여기에서 우리는 종의 존재를 정량화하고 식물 뿌리의 초기 식민지 동안 다른 성장 환경으로의 전송 후 박테리아의 공간 분포를 시각화하는 수경 식물 성장 분석방법을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
박테리아는 미생물, 더 큰 유기체 및 비생물적 환경을 상호 작용하여 형성된 복잡한 뿌리 구 미생물군유전체를 형성합니다. 실험실 조건 하에서, 식물 성장 촉진 박테리아에 의해 뿌리 구 식민지 (PGPB) 건강 또는 식민지화 되지 않은 식물에 비해 호스트 식물의 개발을 증가 시킬 수 있습니다. 그러나, 필드 설정에서, PGPB와 세균 성 치료 종종 작물에 상당한 혜택을 제공 하지 않습니다. 한 가지 설명은 이것이 식물의 수명 동안 내인성 토양 미생물과의 상호 작용 중에 PGPB의 손실때문일 수 있다는 것입니다. 대부분의 연구는 뿌리 구 지역 사회 내에서 PGPB의 유지 보수보다는 초기 식민지에 초점을 맞추고 있기 때문에이 가능성을 확인하기 가 어려웠습니다. 세균 공동체의 어셈블리, 공존 및 유지보수는 뿌리구 미세 환경의 결정적 특징에 의해 형성되며, 이러한 상호 작용이 네이티브 설정에서 PGPB 생존에 영향을 미칠 수 있다는 가설이 있습니다. 이러한 행동을 연구하기 위해, 수경 식물 성장 분석은 애기장대 탈리아나를 사용하여 식물 뿌리의 초기 식민지화 및 다른 성장으로 이동 한 후 박테리아의 공간 분포를 정량화하고 시각화하도록 최적화됩니다. 환경. 이 시스템의 재현성과 유틸리티는 잘 연구 된 PGPB 슈도모나스 시미아에로검증됩니다. 여러 세균 종의 존재가 식물 뿌리에 식민지 및 유지 보수 역학에 영향을 미칠 수있는 방법을 조사하기 위해, 세 가지 세균 균주에서 모델 커뮤니티 (관절염, Curtobacterium,및 Microbacterium 종) 원래 A. 탈리아나 뿌리 줄기에서 분리된다. 이 다양한 세균 종의 존재는 시퀀싱 기반 의 세균 공동체 연구에 대한 대안을 제공하는이 수경 식물 - maintanence 분석기를 사용하여 측정 할 수 있음을 보여준다. 이 시스템을 사용 하 여 미래 연구 시간이 지남에 따라 및 변화 하는 환경 조건에서 다종 식물 미생물군유전체에서 세균 행동의 이해를 향상 시킬 수 있습니다.
서론
세균 및 곰팡이 질병에 의한 작물 파괴는 식량 생산을저하시키고 심각하게 글로벌 안정성을 방해 할 수 있습니다 1. 억제 토양에 있는 미생물이 식물 건강을 증가시키는 책임있다는 발견에 근거하여 2, 과학자는 식물 microbiome가 특정의 존재 그리고 풍부를 수정해서 식물 성장을 지원하기 위하여 이용될 수 있는지 물었습니다 세균 종3. 식물 성장 또는 개발에 도움이 발견 하는 박테리아는 집합적으로 식물 성장 촉진 박테리아 라고 (PGPB). 최근에는 잠재적인 PGPB를 식별하는 것에서 부터 토양, 뿌리 주변 또는 뿌리줄기(뿌리 표면을 직접 둘러싸고 포함)에서 왕국 간 상호 작용이 PGPB에 영향을 미칠 수 있는 방법을 이해하는 것으로 연구가 전환되었습니다. 활동4.
PGPB에 의한 뿌리줄기 식민지화는 식민지화되지 않은 식물에 비해 다양한 스트레스에 반응하여 숙주 식물의 건강 또는 발달을 증가시킬 수있다5. 그러나, 결과는 종종 밀접하게 제어 온실 및 실험실 설정에서 관찰 된것과 비교하여 네....
