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Summary

여기서, 우리는 짧은 합성 DNA 및 RNA 올리고뉴클레오티드 및 정제된 Pol II를 필요로 하는 RNA 폴리머라제 II(Pol II) 신장 복합체의 조립을 기술한다. 이들 복합체는 Pol II 신장 복합체와 관련된 전사체의 기본 공동 전사 처리를 연구하는 데 유용하다.

Abstract

진핵 mRNA 합성은 성숙한 mRNA를 형성하기 위하여 전구체 RNA의 다중 소단위 효소 RNA 폴리머라제 II 및 공동 전사 상한 및 접합에 의해 전구체 RNA내로 DNA 템플릿의 전사를 요구하는 복잡한 생화확적인 프로세스이다. mRNA 합성 동안, RNA 폴리머라제 II 신장 복합체는 성숙한 mRNA를 생성하는 캡핑, 접합 및 3′-처리 효소뿐만 아니라 촉매 활성을 조절하는 전사 인자의 큰 집합에 의해 조절을 위한 표적이 된다. mRNA 합성의 본질적인 복잡성 때문에, 그것의 각종 공동 전사 단계의 격리 그리고 조사를 가능하게 하는 간단한 실험 시스템은 중대한 유용성이 있습니다.

이 문서에서는, 우리는 공동 전사 RNA 상한을 조사하기에 적합한 1개의 간단한 실험 시스템을 기술합니다. 이 시스템은 정제 된 폴리머 라제 및 인공 전사 기포에서 조립 된 정의 된 RNA 폴리머 라제 II 신장 복합체에 의존합니다. 생체 생리DNA를 통해 고정화될 때, 이 RNA 폴리머라제 II 신장 복합체는 연신복합체가 캡핑 효소를 모집하고 조절하는 공동 전사 RNA 캡핑 및 메커니즘을 해부하기 위한 용이한 방법론을 제공합니다. 공동 전사 RNA 캡핑. 우리는 이 시스템이 RNA 중합효소 II 신장 복합체에 결합된 mRNA 성숙의 그밖 단계에서 역할을 가진 단백질 또는 단백질 복합체의 모집 및/또는 집합을 공부하기 위해 적응될 수 있었다는 것을 예상합니다.

Introduction

진핵 메신저 RNA (mRNA) 합성은 RNA 폴리머라제 II에 의해 처리되지 않은 전구체 RNA의 합성및 성숙한 mRNA를 산출하기 위하여 전구체 RNA의 처리를 관련시키는 정교한 생화확적인 프로세스입니다. 캡핑, 접합 및 폴리아데닐화의 RNA 처리 단계는 대체로 공동 전사적으로 수행된다. Pol II 신장 복합체는 많은 RNA 처리 효소의 활동을 모집하고 조율하는 발판역할을 합니다. 따라서, 성숙한 진핵 mRNAs가 생성되는 방법의 우리의 궁극적인 이해는 신장 복합체에 근본적인 모집을 근본적인 생화학 기계장치의 해부를 허용하는 실험 적인 시스템의 발달에 크게 의지할 것입니다 공동 전사 캡핑, 접합 및 폴리아데닐화를 담당하는 효소의 조절.

당연히, 이러한 실험 시스템의 개발은 어려웠다. 주요 장애는 단순히 시험관내에서 Pol II에 의한 기저 전사를 재구성하는 것이 5가지 일반 전사 개시 인자(TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, 및 TFIIH)의 최소 세트를 필요로 하는 Pol II 전사 자체의 현저한 복잡성이었습니다. ¹. 또한, 시험관 내에서 규제 된 Pol II 전사의 모든 종류를 재구성하려면 전사 인자 및 공동 조절기의 더 큰 세트가 필요합니다. 따라서, 주요 목표는 Pol II 전사 및 RNA 처리의 기능적 커플링의 조사에 적합한 활성 Pol II 신장 복합체의 재구성을 허용하는 간단한 실험 시스템을 개발하는 것이었습니다.

활성 Pol II 신장 복합체를 재구성하는 이러한 간단한 방법 중 하나는 연공 폴 II의 구조적 및 생화학적 연구에 유용하며, 최근에는공동 전사 RNA 처리 2, 3을 조사하는 데 유용하게 사용되었습니다. ^,4,^5. 이 문서에서는, 우리는 정제된 Pol II 및 합성 전사 기포로부터 제조된 Pol II 신장 복합체가 어떻게 초기 Pol II 전사의 공동 전사 캡핑의 근본적인 메커니즘을 조사하기 위해 효과적으로 사용될 수 있는지를 보여준다.

