할 것입니다 공동 전사 캡핑, 접합 및 폴리아데닐화를 담당하는 효소의 조절.
당연히, 이러한 실험 시스템의 개발은 어려웠다. 주요 장애는 단순히 시험관내에서 Pol II에 의한 기저 전사를 재구성하는 것이 5가지 일반 전사 개시 인자(TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, 및 TFIIH)의 최소 세트를 필요로 하는 Pol II 전사 자체의 현저한 복잡성이었습니다. 1. 또한, 시험관 내에서 규제 된 Pol II 전사의 모든 종류를 재구성하려면 전사 인자 및 공동 조절기의 더 큰 세트가 필요합니다. 따라서, 주요 목표는 Pol I....
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프로토콜
1. 인공 신장 복합체 및 폴 II 걷기의 조립
- 자기 비드상에 3' 비오틴 분자를 함유하는 비템플릿 DNA 올리고의 1nmol을 고정화.
참고: 다음 단계는 향후 실험을 준비하기 위해 미리 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 올리고 서열은 표1에 제공됩니다. RNA 올리고는 5'-삼인산염 수정과 합성됩니다.- 200 μL의 자기 비드(10 mg/mL)를 저단백 결합 1.5 mL 튜브에 넣고 2분 동안 자기 랙에 놓습니다.
- 튜브가 마그네틱 랙에 있는 동안 구슬을 방해하지 않고 튜브에서 액체를 제거합니다. 구슬을 세척하려면 랙에서 튜브를 제거하고 5 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl을 추가하고 튜브를 랙에 반환하고 2 분 후에 세척 용액을 제거하십시오.
- 동일한 버퍼의 200 μL을 사용하여 2회 더 세서합니다.
- 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 버퍼의 400 μL에서 자기 비드를 다시 일시 중단하십시오. 이어서H2O의 380 μL 및 10 μM의 20 μL과 혼합하여 비템플릿 생체티니화 DNA 올리고. 튜브를 영양분 위에 놓....
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결과
도 2 및 도 3은 상이한 공급원으로부터 연장 또는 Pol II에 의해 상이한 길이의 전사체를 포함하는 인공 신장 복합체를 생성하는 데 사용되는 대표적인 결과 반응을 보여준다. 도 4는 이러한 신장 복합체가 공동 전사 CTD 인산화-의존적 RNA 캡핑을 분석하는 데 사용될 수 있는 방법을 도시한다.
도 2A는 인공 신장 복합체에서 DNA 및 RNA 분자의 도면이다. 그림 2B는 프로토콜 1에 기재된 바와 같이 정확하게 수행된 반응에서 생성된 상이한 길이의 전사체를 나타내며, 이 때 시작 인공 신장 복합체는 20 nt의 합성 RNA 올리고를 사용하.......
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토론
RNA 처리 및 전사체 신장 자체의 조절과 같은 Pol II 신장 복합체에 결합된 사건을 해부하고자 하는 연구는 고도로 정제된 효소 시스템을 사용하여 크게 촉진될 수 있다. 이러한 효소 시스템을 설정하는 것은 어려울 수 있습니다. Pol II에 의한 프로모터 의존성 전사는 적어도 5개의 일반적인 전사 인자를 요구한다. 이러한 요인을 준비하고 비축하는 데는 몇 달이 걸릴 수 있습니다. 따라서, 이 과정에서의 속도 제한 단계는 종종 단순히 시험관에서 기저 전사를 재구성하는 데 필요한 전사 인자의 간부를 준비하는 것이다.
이 기사에서는, 우리는 정제 된 Pol II 및 합성 DNA 및RNA 올리고 뉴클레오티드만을 사용하여 인공 전사 신장 복합체 2,3을 생성하기 위한 이전에 개발된 방법의 적응을 설명합니다. 생성된 신장 복합체는 전사적으로 활성되며 Pol II 전사 및 RNA 캡핑.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
포유류 캡핑 효소 cDNA를 제공해 주신 S. Shuman에게 감사드립니다. 이 작품은 그레이터 캔자스 시티 지역 사회 재단에서 헬렌 넬슨 의학 연구 기금에서 의학 연구를위한 Stowers 연구소에 보조금에 의해 부분적으로 지원되었다. 이 원고의 기본 원본 데이터는 http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434 Stowers 원본 데이터 저장소에서 액세스할 수 있습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| [α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi | Perkin Elmer | NEG007H001MC | 방사선 표지용 RNA |
| 2x RNA 로딩 염료 | New England Biolabs | B0363S | 적극 권장합니다. 겔 로딩 중 RNA 준비 |
| 40% Bis : 아크릴 아미드 용액 | Biorad | 1610144 | |
| 소 혈청 알부민 (20 mg / mL) | New England Biolabs | B9000S | |
| Cdk7 / Cyclin H / MAT1 (CAK complex) 단백질, 활성, 10 µ g | Millipore Sigma | 14-476 | |
| 순도 사양은 표 8을 참조하십시오 | |||
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies Invitrogen | 65001 | 우리는 또한 Dynabeads M-280 streptavidin을 문제 없이 사용했지만, MyOne Streptavidin 비드를 선호합니다. 왜냐하면 그들은 더 천천히 침전되기 때문입니다 |
| . GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Life Technologies Invitrogen | AM9516 | 적극 권장합니다. 염료, 핵산 펠릿 블루, 반응을 훨씬 쉽게 처리, |
| Hoefer SE600 표준 이중 냉각 수직 전기 영동 시스템, 1mm 스페이서 및 15 웰 빗 | Hoefer | SE600-15-1.5 | |
| MaXtract 고밀도 튜브 (1.5 mL) | Qiagen | 129046 | 적극 권장합니다. 수성 상과 유기 상 사이에 안정적인 장벽을 형성하는 고밀도 겔을 함유합니다. 추출 중 RNA 수율 향상 |
| Proteinase K 용액 (20 mg/mL) | Life Technologies Invitrogen | 25530049 | |
| RNA 올리고뉴클레오티드 | Trilink | 자세한 내용은 표 8 참조 | |
| 효모 무기 피로포스파타아제(100 units/mL) | New England Biolabs | NEBM2403S | 캡핑 반응 중에만 필요 |
참고문헌
- Liu, X., Bushnell, D. A., Kornberg, R. D. RNA polymerase II transcription: structure and mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (1), 2-8 (2013).
- Daube, S. S., von Hippel, P. H. Functional transcription elongation complexes from synthetic RNA-DNA bubble du....
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재인쇄 및 허가