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프로토콜
참고: 실험 설정은 명확성을 위해 설명되며 이 보고서에 포함된 대표적인 결과를 생성하는 데 사용되지만 조건은 원하는 대로 수정할 수 있습니다. 모든 단계는 PPE를 사용 하 여 수행 해야 하 고 안전에 대 한 기관 및 연방 reccomations 다음, 사용 하는 박테리아의 BSL 상태에 따라.
1. 박테리아의 특성화
- 성장 매체 한천 판에 박테리아의 형태를 결정합니다. 대략적인 OD600 = 0.5에서 세포를 재중단하고 1 μL 부피를 한천 배지상에 플레이트하여 선택의 폭을 다한다. 한천 접시에 X-gal을 추가하여 20 mg/mL의 최종 농도로 특정 세균 커뮤니티의 개별 구성원을 더 잘 구별하십시오. 식민지가 형성 될 때까지 24 °C 또는 30 °C에서 성장한 다음 식민지 형태에 대한 사진과 메모를 찍습니다.
- 각 박테리아 균주의 광학 밀도와 mL16당CFU(콜로니 형성 단위) 수 간의 상관 관계를 정의합니다. 대략적인 OD600 = 5에 24 웰 플레이트에 1 mL의 물에 박테리아를 다시 중단하고, 2 중일 직렬 희석을 수행하고, 모든 희석물의 OD600을 모니터링하고, 각 플레이트를 플레이트하여 다중 ....
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결과
잘 특징지어진 PGPB P. simiae WCS417r는 수경 재배 배양에서 A. 탈리아나의 뿌리를 식민지화하는 것으로 알려져 있다. 이 자연적으로 형광 박테리아는 쉽게 식민지 다음 모종의 뿌리에 현미경 검사를 사용하여시각화 할 수 있습니다 (그림 2). 이 A. 탈리아나 모종의 전체 길이를 이미지 할 수 있지만 (4-6 mm 길이) 뿌리, 많은 식물에 대해 그렇게하는 것은 시간의 엄청난 금액을 취할 것입니다. 박테리아의 시간점 및 종에 걸쳐 대부분의 변이는 뿌리14의 크라운, 중간 및 끝을 화상 진찰에 의해 포착될 수 있기 때문에 (그림 1에있는 빨간 상자로 표시), 이 지구는 화상 진찰보다는 오히려 화상 진찰을 위해 우선순위를 두어 있었습니다 길이. P. simia.......
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토론
모든 환경에서 식물은 다른 박테리아와 곰팡이의수백만에 수천 상호 작용 5,7. 이러한 상호 작용 은 작물 수확량 과 식품 생산에 잠재적 인 영향과 함께, 식물 건강에 부정적인 긍정적 인 영향을 미칠 수 있습니다. 최근 연구는 또한 PGPBs에 의한 작물의 가변 식민지화가 현장 실험22에서예측할 수없는 식물 크기와 작물 수확량을 설명 할 수 있음을 시사한다. 이러한 상호 작용 뒤에 메커니즘을 이해 하면 직접 건강 한 식물 개발에 도움이 식물 관련 미생물 커뮤니티를 조작 할 수 있습니다., 스트레스에서도24.