캡핑은 초기 Pol II 전사체의 5′-트리포스페이트 말단에 5′-구아노신 “캡”을 공동 첨가하는 것을 말합니다. 캡은 mRNA 성숙, 전송, 번역 및 기타 프로세스^6,7의후속 단계에 중요합니다. 캡은 캡핑 효소로 지칭되는 효소에 의해 Pol II 전사체에 공동 전사적으로 첨가된다. 포유류 세포에서, 캡핑 효소의 RNA 5′-트리포스파타제 및 구아릴 전이 효소 활성을 담당하는 활성 부위는 단일 폴리펩티드⁸내에 함유되어 있다. 캡핑 효소는 그 힙테이프타이드 반복의 Ser5상에 포진된 Pol II 체체 및 Rpb1 카르복시 말단 도메인(CTD)에 아직 정의된 표면과의 상호작용을통해 Pol II 신장 복합체로 모집된다 5. 신장 복합체에서, 캡핑 효소는 초기 전사체가 적어도 18개의 뉴클레오티드의 길이에 도달하고 중합효소 RNA 출구 채널로부터 나오면 5′-구아노신 캡의 첨가를 촉매한다. 캡핑 반응의 첫 번째 단계에서, 트리포스파아제는 RNA 5′-트리포스페이트5′-이인산염을 산출하기 위해 가수분해한다. 제 2 단계에서, GTP는 GMP 캡핑 효소 중간체를 형성하는 guanylyl 트랜스페라제에 의해 GMP로 가수분해된다. 마지막으로, guanylyl 트랜스퍼라제는 캡을 생성하기 위해 초기 전사체의 5′-디포스페이트 말단으로 GMP를 전송한다.

캡핑 반응의 주목할 만한 특징은 공동 전사 캡핑(즉, 기능성 Pol II 신장 복합체와 관련된 전사체의 캡핑)이 자유RNA 5,^9의캡핑보다 훨씬 더 효율적이라는 것이다. 따라서, 현장에서 중요한 질문은 폴 II 신장 복합체와의 캡핑 효소의 상호 작용을 통해 캡핑의 극적인 활성화가 어떻게 이루어지는가하는 것입니다. 이 프로토콜에서 우리는 정제된 RNA 폴리머라제 II 및 인공 전사 기포만을 사용하여 활성 RNA 폴리머라제 II 신장 복합체의 조립을 기술한다. 이러한 방법은 정의된 길이 및 서열의 전사체를 가진 RNA 중합효소 II 신장 복합체의 생성을 허용한다. 최근 연구에서, 우리는 RNA 캡핑 5의 기계장치의 양상을 조사하기 위한 모형으로 이 정의된 RNA중합효소 II 신장 복합체를 이용했습니다. 특히, 우리는 (i) 이들 신장 복합체와 관련된 RNA의 캡핑이 자유 RNA의 캡핑보다 100배 이상 효율적이었으며(ii) Pol II CTD의 TFIIH 의존성 인산화에 의해 자극되었다는 것을 보여주었다. 여기서 설명된 접근법은 원칙적으로 Pol II 신장 복합체에 연결된 다른 공동 전사 RNA 처리 반응을 연구하기 위한 기판을 생성하도록 적응될 수 있었다.

이 프로토콜의 섹션 1에서, 인공 신장 복합체는 템플릿 가닥 DNA의 약 9 개의 뉴클레오티드에 3’끝에서 상보적인 RNA 올리고뉴클레오티드에 합성 템플릿 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드를 어닐링하여 생성됩니다. Pol II는 DNA:RNA 이중에 적재됩니다. 신장 복합체는 그 후 3′-끝에서 비오틴으로 표지되는 부분적으로 상보적이고 비템플릿가닥 DNA 올리고뉴클레오티드를 첨가하여 완성된다(도1 및 도 2A). RNA 올리고뉴클레오티드는 이러한 신장 복합체에서 Pol II에 의해 확장되어 방사성 표지된 뉴클레오티드의 적절한 조합을 추가하면 정의된 길이 및 서열의 방사성 표지된 전사체를 만듭니다. 또한, 무통합 뉴클레오티드를 제거하고 뉴클레오티드의 상이한 조합을 추가로 첨가하기 위해 세차의 조합을 사용하여, 하나는 DNA 템플릿을 따라 상이한 위치에 Pol II를 “걸을”수 있고 정의된 길이의 RNA를 합성할 수 있다. RNA는 그 때 정제되고 요소-PAGE 젤을 이변하는 전기 영동을 행한다. 프로토콜의 섹션 2에서, 인공 신장 복합체는 공동 전사 RNA 캡핑을 분석하는 데 사용됩니다. 제시된 실시예는 공동 전사 RNA 캡핑에 대한 Pol II CTD의 TFIIH 의존성 인산화의 효과를 측정한다. 본 실험에서, 우리는 효소 농도(반응당 5, 15 및 45 ng)와 시간(1, 2 및 4분)의 함수로서 공동 전사 캡핑의 정도를 측정하였다.

