체외 방사선 생물학 실험을 수행하기위한 선형 가속기 의 사용

요약

임상 선형 가속기는 암세포에 대한 광범위한 투여량 비율의 생물학적 효과를 결정하는 데 사용될 수 있다. 우리는 세포 기지를 둔 계산서를 위한 선형 가속기를 설치하는 방법 토론하고 암 줄기 같이 세포를 위한 세포 기지를 둔 세포 같이 세포는 부착한 문화로 성장한 현탁액 및 세포주에서 종양구로 성장했습니다.

초록

방사선 요법은 암 관리의 초석 중 하나입니다. 대부분의 암에 대 한, 그것은 가장 효과적인, 비 수술 치료 는 종양을 debulk. 여기서, 우리는 선형 가속기로 암세포를 조사하는 방법을 기술한다. 선형 가속기 기술의 발전은 방사선 요법의 정밀도와 효율성을 향상시켰습니다. 방사선 복용량 및 복용량 비율의 넓은 범위의 생물학적 효과 조사의 강렬한 영역을 계속. 선형 가속기의 사용은 임상적으로 관련된 복용량 및 복용량 비율을 사용하여 이러한 연구를 용이하게 할 수 있습니다.

서론

방사선 요법은 암 1, 2,^3,4의많은 유형에 대한 효과적인 치료입니다. 초고용량 조사는 방사선 요법에서 비교적 새로운 것이며 선형 가속기 5의 최근기술 발전에 의해 가능하게된다. 표준 복용량 비율 조사에 비해 추가 높은 복용량 비율의 임상 이점은 단축된 처리 시간 및 향상한 참을성 있는 경험을 포함합니다. 선형 가속기는 또한 세포 배양 기반 방사선 생물학 연구를 위한 임상 설정을 제공합니다. 방사선 선량 및 용량 비율의 생물학적 및 치료적 의미는 수십 년 동안 방사선종양전문의와 생물학자의 관심의 초점이었다 6,^7,8. 그러나, 여분의 높은 복용량 비율 조사 및 플래시 조사의 방사선 생물학 - 방사선의 매우 높은 복용량 속도 - 아직 철저하게 조사되지 않았습니다.

감마선 조사는 세포 배양 기반 방사선생물학 9,^10,11에널리 사용된다. 방사선은 부패 방사성 동위원소 소스에서 방출 감마선에 의해 달성된다, 일반적으로 세슘-137. 방사성 소스의 사용은 매우 규제되고 종종 제한됩니다. 소스 기반 조사를 통해 광범위한 용량 비율을 테스트하는 것이 어렵고, 임상 달성 가능한 용량 비율^12의생물학적 효과 분석에 그 유용성이 제한됩니다.

복용량 과 복용량 속도 효과 모두 설명 하는 여러 연구 되었습니다^{12,13, 14,15,16,17}. 이러한 연구에서는, 선형 가속기에서 생성된 방사성 동위원소 또는 X선으로부터 생성된 감마-조사가 모두 사용되었다. 폐암, 자궁경부암, 아교모세포종 및 흑색종을 나타내는 다양한 세포주를 사용했습니다. 세포 생존, 세포 주기 체포, 세포 사멸 및 DNA 손상에 대한 방사선 효과는 판독^{12,13,14,15,16,17로 평가되었다.} . 여기서, 우리는 선형 가속기를 사용하여 X선 기반 방사선을 전달함으로써 임상적으로 관련 방사선 선량 및 선량의 생물학적 효과를 정의하는 방법을 기술한다. 이 연구 결과는 생물학자, 방사선 종양전문의 및 의학 물리학자 사이 가까운 협력으로 수행되어야 합니다.

