생체 내 2 광자 형광 평생 이미징 현미경 을 사용하여 머리 고정 행동 마우스에서 단백질 키나제 활동을 시각화

또한 느린 시냅스 전송으로 알려진 신경 변조는 스트레스, 각성, 주의 및 운동과 같은 다른 행동 상태동안 뇌 기능에 대한 강력한 제어를 부과 1,^{2,3, 4}. 그 중요성에도 불구하고, 신경 조절 이벤트가 일어나는 시기와 장소에 대한 연구는 아직 초기 단계에 있습니다. 아세틸콜린, 도파민, 노르아드레날린, 세로토닌 및 많은 뉴로펩타이드를 포함한 신경 조절제는 G 단백질 결합 수용체(GPCRs)를 활성화하여 광범위한 기간의 확장창을 통해 세포내 두 번째 메신저 경로를 트리거합니다. 초에서 시간까지. 각 신경 조절기는 신호 이벤트의 뚜렷한 세트를 트리거하는 동안, cAMP /단백질 키나제 A (PKA) 통로는많은 신경 조절제 1,^5에대한 일반적인 다운스트림 통로입니다. cAMP/PKA 통로는 신경 흥분성, 시냅스 전송 및 가소성 6,^7,8,9,따라서, 신경 네트워크 역학을 조정합니다. 다른 뉴런 또는 뉴런 유형이 신경 조절제 수용체의 다른 유형 또는 수준을 표현하기 때문에^10,동일한 세포 외 신경 조절기의 세포 내 효과는 다른 뉴런에 걸쳐 이질적 일 수 있으며, 따라서, 세포 해상도로 공부했습니다. 날짜를, 그것은 행동 하는 동안 생체 내 개별 뉴런에서 신경 조절 이벤트를 모니터링 하는 도전 남아.

신경 변조의 시공간 역학을 연구하기 위해서는 적절한 기록 양식이 필요합니다. 미세 투석 및 빠른 스캔 주기적 voltammetry는 신경 조절제의 방출을 연구하는 데 자주 사용되지만 세포 이벤트를 모니터링하는 공간 해상도가 부족합니다^11,12. 집단 화상 진찰13에 있는 신경 전기 활동에 대한프록시로 이용되고 있는 칼슘 역학과 유사하게, PKA 화상 진찰은 세포 해결책에 신경 인구에 걸쳐 신경 조절 사건을 판독하기 위하여 이용될 수 있습니다. 본 프로토콜은 동물 행동 동안 생체 내에서 PKA 활동을 모니터링하기 위해 개선된 A-키나아제 활성 리포터(AKAR)의 사용을 설명한다. 여기에 설명된 방법은 생리학적 신경 조절 이벤트를 추적하는 시간적 해상도로 세포 내 해상도에서 신경 인구의 동시 이미징을 허용합니다.

AR은 PKA 인산화 기질 펩타이드 및 기질의 인산화 세린 또는 스레오닌에 결합하는 지게차 관련(FHA) 도메인에 의해 연결된 공여자 및 수용체 형광 단백질(14,^15)으로구성된다. PKA 통로의 활성화시, AKAR의 기질 펩티드는 인산화된다. 그 결과, FHA 도메인은 인산화된 기질 펩티드에 결합하여, 두 개의 형광단을 근접하게, 즉 AKAR의 폐쇄 상태라고 한다. 인산화된 AKAR의 폐쇄 상태는 기증자와 수용자 형광단 사이의 증가된 Förster 공명 에너지 전달(FRET)을 초래합니다. 인산화된 AR의 비율은 PKA 활성^{도 16의}수준과 관련이 있기 때문에, 생물학적 샘플내의 FRET양은 PKA 활성의 수준을 정량화하는데 사용될 수 있다^{16,17,18, 19,20}.