Protocol

1. 인공 신장 복합체 및 폴 II 걷기의 조립

1. 자기 비드상에 3′ 비오틴 분자를 함유하는 비템플릿 DNA 올리고의 1nmol을 고정화.
   참고: 다음 단계는 향후 실험을 준비하기 위해 미리 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 올리고 서열은 표1에 제공됩니다. RNA 올리고는 5′-삼인산염 수정과 합성됩니다.
   1. 200 μL의 자기 비드(10 mg/mL)를 저단백 결합 1.5 mL 튜브에 넣고 2분 동안 자기 랙에 놓습니다.
   2. 튜브가 마그네틱 랙에 있는 동안 구슬을 방해하지 않고 튜브에서 액체를 제거합니다. 구슬을 세척하려면 랙에서 튜브를 제거하고 5 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl을 추가하고 튜브를 랙에 반환하고 2 분 후에 세척 용액을 제거하십시오.
   3. 동일한 버퍼의 200 μL을 사용하여 2회 더 세서합니다.
   4. 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 버퍼의 400 μL에서 자기 비드를 다시 일시 중단하십시오. 이어서_H2O의 380 μL 및 10 μM의 20 μL과 혼합하여 비템플릿 생체티니화 DNA 올리고. 튜브를 영양분 위에 놓고 실온에서 30 분 동안 배양하십시오.
   5. 5 mM Tris-HCl pH 7.5의 200 μL로 3 회 고정화 된 논 템플릿 DNA 올리고를 세척하십시오. 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl, 그리고 200 μL의 200 μL로 200 μL의 HEPES-NaOH pH 7.9, 20% 글리세롤, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0.5 mg/mL 소 혈청 알부민을 3회.
   6. BSA로 비드차단을 완료하기 위해 튜브를 4°C에서 밤새 둡니다.
   7. 다음날, 튜브를 마그네틱 랙에 놓고, 액체를 제거하고 폐기하고, 200 μL의 HEPES-NaOH pH 7.9, 20% 글리세롤, 100 mM KCl, 1mM EDTA, 0.5 mg/mL 소 혈청 알부민을 제거하고 새로운 튜브로 옮김을 재중단시켰다. 이 DNA 템플릿의 경우, 최종 농도는 약 5 μM이다.
      참고: 인큐베이션 시간 및 올리고 농도는 각 생체이식 DNA 올리고에 대해 경험적으로 결정되어야 합니다. 이 템플릿은 200개의 반응을 충분히 제공하고, 4°C에서 저장될 때 적어도 6개월 동안 지속되어야 한다.
2. 어닐레 RNA 및 DNA 템플릿 가닥 올리고뉴클레오티드 올리고는 2:1 몰 비(각각 20 및 10 pmol)로 DNA:RNA 이중을 얻었다.
   1. 표2에 설명된 바와 같이 10 μL 어닐링 믹스를 설정합니다.
      참고: 어닐링 믹스 10 μL은 10개의 반응에 충분합니다. 더 많은 assays가 수행될 경우 어닐링 믹스는 필요에 따라 확장될 수 있습니다.
   2. 다음 프로그램을 사용하여 열 사이클러에서 어닐링 반응을 수행합니다: 45°C에서 5분, 12사이클각각 2분, 43°C에서 시작하여 사이클당 온도 2°C를 감소시다. 4 °C에서 유휴 상태.
      참고: 이것은 유연한 시간입니다. 어닐링은 ~ 30 분 이내에 완료되지만 더 긴 기간 동안 4 °C에서 방치 할 수 있습니다. 실험실에서, 어닐링 혼합물은 반응 효율의 어떤 감소를 관찰하지 않고 최대 4 시간 앉아 남아있다.
   3. RNA를 템플릿 가닥 DNA로 어닐링하는 동안 프로토콜의 이후 단계에 대한 버퍼를 준비합니다. 각 버퍼에 대한 단일 반응을 준비하는 데 필요한 성분은 표 2에서 8에나열되어 있습니다. 세척의 경우 [Y(X+1) + 1]의 비율로 레시피를 확장하고 다른 모든 버퍼의 경우 (X+1)를 배율로 조정합니다. X = 준비될 반응의 수; Y = 필요한 세척 단계 수(최소 3).
      참고: 실험 당일 모든 버퍼를 새로 준비합니다. PVA가 버퍼에 추가된 후에는 튜브를 얼음 위에 두지 마십시오. 사용하기 직전에 폴리 II 또는 뉴클레오티드를 완충액에 추가하십시오.
3. DNA:RNA 하이브리드에 정제된 RNA 폴리머라제 II를 로드합니다.
   1. DNA:RNA 이중13 μL의 폴 II 완충액을 혼합한다(표 3에서).