프로토콜

1. 현탁액 세포 배양을 위한 세포 준비

1. 배양 신경교종 줄기형 세포는 37°C에서 5% CO2, 95% 상대 습도를 가진 세포배양 인큐베이터에서 약 5 x 10⁶ 세포/10 cm 플레이트에서 줄기 세포 배양 배지에서 줄기줄기 유사 세포를 배양한다.
   참고: 세포 배양 조건은 모든 절차에 걸쳐 동일합니다. 프로토콜에 사용되는 미디어는 완전한 미디어입니다.
2. 예정된 조사 이틀 전에, 배양 후드에 멸균 5 mL 피펫을 가진 배양 플레이트로부터 신경교종 줄기 유사 세포를 15 mL 원심분리기 튜브로 수집한다.
3. 200 x g에서 3분 동안 싱크대 원심분리기에서 수집된 세포를 원심분리기.
4. 상온액을 버리고 섭씨-EDTA에서 단일 세포 현탁액을 만들기 위해 실온에서 1 mL의 트립신-EDTA로 세포 펠릿(약 1 x 10⁷ 셀)을 소화한다. 세포가 철저히 소화되도록 소화하는 동안 2 분마다 원심 분리기 튜브의 바닥을 부드럽게 흔들어줍니다.
5. 트립신을 담금질하기 위해 3 mL의 줄기 세포 배양 배지 (재료 표참조)를 추가합니다. 200 x g에서 수집된 세포를 카운터 상판 원심분리기에서 3분 동안 원심분리기. 상급을 버리고 세포 펠릿을 저장합니다.
6. 5 mL의 세포 배양 배지로 세포를 재중단하고 혈세포계로 세포를 계산합니다.
7. 플레이트 5 x 10⁶ 세포를 세포 배양 배지의 10 mL을 함유하는 2개의 10 cm 플레이트에 담는다.
8. 예정된 조사 직전에, 1.3단계에서 설명한 바와 같이, 세포를 수집하고 원심분리 후 상상액을 버린다. 세포 배양 배지의 5 mL로 세포 펠릿을 다시 중단시켰다. 세포 배양 배지의 2 mL를 포함하는 35 mm 플레이트에 1 mL의 세포 현탁액을 전달한다.
   참고 : 용지의 총 부피는 35mm 플레이트에서 3mL로 액체를 플레이트의 높이가 1cm로 만듭니다.
9. 플라스틱 또는 폼 박스와 같은 보조 용기에 도금 된 세포를 옮겨 오염 위험을 줄이고 용기에 있는 세포를 유틸리티 카트의 조사 시설로 가져옵니다.
10. 4단계에서 기재된 바와 같이 세포를 조사한다.

2. 부착 된 세포 배양용 세포 준비

1. 조사 1일 전, 세포 배양 후드에서, HEK-293 세포와 같은 부착된 세포주 배양판으로부터 DMEM 배지를 제거한다. 진공에 연결된 파스퇴르 파이펫을 사용하여 미디어를 흡입할 수 있습니다.
2. 5 mL의 멸균 PBS로 세포를 배양 접시에 씻어 잔류 배지를 씻어낸다.
3. 파이펫 1 mL 의 트립신-EDTA 배양 접시에 넣고 배양 판을 부드럽게 기울여 전체 접시가 트립신-EDTA로 덮여 있는지 확인합니다.
4. 실온에서 5분 동안 세포를 트립시니화. 3 mL의 DMEM 배지로 트립신-EDTA 반응을 담금질하고 배양 후드에 5 mL 파이펫을 가진 세포를 15 mL 원심분리튜브로 수집한다.
5. 200 x g에서 수집된 세포를 카운터 상판 원심분리기에서 3분 동안 원심분리기. 상급을 버리고 세포 펠릿을 저장합니다.
6. DMEM 매체의 5 mL로 세포를 다시 중단하고 혈세포계로 세포를 계산합니다.
7. 플레이트 2 x 10⁵ 세포를 35 mm 플레이트에서 3 mL의 세포 배양 배지를 사용하여 1 cm의 배지높이로 하였다.
8. 37°C에서 인큐베이터에서 24시간 의 세포 배양 후, 이차 용기(즉, 절연된 발포박스)에 도금된 세포를 유틸리티 카트상에 조사 시설로 옮김을 전달한다.
9. 4단계에서 기재된 바와 같이 세포를 조사한다.