AR의 초기 버전은 주로 2색 비율 측정 이미징^14를위해 설계되었습니다. 뇌 조직에 더 깊은 이미징을 할 때, 비율 측정 방법은 파장 의존광 산란으로 인해 신호 왜곡을 겪습니다^17,18,21. 아래에 논의된 바와 같이, 형광 평생 화상 진찰 현미경 검사법 (FLIM)은 FLIM이 기증자 형광에 의해 방출된 광자만 측정하기 때문에 이 문제를 제거합니다^18,21. 그 결과, FRET의 FLIM 정량화는 조직 심도(17)에 의해 영향을 받지 않는다. 또한, 수용기 형광단의 "다크"(즉, 낮은 양자 수율[QY]) 변이체가 사용될 수 있다. 이는 제2 센서 또는 형태학적^{마커(17,19,20)의}동시 이미징을 통해 직교 뉴런 특성의 다중화 측정을 용이하게 하는 컬러 채널을 해제한다.

FLIM 이미징은 형광공이 흥분한 상태, 즉 형광 수명^18에서보내는 시간을 정량화합니다. 불소가 지면 상태로 돌아오면, 따라서 흥분 상태의 끝은 종종 광자의 방출과 수반된다. 개별 흥분 분자에 대한 광자의 방출은 스토크이지만, 집단에서 평균 형광 수명은 특정 형광공의 특징입니다. 형광단의 순수한 인구가 동시에 흥분되면, 생성된 형광은 하나의 기하급수적 붕괴를 따를 것이다. 이 지수 붕괴의 시간 상수는 형광 단백질의 경우 일반적으로 1 ~ 4 나노 초 범위 평균 형광 수명에 해당합니다. 흥분한 공여자 형광단의 지상 상태로의 복귀는 또한 FRET에 의해 발생할 수 있다. FRET의 존재에서, 기증자 형광의 형광 수명이 감소된다. 인산화되지 않은 ALA는 상대적으로 더 긴 공여자 형광 수명을 나타낸다. PKA에 의한 인산화 시, 센서는 기증자와 수용자 형광체가 서로 가까이 가져오고 FRET가 증가하기 때문에 수명이 짧아지게 됩니다. 따라서 ALA의 집단에서형광 수명의 정량화는 PKA 활성의 수준을 나타낸다.

ALA의 초기 버전은 단세포 해상도에서 생체 내 이미징에 성공적으로 사용되지 않았습니다. 이는 주로 생리적 활성화(17)에 대한 AKAR 센서의낮은 신호 진폭 에 기인한다. 최근에는 2광자 형광 평생 이미징 현미경 검사법(2pFLIM)에 사용할 수 있는 AKAR 센서를 체계적으로 비교하여 FLIM-AKAR라는 센서가 대체 센서를 능가하는 것으로 나타났습니다. 더욱이, 표적으로 한 AKAR (tAKARs)에게 불린 일련의 FLIM-AKAR 이체는 특정 세포소 위치에서 PKA 활동을 구상하기 위하여 개발되었습니다: 마이크로소튜블 (tAKARα), 시토졸 (tAKARβ), 액틴 (tAKARδ), 필라멘트 액틴 (tAKARθ), 막 (tAKARγ), 및 후성 밀도 (tAKARθ). tAKAR중, tAKARα는 노르에피네프린에 의해 유도된 신호 진폭을 2.7배 증가시였다. 이는 뉴런에서 PKA의 대다수가 휴식 상태^22,23에서미세소관에 고정된다는 지식과 일치한다. tAKARα는 2pFLIM에 대한 기존 AR 중 최고의 성과를 보였습니다. 더욱이, tAKARα는 다중 신경조절기에 의해 유도된 생리학적 관련 PKA 활성을 검출하고, tAKARα의 발현은 신경 기능^17을변화시키지 않았다.