   2. 1.3.1 단계에서 혼합물에 정제 된 RNA Pol II (1 μL)의 ~ 0.02 단위를 추가하고 거품을 도입하지 않고 부드럽게 위아래로 파이펫팅하고 파이펫 팁으로 저어서 섞습니다. 30 °C에서 10 분 동안 배양하십시오.
      참고: 여기에서 주어진 볼륨은 단일 반응에 대한 것입니다. 실험에서 반응 의 수에 대해 필요에 따라 확장할 수 있습니다. 기재된^바와 같이 쥐간으로부터 정제된 RNA Pol II(10)는 본 예에서 사용된다; 그러나, 배양된 포유류 세포 또는 효모를 포함하는 다른 공급원으로부터정제된 RNA Pol II는 또한 3, 4,^{5,11,12,13을}사용할 수 있다.
4. 생체이식 비템플릿 DNA를 첨가하여 신장 복합체를 완료한다.
   1. 5 pmol (1 μL)의 고정화 된 논 템플릿 DNA 올리고를 14 μL의 비 템플릿 DNA 버퍼 (표4에서)에 추가하고, 단계 1.3.2에서 튜브에 추가하고, 37 °C에서 10 분 동안 배양합니다.
   2. 샘플을 마그네틱 랙에 2분 간 세척하고 30 μL의 세척 버퍼(표 7에서)를 사용하여 통합되지 않은 Pol II 및 올리고를 제거합니다.
5. 방사성 표지된 RNA 23mers를 포함하는 신장 복합체를 생성합니다.
   1. 30°C에서 모든 추가 배양을 수행합니다. 펄스 버퍼의 23 μL에 [α-32 P] UTP (3,000 Ci/mmol)의 1 μL 1μL 및 10 μCi (1 μL)를 추가하고 세척 된 자기 구슬을 다시 일시 중단하십시오.
      주의 사항: 방사성 물질은 유해합니다. 적절한 보호 장비를 착용하고 방사성 물질의 안전한 사용 및 폐기를 위해 모든 실험실 지침을 따르십시오.
      참고: 서부 블롯 실험과 같이 방사성 라벨이 부착된 RNA가 필요하지 않은 경우 방사성 표지형 UTP를 15 μM UTP로 교체하십시오.
   2. 방사성 표지된 23mers의 합성을 허용하기 위하여 10 분 동안 반응을 배양하십시오.
   3. 1.5 μL의 ATP와 100 μM UTP 믹스를 함유한 용액을 3.5 μL의 체이스 버퍼에 추가하고, 미리 조립된 연신 복합체가 함유된 튜브에 추가하고, 5분 동안 배양하여 모든 초기 전사체를 23mers로 추적합니다.
   4. 샘플을 마그네틱 랙에 2분 동안 놓고 상한제를 제거하고 30 μL의 세척 버퍼로 한 번 세척하여 통합되지 않은 뉴클레오티드를 제거하고 30 μL의 세척 버퍼로 다시 일시 중단하십시오.
   5. 단백질타아제 K 및 글리코겐(표 9)과94 μL의 스톱 믹스를 첨가하여 반응을 종결시키거나 섹션 1.6으로 진행하여 더 긴 전사체 또는 섹션 2를 사용하여 연신 복합체를 생성하여 캡핑 아술을 수행한다.
6. (선택 사항) 23, 25, 29 뉴클레오티드 전사체를 만들기 위해 Pol II를 걷십시오.
   1. 1.2.1 단계부터 1.5.4 단계까지설명된 절차를 따라 방사성 라벨이 부착된 23mers를 포함하는 신장 복합체를 준비한다. 4배 확장하여 4회 반응에 충분한 복합체인 세척된 신장 복합체 120μL을 생성합니다.
   2. 라벨 3 새로운 튜브 “23mer”, “25mer”와 “29mer”. 세척된 신장 복합체 30 μL을 “23mer” 튜브로 옮기고 94 μL의 스톱 믹스를 단백질성 K 및 글리코겐과 첨가합니다.
   3. 나머지 90 μL의 세척된 연신 복합체를 포함하는 튜브를 자기 랙에 2분 동안 놓고, 상류를 제거하고, 1.5 mM ATP 및 1.5 mM CTP 각각 1.2 μL로 보충된 BTB의 90 μL에서 구슬을 다시 놓습니다. 30 °C에서 10 분 동안 배양하십시오.
   4. 1.5.4단계에서 설명한 바와 같이 90 μL의 세척 완충액으로 한 번 세척하고 90 μL의 세척 버퍼로 재중단한 후, 30 μL의 연신 복합체를 “25mer” 튜브로 옮기고 94 μL의 스톱 믹스를 단백질Ase K 및 글리코겐과 첨가합니다.
   5. 남은 60 μL의 연신 복합체를 포함하는 튜브를 자기 랙에 2분 동안 놓고, 상류를 제거하고, 1.5 mM ATP 및 1.5 mM CTP 각각 0.8 μL로 보충된 BTB의 60 μL에서 구슬을 다시 놓습니다.
   6. 30°C에서 10분 동안 배양하고, 섹션 1.5.5에서와 같이 60 μL의 세척 버퍼로 한 번 세척하고, 60 μL의 세척 버퍼로 다시 중단합니다.
   7. 2x 샘플에서 “29mer” 튜브로 30 μL을 옮기고 94 μL의 스톱 믹스를 단백질Ase K 및 글리코겐과 첨가하거나 섹션 2로 진행하여 캡핑 검술을 수행합니다.
   8. RNA 정제 및 분석을 진행합니다(섹션 3).