뿌리의 세균 식민지화와 뿌리 줄기에서의 유지 보수는 식물-미생물상호 작용 9에 매우 중요하기 때문에, 우리는 이러한 세균 행동을 재현가능하게 시각.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 작품은 에너지 생물 환경 연구부 (DOE-BER 0000217519에서 E.A.S.), 국립 과학 재단 (INSPIRE IOS-1343020 - E.A.S)에서 제공하는 연구 기금에 의해 지원되었습니다. SLH는 또한 국립 과학 재단 대학원 연구 펠로우십 프로그램에 의해 지원되었다. 제프리 당들 박사님은 세균균과 귀중한 통찰력을 제공해 주신 것에 대해 감사드립니다. 앤드류 클라인 박사와 매튜 제이 파워스 박사에게 실험적인 제안에 감사드립니다. 마지막으로, SLH는 과학을 전파하는 것은 특권과 책임, 특히 창의적이고 접근 가능한 수단을 통해 우리에게 상기시켜 준 소셜 미디어의 연결에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Required Materials | |||
| 1.5 mL eppendorf tubes | any | N/A | |
| 24-well plates | BD Falcon | 1801343 | |
| Aeraseal | Excel Scientific | BE255A2 | |
| Autoclave | 모든 | N/A | |
| 관심 박테리아 | any | N/A | stored at - 80? 40% 글리세롤 중 C |
| BactoAgar | BD | 2306428를 선호했습니다. REF 214010 | |
| 표백제 | 모든 N/A | ||
| Conviron | 모든 | N/A | 짧은 날 빛-어둠 주기: 460-600 &마이크로; Moles/M&Sup2;/S는 9/15시간 밝음/어둡게 18/21에 설정되나요? C, 내부 전원 콘센트 |
| 포함 Dessicator 항아리 : 유리 또는 무거운 플라스틱 | 없음 | 없음 | |
| 에탄올 | 없음 | 없음 | |
| 없음 화염 | 없음 | 없음 겸 | |
| 자 | 없음 | 없음 | |
| 인큐베이터 | 없음 | 없음 없음 | 지정된 박테리아의 성장을 위한 최적의 온도 |
| 염산 | 모든 | 해당 없음 | |
| Lennox LB Broth | RPI | L24066-1000.0 | |
| 마이크로 원심 분리기 | 모든 | N / A | |
| 마이크로 피펫 | 모든 | N / A | 볼륨 5 µ L에서 1000 &마이크로; L |
| 현미경 (형광 선호) | 모든 | N / A | 최상의 정의가 중요하지 않은 경우 가벼울 수 있음 |
| MS Salts + MES | RPI | M70300-50.0 | |
| Orbital Plate Shaker | 모든 | N / A | 최소 96 시간 동안 220rpm으로 작동 가능 |
| Petri Dishes | 모든 | N / A | 50 mL 총 부피 |
| Reservoirs | 모두 | N / A | |
| 분광 광도계 | 모든 | N / A | |
| 표준 홀 펀치 | 모든 | N / A | 약 7mm 펀치 직경 |
| 멸균수 | 모든 | N / A | |
| 수술 테이프 | 3M | MMM1538-1 | |
| 테프론 메쉬 | McMaster-Carr | 1100t41 | |
| 초음파 발생기 | 모든 N / A | ||
| Vortex Mixer | : | N / A | |
| X-gal | GoldBio | x4281c | 다른 공급 업체 사용 가능 |
| 제안 된 자료 < / strong> | |||
| 24 Prong Ultrasonicator 부착 | : | 한 | 번에 여러 샘플을 초음파 처리 할 수 있습니다. 개별적으로 수행 할 수 있습니다 |
| Alumaseal II | Excel Scientific | FE124F | |
| 유리 구슬 | 모든 | N / A | |
| Multipetter / Repetter | 모든 | N / A | |
| 멸균 96 웰 플레이트, | 모든 | N / A | 연속 희석의 경우. 에펜도르프 튜브로 교체 가능 |
| Biological Materials Used | |||
| Arabidopsis thaliana seeds | any | N/A | 종자에 대해서는 애기장대 생물학 자원 센터를 추천합니다 |
| Arthrobacter nicotinovorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Curtobacterium oceanosedimentum | Levy, et al. 2018 | ||
| Microbacterium oleivorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Pseudomonas simiae WCS417r | Haney, et al. 2015의 유사한 시스템에서 발표됨. Cole에서 개발된 사용된 균주, et al. 2017 |
참고문헌
- Strange, R. N., Scott, P. R. Plant disease: a threat to global food security. Annual Review of Phytopathology. 43, 83-116 (2005).
- Cook, A. M., Grossenbacher, H., Hütter, R. Isolation and cultivation of microbes with biodegradative potential. Experientia. 39
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