최근, tAKARα는 헤드 고정 된 행동 마우스^(17)에서PKA 활동을 시각화하는 데 성공적으로 사용되었다. 운동운동이 운동, 배럴 및 시각 코르티케에서 피상층 뉴런(층 1~3, 피아로부터 ~300 μm의 깊이까지)의 소마에서 PKA 활성을 유발한 것으로 나타났다. 운동 트리거된 PKA 활동은 β-아드레날린 수용체 및 D1 도파민 수용체를 통한 신호화에 부분적으로 의존했지만, D2 도파민 수용체 길항제에 의해 영향을 받지 않았다. 이 작품은 2pFLIM을 사용하여 생체 내에서 신경 변조 이벤트를 추적하는 tAKARs의 능력을 보여줍니다.

현재 프로토콜에서, 시행된 운동 패러다임 동안 헤드 고정 깨어 있는 마우스에서 PKA 활성 이미징을 위한 전체 방법은 6단계로 설명된다. 먼저, 종래의 2광자 현미경에 2pFLIM 기능을첨가하였다(도 1). 둘째, 전동 러닝머신의 시공(도 2). 셋째, DNA 플라스미드의 자궁 전기천공화(IUE)에 의해 마우스 피질에서 tAKARα 센서의 발현, 또는 아데노 관련 바이러스(AAV)의 입체주입. IUE^24,25 및 바이러스 성 입자^(26)의 입체 주입에 대한 수술을위한 우수한 프로토콜은 이전에 출판되었다. 우리가 사용하는 주요 매개 변수는 아래에 설명되어 있습니다. 앞으로, 두개골 창의 설치. 우수한 프로토콜은 이전에 두개골 창 수술^에대한 출판된 27,^28. 표준 프로토콜에서 수정된 몇 가지 단계가 설명되어 있습니다. 다섯째, 생체 내 2pFLIM에서 수행. 여섯째, 2pFLIM 이미지의 분석(도3 및 도4). 이 접근법은 다른 많은 머리 고정 행동 패러다임 및 뇌 영역에 쉽게 적용 되어야 합니다.

여기에 설명된 모든 방법은 오리건 보건 과학 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 의해 승인되었습니다.

1. 2pFLIM 현미경 설치

1. 제조업체 설명서에 따라 광자 타이밍 카운팅 모듈(PTCM, 재료표)을 설치하고 컴퓨터에 연결합니다(그림 1).
   참고: PTCM은 전형적으로 광증층 튜브(PMT)로부터 레이저 펄스 타이밍 및 광자 입력에 대한 "동기화" 입력을 수신하는 컴퓨터 보드이다. 또한 2광자 이미징 제어 소프트웨어에서 픽셀, 선 및 프레임에 대한 클럭 타이밍을 수신합니다. PTCM은 클럭 신호를 사용하여 개별 광자를 다른 픽셀과 프레임으로 분리합니다.
2. >200MHz 대역폭의 포토다이오드를 추가하여 레이저 타이밍을 측정합니다. 레이저 광의 작은 분획을 광이오디오드에 반사하도록 광경로에 표준 유리 커버슬립을배치하여 광경로에 수직으로 배치하였다(도 1). 포토다이오드 출력을 PTCM의 "동기화" 입력에 연결합니다.
   참고: 많은 현대 레이저는 또한 레이저 타이밍을 출력. 이러한 레이저의 경우 포토다이오드가 필요하지 않으며 레이저 타이밍 출력을 PTCM의 동기화 입력에 직접 연결할 수 있습니다.
3. 낮은 노이즈, 빠른 GaAsP PMT(그림 1)로, tAKARα의 경우, 녹색채널 PMT의 경우 PMT를 교환한다. PMT 출력을 PTCM의 신호 입력에 연결합니다.
   1. 선택적 신호 스플리터(도 1)를 추가하면 종래의 2광자 이미징 채널을 통해 강도를 동시에 획득하는 것이 요구된다. PMT 출력을 신호 스플리터에 연결하고 스플리터 출력을 PTCM 및 기존 2광자 이미징 모듈에 연결합니다.
      참고: GaAsP PMT는 기존의 비알칼리 PMT보다 더 빠른 단일 광자 신호를 제공하며 광자 타이밍을 보다 정밀하게 측정할 수 있습니다. GaAsP PMT의 특정 모델은 주변 온도보다 10-35°C 낮으로 냉각될 수 있으므로 다크 카운트를 초당 수백 개 이하의 수준으로 억제할 수 있습니다(일반적으로 ≤200 카운트/s). 이 낮은 노이즈 레벨은 노이즈 광자 수를 형광 수명 곡선에서 쉽게 구별하거나 빼을 수 없기 때문에 형광 수명을 정밀하게 측정하는 데 중요합니다.
4. 수용기 형광단의 스펙트럼 오염을 최소화하는 밴드 패스 형광 방출 필터를 추가합니다. 예를 들어, tAKARα의 경우, 녹색 채널에 대한 500 nm ±20 nm 장벽 필터는 수용자 sREACh로부터의 오염을 감소시키기 위해 사용되며, 이는 어두운(QY~0.07) 황색 형광 단백질(YFP)^29,30이다. 제어 소프트웨어에 적합하고 PTCM 사용자 설명서에 설명된 개별 이미지 픽셀, 선 및 프레임에 대한 시계와 같은 타이밍 신호를 연결합니다. 적절한 데이터 제어 및 수집 소프트웨어를 설치합니다.
   참고: 일부 PTCM제조업체(재료 표)는 2pFLIM 이미징을 위한 소프트웨어를 제공합니다. 여기, FLIMimage라는 사용자 정의 소프트웨어가 사용된다, 야스다 연구소에 의해 개발 된 (맥스 플랑크 플로리다, 개인 통신을 통해). 이 소프트웨어는 특정 2 광자 수집 소프트웨어(재료표)에 추가 사용자 기능으로 작동합니다. 2pFLIM 이미지를 획득하기 위해 2광자 이미징 중에 적절한 타이밍에 PTCM을 제어하고 통신합니다.