2. 인공 신장 복합체를 사용하여 분석 코transcriptional 캡핑

1. 1.2.1 단계부터 1.5.5 13배까지 의 절차를 확장하여 23mers를 포함하는 세척된 신장 복합체를 생성한다. 이것은 12 개의 반응 + 1 개의 추가 반응에 충분합니다.
2. 폴 II CTD 인산화
   1. 세척된 신장 복합체를 함유한 튜브를 자기 랙에 2분 동안 놓고, 상급렌즈를 제거하고, 1.5 mM ATP의 13 μL로 보충된 BTB의 377 μL에 구슬을 다시 놓습니다.
   2. 각각 +H와 -H로 표시된 두 개의 새 튜브를 준비합니다. +H라고 표시된 튜브에 ~ 300 ng/μL TFIIH의 3 μL을 추가하고,H 표지된 튜브에 20 mM HEPES-NaOH pH 7.9, 20% 글리세롤, 100 mM KCl, 1 mMEDA, 0.5 mg/mL 소 혈청 알부민의 9 μL을 추가한다.
      참고: 우리는 일반적으로 쥐 간에서 정제 된 TFIIH를 사용하지만, 시판 되는 재조합 Cdk7 / Cyclin H / MAT1 (CAK, TFIIH의 키나아제 모듈)의 ~ 0.6 μg / 반응을 사용하여 유사한 결과를 얻었습니다. 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
   3. 세척된 신장 복합체의 87 μL을 단계 2.2.1로부터 +H 및 270 μL의 세척된 연신 복합체의 튜브에 -H. 30°C에서 10분 인큐베이트하여 첨가한다.
   4. 샘플을 마그네틱 랙에 2분 동안 놓습니다. 과도한 뉴클레오티드와 언바운드 단백질을 제거하려면 각각 90 μL 또는 270 μL의 세척 버퍼로 +H 및 -H 반응으로 신장 복합체를 세척하십시오.
3. RNA 캡핑
   1. 캡핑 믹스의 87 μL에서 +H로 표시된 튜브의 신장 복합체를 재중단(BTB 50μM GTP(표 10)으로 보충하였다. 캡핑 믹스의 261 μL에서 -H로 표기된 튜브내의 연신공 복합체를 재중단시켰다.
   2. 5 ng CE +H, 5 ng CE, 15 ng CE, 45 ng CE로 표시된 4 개의 새로운 튜브를 준비합니다. 캡핑 효소(CE)를 20 mM HEPES-NaOH pH 7.9, 글리세롤 20%, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0.5 mg/mL 소 혈청 알부민으로 희석하여 5 ng CE/μL, 15 ng CE/μL, 15 ng CE/μL, 또는 45 ng CE/μL 및 45 ng CE/μL을 함유하는 용액을 준비하기 위해 적절한 튜브의 45 ng CE/μL 및 디스펜스 3L을 각각 의약 외7.
   3. 각각 94 μL의 스톱 버퍼(2.1.1)를 추가하여 12개의 새로운 튜브를 준비합니다.
   4. TFIIH로 처리된 신장 복합체의 87 μL을 추가하거나 캡핑 효소를 함유하는 표지된 튜브에 첨가하여 각 캡핑 반응을 시작합니다. 열 블록에서 30 °C에서 배양합니다.
   5. 1, 2, 또는 4분 후, 각 반응 혼합물의 30 μL을 94 μL의 스톱 버퍼를 함유하는 튜브로 이송하여 반응을 멈춥니다. 섹션 3에 기재된 바와 같이 반응 제품을 정화하고 분석한다.