3. 조사 후 면역 염색을위한 세포 준비

1. 밤새 4 °C에서 얼음에 상업적 인 세포 외 단백질 매트릭스를 해동. 밤새 4°C에서 200 μL 파이펫 팁 및 1.5 mL 원심분리튜브를 냉각시..
2. 미리 냉각된 파이펫 팁과 튜브당 200 μL의 1.5 mL 원심분리튜브가 있는 세포외 단백질 매트릭스.
3. 세포 배양 배지의 20 mL의 사전 냉각된 20 mL에서 세포외 단백질 매트릭스의 200 μL을 희석하여 1% 세포외 단백질 매트릭스 배지를 만듭니다.
4. 멸균된 커버슬립(22mm x 22mm)을 35mm 플레이트에 넣습니다. 커버슬립에 1% 세포외 단백질 매트릭스 매질 400 μL을 놓습니다.
5. 세포외 단백질 매트릭스가 커버슬립 상에 중합될 수 있도록 35 mm 플레이트를 37°C에서 1시간 동안 37°C로 세포 배양 인큐베이터에 놓습니다.
6. 현탁액 세포 배양을 사용하는 경우, 단계 1.1 에서 1.5단계에 기재된 바와 같이 단일 세포 현탁액을 만든다.
7. 플레이트 5 x 10⁴ 세포를 35 mm 플레이트에 놓은 세포 외 단백질 매트릭스 코팅 커버슬립. 도금된 세포를 밤새 세포 배양 인큐베이터로 돌려보내 세포가 단백질 매트릭스에 의해 지지되도록 한다. 배양 접시에서 배지의 높이가 1cm에 도달하도록 플레이트 내의 미디어의 총 부피는 3 mL이어야 한다.
8. 10배 배율 대물 렌즈로 밝은 필드 현미경으로 세포를 관찰합니다. 세포는 부동 대신 커버 슬립에 펼쳐져야합니다. 도금된 세포로 배양접시를 유틸리티 카트상에 있는 조사 시설로 폼 박스와 같은 보조 용기로 옮기고 4단계에서 설명한 바와 같이 세포를 조사한다.
9. 부착된 세포 배양체(예를 들어, HEK-293 세포)를 사용하는 경우, 단계 2.1 에서 2.6단계로 기재된 바와 같이 세포를 다이제스트한다. 5 x 10⁴ 세포를 조사 전날 35mm 플레이트에 멸균 커버 슬립에 놓아 3.9 단계에서와 같이 현미경으로 관찰하여 커버슬립 표면에 세포가 완전히 부착되었는지 확인하십시오. 3 mL의 DMEM 용지를 사용하여 플레이트의 높이가 1cm인 액체를 만듭니다.
10. 커버슬립에 세포를 성장한 후 하룻밤 또는 최대 1일까지, 배양 접시를 이차 용기에 도금된 세포로 이송하여 조사 시설로 옮김을 한다. 유틸리티 카트를 사용하여 유출 위험을 줄일 수 있습니다. 4단계에서 기재된 바와 같이 세포를 조사한다.