2. 전동 러닝 머신 의 건설

참고: 맞춤형 전동 러닝머신의 디자인은 그림2에 나와 있습니다.

1. 폼 롤러(Ø = 200mm)를 미세쇠톱으로 길이 150mm로 자른다. 또는 폼 볼의 두 반쪽을 함께 붙이고 이음새 위에 테이프를 놓습니다. 선택적으로 롤러에 프로파일이 있는 고무 매트를 접착제로 붙이면 롤러의 견인력이 높아지도록 합니다.
2. 롤러의 평평한 면에서 롤러의 중심을 통해 1/4 인치 직경의 구멍을 뚫거나 폼 볼을 사용하는 경우 공의 각 절반의 중간을 통해 1/4 인치 직경의 구멍을 뚫습니다.
3. 구멍을 통해 직경 1/4 인치 강철 차축을 설치합니다. 폼 호환 접착제를 사용하여 폼 롤러 / 볼을 액슬에 붙입니다. 선택적으로, 두 개의 유연한 샤프트 커플링(1/4 인치 내경)을 수정하여 액슬과 폼 롤러/볼의 결합을 강화합니다.
   참고: 많은 일반적인 접착제는 거품이 용해 될 수 있습니다.
   1. 각 샤프트 커플링의 경우 샤프트 커플링을 평평한 면과 직사각형 금속 판의 중앙(0.7mm x 15mm x 76mm)에 배치합니다. 샤프트 커플링에 플레이트를 용접합니다. 플레이트 중앙에 1/4 인치 구멍을 뚫어 변형된 샤프트 커플링을 액슬에 설치하고 두 개의 나사 구멍을 중앙에서 금속 판 측면으로 설치할 수 있습니다.
   2. 샤프트 커플링을 폼 롤러/볼에 대고 액슬에 설치합니다. 후자를 사용하는 경우, 공의 곡률에 맞게 플레이트를 약간 구부립니다. 나사를 측면 구멍에 배치하여 액슬의 롤러/공을 고정합니다.
4. 케이지 플레이트 중앙에 있는 3/8-32 나사산드릴을 드릴및 탭하고 로터리 인코더를 설치합니다. 나사 구멍을 직각 모터 브래킷의 베이스에 드릴링하여 모터를 포스트 홀더에 부착할 수 있도록 합니다. 유연한 샤프트 커플링을 사용하여 회전식 인코더와 모터를 액슬 끝에 부착합니다.
5. 모터 및 회전 인코더용 포스트를 사용하여 알루미늄 브레드 보드에조립된 러닝머신을 설치합니다(그림 2). 모터 입력을 속도 컨트롤러에 연결하고 회전 인코더 출력을 컴퓨터 데이터 수집(DAQ) 보드의 아날로그 입력에 연결합니다.
   참고: 회전 각도 속도는 회전 인코더에 의해 전압으로 인코딩되며 MATLAB에 작성된 AnimalTracker라는 사용자 지정 소프트웨어를 사용하여 디지털화됩니다.
6. 헤드플레이트 호환 홀더를 직각 브래킷에 설치합니다. 러닝머신 앞의 빵 판에 단단한 포스트를 설치하고 포스트에 직각 브래킷이 있는 조립헤드플레이트홀더를 설치합니다(그림 2). 헤드플레이트 홀더 바가 액슬과 정렬되어 마우스가 러닝머신에서 적절하고 편안한 보행 위치를 채택할수 있도록 합니다(그림 2C).