3. RNA 정화 및 분석

1. 정제 RNA
   1. 실온에서 20 분 동안 스톱 버퍼로 반응 제품을 인큐베이션합니다.
      참고: 일시 중지 지점. 이 완충제의 샘플은 RNA의 손실 또는 분해 없이 최대 4시간 동안 유지되었다.
   2. 페놀 124 μL:클로로폼:이소아밀 알코올(25:24:1)으로 한 번 추출하고 클로로폼:이소아밀 알코올(24:1)으로 추출합니다.
      주의 사항: 페놀은 매우 독성이 있으며 피부에 빠르게 흡수됩니다. 적절한 보호 장비를 착용하십시오.
      참고: 추출 중에 RNA의 회수를 최대화하려면 수성 및 유기 상 사이의 안정적인 장벽을 형성하는 고밀도 젤을 포함하는 시판 되는 튜브를 사용하십시오. 토론 및 재료 표를참조하십시오.
   3. 수성상(상부층)을 3M 아세테이트 pH 5.2의 12.4 μL을 함유하는 새로운 튜브로 옮니다.
2. 에탄올 강수량
   1. 100% 에탄올 350 μL을 넣고 반전하여 철저히 섞으세요.
   2. 드라이 아이스에 적어도 10 분 동안 배양하십시오.
      참고: 일시 중지 지점. 편의를 위해 여기에서 멈추고 다음 날 절차를 완료 할 수 있습니다. 그러나, 3.3 단계로 직접 진행하고 같은 날에 겔을 실행할 수 있다. RNA는 추가 처리 전에 며칠 동안 -80°C에서 보관될 수 있지만 더 긴 시간 동안 방치하지 마십시오.
3. 젤 전기 동에 대한 RNA 샘플 준비
   1. 샘플을 해동하고, 2-3회 반전하여 혼합하고, 탁상 원심분리기에서 21,000 x g, 4°C에서 15분 동안 원심분리기를 섞습니다. 한편, 변성 겔 믹스를 설정 (섹션 3.4.1).
   2. 펠릿을 방해하지 않고 시료에서 에탄올을 조심스럽게 제거하십시오.
   3. 70% 에탄올 500 μL을 넣고 튜브를 몇 번 뒤집어 펠릿을 씻은 다음 실온 또는 4 °C에서 5 분 동안 21,000 x g에서 다시 원심 분리합니다.
   4. 가능한 한 많은 에탄올을 제거하고 테이블 상단 원심 분리기에서 튜브의 빠른 스핀 (5-10 초)을하십시오. 그런 다음 젤 로딩 팁으로 마지막 남은 에탄올 부피를 제거하십시오.
   5. 실온에서 3분 간 공기 건조 펠릿.
   6. 각 펠릿의 상부에 H₂O의 4 μL을 첨가하여 RNA를 용해시켰다. 실온에서 5분 동안 배양합니다.
   7. 2x RNA 염료 4 μL을 혼합물에 넣고(재료 표참조)를 넣고 각 튜브를 몇 초 동안 소용돌이치며 RNA를 완전히 다시 중단시냅니다.
      참고: 우레아 대신 포르아미드를 함유한 RNA 염료는 후자가 저온에서 침전되기 때문에 권장됩니다.
   8. 튜브를 빠르게 회전한 다음 70°C에서 열 블록에서 10분 동안 배양합니다.
   9. 젤에 적재할 준비가 될 때까지 드라이 아이스에 튜브를 보관하십시오.
      참고: RNA를 드라이 아이스에 보관하면 젤이 중합되는 동안 다른 실험에서 유연하게 작업할 수 있습니다. 해동 후 샘플을 다시 가열할 필요가 없습니다. 그러나, RNA는 젤이 달릴 준비가 되면 가열 후에 직접 적재될 수 있다.
4. 우레아-페이지 젤 준비
   1. 40 mL 젤 믹스의 경우, 50 mL 원추형 튜브에 결합: 요소 16.7 g, 15 mL의 40% 비스:아크릴아미드 용액 (19:1 비율), 4 mL 의 10 x TBE (1 M Tris-HCl, 1 M 나트륨 붕산염, 20 mM EDTA), 그리고 8 mL의 H₂O. 이 볼륨은 1.0mm 스페이서가있는 하나의 표준 크기 젤 (높이 18cm x 너비 16cm)에 충분합니다.
      주의 사항: 아크릴아미드는 매우 독성이 있습니다. 용액에 있을 때 흡입 위험이 없지만 취급 하는 동안 항상 실험실 코트, 장갑 및 안전 안경을 착용 하십시오.
      참고: 이 혼합물은 변성 15% 폴리아크릴아미드 겔을 주조하기 위한 것으로, 이는 RNA를 15-50 nt 사이에서 쉽게 해결한다.
   2. 우레아가 완전히 녹을 때까지 견과류에 젤 믹스가 함유된 닫힌 튜브를 놓습니다.
   3. 유리 판, 1mm 스페이서 및 15 웰 빗으로 젤 캐스팅 스테이션을 설정합니다.
   4. 빠르게 작용하여, 40 μL의 TEMED와 10% 황황산 암모늄 용액의 400 μL을 젤 용액에 넣고 잘 섞습니다. 25 mL 파이펫을 사용하여 플레이트 사이에 젤 용액을 붓고 빗을 삽입하고 겔이 적어도 2 시간 동안 중합되도록하십시오.
      참고: 젤을 사용하기 전에 2 시간 이상 부으면 습한 종이 타월로 덮고 (빗을 제자리에 두면) 건조하지 않도록 플라스틱 랩으로 감쌉니다.
5. 데내포질 겔 RNA 전기동동
   1. 중합 후, 겔을 러닝 탱크로 옮기고 15-30 분 동안 1x TBE에서 20 mA에서 미리 실행하십시오.
   2. 한편, 샘플을 해동 (냉동 하는 경우), 소용돌이, 그리고 2,000 x g, 4 °C에서 4 분 동안 그들을 회전.
   3. 준비가 되면 전원 공급 장치를 끄고 주사기를 사용하여 1x TBE로 각 우물을 조심스럽게 헹구십시오.
   4. 젤 로딩 팁을 사용하여 샘플을 젤에 로드합니다.
   5. 약 2시간 동안 또는 하부 염료(자일렌 시안올 FF)가 겔의 바닥에 도달할 때까지 일정한 20-30 mA에서 겔을 실행한다.
6. 젤을 제거하고 흡수성 종이에 놓고 플라스틱 랩으로 감쌉니까?
7. 방사성 표지된 젤을 인광체에 노출시소.
8. 형광체 이미지를 사용하여 형광체를 스캔하고 이미지를 분석합니다.