4. 선형 가속기 (LINAC)를 가진 조사

1. LINAC의 콘솔 소프트웨어를 사용하여 가속기 갠트리와 콜리메이터를 0°로 설정하고 X 및 Y 턱을 대칭 20 x 20cm² 필드 크기로 열고 다중 리프 콜리메이터(MLC)가 있는 경우 철회합니다.
   참고: LINACs는 매우 높은 용량 속도를 허용하는 FFF(fFF) 모드가 없는 평탄화 필터를 가질 수 있습니다. 이름에서 알 수 있듯이,이 방사선은 균일하지 않습니다 (평면), 높은 투여 량 속도는 빔의 중심에서 만 달성된다. 이 경우 7 x 7cm² 필드가 사용됩니다.
2. 처리 소파에 물 등가 물 5cm 이상을 놓습니다. 세포 접시를 400 MU/min(표준 용량 속도)으로 조사하여 물과 동등한 재료에 놓고 LINAC 십자선에 집중합니다.
3. 6 MV X 선 빔에 최대 용량의 깊이로 조사 할 세포를 배치, 약 1.5 cm. 접시의 상단에 물 등가 물 의 추가 1cm를 배치. 세포가 매달려있는 배지의 1cm와 결합하면 세포를 평균 깊이 1.5 cm로 배치합니다.
4. 앞면 포인터를 LINAC의 머리에 부착합니다. 맨 앞 포인터가 축적 재질의 표면에 닿을 때까지 확장하고 거리를 기록합니다. 소스에서 축적 표면까지의 거리가 100cm가 될 때까지 테이블 높이를 조정합니다.
   참고: 광 거리 표시기를 통해 거리를 확인할 수 있습니다. 대안적으로, 광학 거리 표시기는 100 cm로 표면을 축적하기 위해 소스를 설정하는 전면 포인터 대신에 사용될 수있다.
5. 적절한 수의 모니터 유닛(MU)을 계산하여 원하는 양의 방사선을 세포에 전달하고 가속기를 400 MU/min으로 전달하도록 프로그래밍합니다.
   참고: 최대 용량의 깊이에서 1cGy/MU를 제공하기 위해 보정된 LINAC의 소스 대 표면 거리(SSD) 설정의 경우, 필요한 수의 모니터 유닛은 MU = 투여량(cGy) / (1 cGy/MU) / OF(20x20)를 사용하여 계산되며, 여기서 OF는 출력 계수를 나타냅니다. 이 계산은 대체 교정 설정을 사용하여 LINACs에 대해 변경해야 합니다.
6. 치료 금고를 두고 다른 모든 개인이 종료되었는지 확인합니다. 방에 다른 세포가 없거나 방사선이 적어질 것이라는 점을 제거하십시오. 볼트 문을 닫습니다.
7. 콘솔에서 필드 크기, MU 및 MU/min을 확인한 다음 빔을 사용하도록 설정합니다.
8. 4.3-4.8 단계를 반복하여 세포가 더 높거나 낮은 용량 속도로 조사될 수 있도록 한다.
   1. 가속기로 더 높은 투여량 비율(예를 들어, 2100 MU/min 이상)을 달성하기 위해, 역제곱 법에 따라 세포에 대한 유효 투여율을 증가시키기 위해 SSD를 감소시다: 용량유효 =투여량 * (100 cm/SSD_New) 2.
   2. 낮은 투여량 비율(예를 들어, 20 MU/min)의 경우, 소스에서 표면 거리(SSD_New)를 증가시키고 투여율을 감소시다. 예를 들어, 세포 배양 접시는 치료실의 바닥에 놓일 수 있다.
   3. 이 설정이 필요한 경우 가속기의 모니터 장치 설정을 다시 계산하여 MU = 도량 (cGy) / (1 cGy / MU) / OF (20x20)/ (100cm / SSD_New)^2를사용합니다. MU 계산에 대한 자세한 내용은 McDermott 및 Orton^18참조를참조하십시오.
9. 복용량 비율 (Gy/Min) = 복용량 (Gy)*(MU/min)/MU에 의해 Gy/분에서 복용량 비율을 결정합니다. 예를 들어, 400 MU/min에서 전달된 4Gy는 380 MU가 필요하므로 4*400/380 = 4.2 Gy/min. 표1을 참조하십시오.

그림 1 : 선형 가속기에 세포 배양 접시를 설치합니다. (A) 임상 선형 가속기가 도시된다. (B) 5cm의 물 등가 재료는 트리트먼트 소파에 놓습니다. (C) 세포 배양 접시가 재료의 표면에 놓입니다. (D) 요리는 정사각형 라이트 필드에 표시된 처리 장에서 가속기 십자선을 사용하여 중앙에 있습니다. (E) 1cm 물 등가 재료는 세포 배양 접시 위에 놓습니다. 소스대 표면 거리(SSD)는 광학 거리 표시기(F,G)또는 전면 포인터(H, I)를 사용하여 확인된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

5. 조사 후 생물학적 암세

1. 조사 후, 상기와 동일한 방식으로 세포를 세포 배양 인큐베이터로 되돌려 보인다(단계 1.9, 2.8 및 3.10).
2. 필요에 따라 연구 프로젝트에 맞게 다양한 생물학적 검정을 맞춤화하십시오.
   참고: 여기서, 우리는 조사 후 생물학적 분석의 예로 대표적인 세포 주기 분석(16)을 나타낸다.