3. 마우스 피질에서 tAKARα 센서의 식

1. 자궁 전기 에서
   1. 플라스미드 DNA(3−4 μg/μL; CAG 프로모터, 센서 서열 및 우드척 간염 바이러스를 포함하는 센서 구성)에 빠른 녹색 염료(주입 시 시각화용)의 최종 농도를 0.2% 추가하여 IUE에 대한 DNA 솔루션을 준비합니다. 전사 후 반응 요소 [WPRE] 번역 증강) 용해/물 또는 트리스-EDTA에 희석.
   2. E16^24에서IUE를 위해 시간 적시 임산부 마우스(예: C57BL/6)를 준비합니다. 이소플루란으로 마우스를 마취 (유도 4%, 유지 보수 1.5%, O2 95% O2 5%CO2)를 바르고 5 mg/kg 멜록시캄 과 4 mg/kg 부피바카인을 함유한 피하 진통제를 발라주세요. 메스와 가위로 복강을 열고 자궁 뿔을 조심스럽게 노출시다.
   3. 앞서 설명한 바와 같이 한 반구의 측면 심실에서 배아 당 DNA 용액 1 μL을 주입한다^24.
   4. 피질에 양극 말단 발을 배치하고 전기 포더로 1Hz에서 5 개의 100 ms 정사각형 펄스 (38 V)를 사용하여 피질 뉴런에 대한 일반 IUE^24를 수행합니다.
      참고: 다른 피질 영역은 측면 심실을 기준으로 전극 말단 발의 배치를 변경하여 전기 천공을 대상으로 할 수 있습니다.
2. 스테레오택시 주입
   1. 생후 30일에 마우스를 준비하여 입체외과^{수술(26)한다.} 3.1.2.단계에서 설명한 대로 마우스를 마취시키고, 5 mg/kg 카프로펜을 함유하는 회음부 진통제의 피하 주사를 적용한다.
   2. AAV 혈청형 2/1(AAV2/1)을 경험적으로 결정된 역가(~1 x 10 9-10¹⁰ 게놈/μL)에 hSyn-tAKARα-WPRE를 표현하여 주사기 여과(0.2 μm 셀룰로오스 아세테이트 막) 인산완충세액수액을 하였다.
   3. 모터 피질에 대한 다음 좌표에서 스테레오 현미경에서 핸드 헬드 드릴을 사용하여 ~ 500 μm 직경의 구멍을 드릴 : 0.5 mm 전방 브레그마, 1.2 mm 측면 에서 중간선.
   4. 인젝터(예: 맞춤형 플런저/유리 파이펫 홀더가 있는 오일 유압 조작기)를 전동 조작기에 장착합니다. 브레그마-람다 평면을 기준으로 주사 바늘을 15° 각도로 놓습니다. 전방 후방 및 등쪽 복부 축을 따라 각각 700 μm 및 200 μm 진행에 해당하는 x-및 z-축을 가로질러 대각선 이동을 프로그래밍합니다.
      참고: 의도된 이미징 필드 바로 위에 있는 조직에 손상을 방지하기 위해, AAV 입자는 bregma-lambda 평면에 비해 비스듬히 주입된다.
   5. 주사 바늘의 끝을 드릴 구멍 중앙의 피아에 놓고 위에서 설명한 대각선 운동 (~25 μm / s)을 천천히 실행합니다. 이 절차는 사출의 중심을 1.2 mm 전방에서 bregma, 1.2 mm 측면에서 중간선, 0.2 mm 의 피아 아래에 배치합니다.
   6. 희석 된 바이러스 입자 20 nL (~10 nL / 분)을 주입하십시오. 적어도 10 분 기다렸다가 천천히 주사 바늘을 철회하십시오 (~12.5 μm / s).
   7. 스테레오택 주사 절차를 완료하고 접착제 / 피부^26.