Representative Results

Discussion

RNA 처리 및 전사체 신장 자체의 조절과 같은 Pol II 신장 복합체에 결합된 사건을 해부하고자 하는 연구는 고도로 정제된 효소 시스템을 사용하여 크게 촉진될 수 있다. 이러한 효소 시스템을 설정하는 것은 어려울 수 있습니다. Pol II에 의한 프로모터 의존성 전사는 적어도 5개의 일반적인 전사 인자를 요구한다. 이러한 요인을 준비하고 비축하는 데는 몇 달이 걸릴 수 있습니다. 따라서, 이 과정에서의 속도 제한 단계는 종종 단순히 시험관에서 기저 전사를 재구성하는 데 필요한 전사 인자의 간부를 준비하는 것이다.

이 기사에서는, 우리는 정제 된 Pol II 및 합성 DNA 및RNA 올리고 뉴클레오티드만을 사용하여 인공 전사 신장 복합체 2,^3을 생성하기 위한 이전에 개발된 방법의 적응을 설명합니다. 생성된 신장 복합체는 전사적으로 활성되며 Pol II 전사 및 RNA 캡핑 5의 결합을조사하는데 사용하기에 적합하다. 염색질 및 이 정의된 효소 시스템에 존재하지 않는 많은 다른 단백질의 맥락에서 생체 내에서 전사 및 RNA 캡핑이 발생한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 따라서,이 시스템은 생체 내에서 발생하는 반응의 많은, 전부는 아니지만 재발 할 것으로 예상된다. 우리가 설명하는 프로토콜은 자기 구슬에 결합된 생체 형성 된 DNA를 통해 인공 신장 복합체를 고정시켜 이전 방법을 기반으로하여 연구원이 쉽게 반응 조건을 변경하거나 통합되지 않은 뉴클레오티드를 제거 할 수 있게합니다. 여러 단계의 시세 중에. 중요한 것은, 신장 복합체를 고정시키는 데 사용되는 태그가 Pol II 자체 또는 템플릿 가닥상이 아닌 DNA의 비템플릿 가닥의 한쪽 끝에 있기 때문에, 완전한 연신 복합체와 관련된 Pol IIs만이 구슬 위에 유지될 것이다.

초기 전사체는 캡핑 효소에 의해 변형되기 위해 5′-트리포스페이트 끝이 있어야 하기 때문에, 캡핑 실험에 사용되는 합성 RNA 올리고뉴클레오티드는 5′-삼인산염 테르미니와 함께 구입됩니다. 그러나, 수정되지 않은 RNA 올리고는 다른 공동 전사 RNA 처리 사건의 연구 또는 Pol II 신장을 조절하는 전사 인자의 활동을 포함하는 다른 응용 에 사용될 수 있다. 다운스트림 응용 에 관계없이, 우리는 고도로 정제 된 DNA와 RNA 올리고와 신장 복합체를 조립하는 것이 좋습니다. 특히, 생체형성 DNA 올리고는 HPLC에 의해 정제되어야 하며, 다른 DNA 및 RNA 올리고는 폴리아크릴아미드 겔 전기동공및/또는 HPLC에 의해 정제되어야 한다. 그러나 효소 활동의 순도는 사례별로 결정되어야 하며 각 실험의 범위에 따라 달라집니다.