결과

선형 가속기에 의한 표준 투여량 율 및 엑스트라 고용량 레이트 조사의 세포 주기 효과를 조사하기 위해, 신경교종 줄기 유사 세포의 3개의 샘플을 이 프로토콜을 사용하여 제조하고 조사 후 24시간 수집한 1개의 대조군 샘플^17:1개의 대조군 샘플 조사되지 않은(그림2A), 400 MU/min(모니터 유닛, 4.2 Gy/min 표준 투여량, 도 2B)으로 조사된 샘플 1개, 2100 MU/min(21.2 Gy/min 엑스트라 고용량 레이트) 으로 조사된 다른 샘플, 그림 2 C)4 Gy. 세포 주기 프로파일은 세포 주기의 상이한 단계에서 세포의 백분율로 표시됩니다.

토론

방사선 요법은 암 관리의 필수적인 부분입니다. 지속적인 노력은 방사선 치료의 효능과 효율성을 개선하기 위해 노력한다. 선형 가속기 기술의 발전은 전례없는 정확성과 안전성으로 환자를 치료할 수 있는 기회를 제공했습니다. 대부분의 환자는 선형 가속기에서 고에너지 엑스레이로 취급되기 때문에, 선형 가속기에 수행된 복용량 비율의 큰 범위의 생물학 효력을 검토하는 연구 결과는 환자에게 쉽게 적용될 수 있습니다. 방사선 생물학 연구에 선형 가속기를 적용하는 여러 보고서가 있었지만 결과가 혼합되어 추가 연구가 필요합니다^{13,14,15,16,19.}

선형 가속기는 소정의 용량이 전달된 후 X선이 생성되지 않...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Material
glioma 줄기 유사 세포 387			Jeremy Rich 박사의 선물
293 세포	ATCC	CRL-1573
뉴런 줄기 세포 배양 배지	Thermo Fisher Scientific	21103049	NeurobasalTM 배지
DMEM	Thermo Fisher Scientific	10569044
소 태아 혈청	Thermo Fisher Scientific	16000044
페니실린/스트렙토마이신	Thermo Fisher Scientific	15140-122
재조합 인간 EGF 단백질	R& D 체계	236-EG-01M
재조합 인간적인 FGF 기본적인	R& D 체계	4114-TC-01M
B-27™ 보충제	Thermo Fisher Scientific	17504044
피루브산 나트륨	Thermo Fisher Scientific	,
L-글루타민	Thermo Fisher Scientific	,
Tripsin-EDTA	Thermo Fisher	25200056
세포외 프로텐 매트릭스	Corning	354277	MatrigelTM
에탄올	피셔 케미컬	A4094
Equipment
10 cm세포 배양 접시	Denville	T1110
3.5 cm 세포 배양 접시	USA Scientific Inc.	CC7682-3340
22x22mm 유리 커버 슬립	전자 현미경 과학	72210-10
15 ml 원심분리기 튜브	Thomas Scientific	1159M36
50 ml 원심분리기 튜브	Thomas Scientific	1158R10
5 ml 피펫	Fisher Scientific	14-955-233
피펫 보조기	Fisher Scientific	13-681-06
Vortex mixer	Fisher Scientific	02-215-414
원심분리기	Eppendorf	5810R
선형 가속기	Varian	해당 없음
물 등가 물질	Sun Nuclear corporation	557	고체 물TM
시약 준비
DMEM 매체	10% 소 태아 혈청(FBS), 2mM L-글루타민, 100 units/mL 페니실린 G, 100 &마이크로; 500 ml DMEM 배지
줄기 세포 배양 배지	10 ml B27 보충 자료, 20 µ g hFGF, 20 &마이크로; g hEGF, 2 mM L-글루타민, 100 units/mL 페니실린 G, 100 &마이크로; 500ml Neurobasal 배지의 g/mL 스트렙토마이신