조립의 마지막 단계에서 비 템플릿 생체 질화 된 DNA 올리고를 추가하는 것은 원칙적으로 삼차 복합체를 얻기에 충분해야합니다. 그러나, 우리는 항상 Pol II가 뉴클레오티드의 정확한 수를 통합확인하기 위해 적어도 하나의 “걷기” 단계를 포함합니다: 실험의 목적이 공동 전사 캡핑 또는 다른 RNA 처리 단계를 위한 기판을 생성하거나 Pol II를 따르기 위한 경우 연신율, 우리는 항상 초기 “걷기”에 ³²P 표지 된 리보뉴클레오티드를 포함하여 전사체를 시각화하고 후속 보행 단계에 대한 레이블이 없는 “감기” 뉴클레오티드를 사용하여 상이한 길이의 전사체의 특정 활성을 일정하게 유지됩니다. 이 프로토콜에 기술된 방법은 32개의 P 표지된 뉴클레오티드를 사용하여 초기 전사체를 시각화하지만, 형광 계 분석법은 방사성 물질로 작업할 수 없을 때 RNA 라벨링을 측정하는 데 사용될 수 있습니다. 그러나, 이러한 assays의 감도는 일반적으로 방사성 라벨을 사용하는 것보다 훨씬 적으며, 일반적으로 더 많은 양의 효소가 필요하다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.

재현 가능한 실험을 위한 중요한 단계는 페놀:클로로포름:이소아밀 추출 및 에탄올 침전 동안 좋은 RNA 회수입니다. 우리는 페놀 :클로로포름 : 이소아밀 추출에 대한 고밀도 젤을 포함하는 미세 원심 분리튜브 (재료 표참조)를 사용하여이 단계에서 핵산의 재현성과 수율을 증가시킨다는 것을 발견했습니다. 또한, 에탄올 침전 시 담체로서 착색 된 글리코겐 (재료 표참조)을 사용하면 작은 핵산 펠릿을 쉽게 볼 수 있으므로 제거 중에 실수로 펠릿을 잃어 잃을 가능성이 적습니다. 에탄올 상급.

우리가 설명하는 것과 유사한 프로토콜을 사용하여 생성된 인공 신장 복합체는 또한 Pol II 신장 복합체와 전사체를 조절하는 요인 사이의 단백질 단백질 또는 단백질 핵산 상호 작용을 측정하는 데 유용해야 합니다. 연신장 또는 RNA 처리 이벤트가 연수에 연결됩니다. 이 경우, 세척 후 인공 신장 복합체에 결합 된 단백질은 서양 블로팅 또는 질량 분석법에 의해 검출됩니다. 방사성 라벨링 RNA는 필요하지 않으며 우리는 “감기”뉴클레오티드만으로 모든 전사 단계를 수행합니다.

마지막으로, 이 방법은 전사 복합체의 구조 분석에 사용될 수 있다. 실제로, 관련 방법은 효모 및 포유류 효소를 이용한 저온 EM 연구에서 캡핑 효소-Pol II 상호작용^13,및 연신기간 동안 다른 단백질 또는 단백질 복합체와의 Pol II상호작용을 재구성하는 데 사용되어 왔다^12, 일시 중지^16,17, 그리고 가장 최근에, 뉴클레오좀^18에바인딩 . 이 방법을 사용하여 생성 된 전사 복합체의 구조 분석을위한 가능한 합병증은 복합체에서 비오틴 / 자기 구슬을 제거 할 필요성; 그러나, 이는 제한 효소에 의해 인식되는 DNA 올리고스 특이적 부위를 포함하거나 UV선 치료 후 절인비오틴 링커(19)를 사용하여 해결할 수 있다.

Materials

[&alpha;-<sup>32</sup>P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi	Perkin Elmer	NEG007H001MC	For radiolabeling RNA
2x RNA loading dye	New England Biolabs	B0363S	Highly recommended. For preparing RNA during gel loading
40% Bis:Acrylamide solution	Biorad	1610144
Bovine Serum Albumin (20 mg/mL)	New England Biolabs	B9000S
Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 &micro;g	Millipore Sigma	14-476	Used to phosphorylate Pol II CTD
DNA oligonucleotides	IDT		See Table 8 for purity specifications
Dynabeads MyOne Streptavidin C1	Life Technologies Invitrogen	65001	We have also used Dynabeads M-280 streptavidin without problem but prefer MyOne Streptavidin beads because they sediment more slowly
GlycoBlue Coprecipitant (15&thinsp;mg/mL)	Life Technologies Invitrogen	AM9516	Highly recommended. Dyes nucleic-acid pellet blue making reactions much easier to handle
Hoefer SE600 standard dual cooled vertical electrophoresis system with 1 mm spacers and 15 well comb	Hoefer	SE600-15-1.5
MaXtract high density tubes (1.5 mL)	Qiagen	129046	Highly recommended. Contains a high density gel that forms a stable barrier between aqueous and organic phases; improves RNA yields during extractions
Proteinase K solution (20&thinsp;mg/mL)	Life Technologies Invitrogen	25530049
RNA oligonucleotides	Trilink		See Table 8 for more details
Yeast Inorganic Pyrophosphatase (100 units/mL)	New England Biolabs	NEBM2403S	Required only during capping reactions