4. 두개골 창 설치

1. IUE(섹션 3.1) 또는 바이러스 입자(섹션 3.2)의 입체주사를 통해 tAKARα를 발현하는 마우스상에 두개골 창을 30일에서 60일 사이에 배치한다. 바이러스 성 입자에 감염된 마우스의 경우 바이러스 주입 후 적어도 2 주 후에 두개골 창을 구현하십시오. 앞서 설명한 대로 cranial 창을 설치^27,28, 다음 세부 정보와 함께. 3.1.2.단계에서 설명한 대로 마우스를 마취시키고, 4 mg/kg에서 회음부 진통제 0.075 mg/kg 부프레넥스 및 항염증제 덱사메타손의 피하 주사를 적용한다.
2. 회막을 제거하고 목 근육을 철회하십시오. 수술 후 목 근육의 노출을 피하기 위해 조직 접착제로 두개골에 피부의 가장자리를 접착제.
3. 메스를 사용하여 부드럽게 긁어 두개골에서 골막을 건조하고 제거합니다. 이미징 헤드플레이트(내경 8mm)를 배치하여 의도한 이미징 필드를 둘러싸습니다. 치아 아크릴 시멘트 다음 시아노 아크릴레이트 기반 접착제를 사용하여 두개골에 헤드 플레이트를 접착제. 최적의 접착을 위해 헤드플레이트가 노출된 두개골과 말린 두개골위에 놓여 있는지 확인하십시오. 접착제 가속기는 경화를 가속화하는 데 사용할 수 있습니다.
4. 치과 용 드릴을 사용하여 의도 한 이미징 필드 (단계 3.2.3에 지정된 좌표)보다 직경이 5mm의 원을 그리고 경막 미를 노출시다.
5. 전체 두개골 창을 커버하는 듀라 표면에 인공 경도라고도 하는 투명 폴리머의 얇은 층을 적용합니다. 중합체는 경막 미더를 보호하고 안정화합니다. 멸균 원형 커버슬립(직경 5mm)을 경구 에 놓습니다. 치아 아크릴 시멘트 다음 창의 가장자리 주위에 적용 시아노 아크릴레이트 접착제로 커버 슬립을 고정합니다.

5. 생체 내 2 광자 형광 평생 화상 진찰 현미경 검사법

1. 두개골 창의 설치 후 2주 이상에서 2pFLIM 이미징을 시작합니다(섹션 4). 마우스를 습관화하기 위한 이미징 연구가 시작되기 전에 마우스를 자주 취급하고 스크러핑하여 스트레스로 인한 실험 간섭을 최소화합니다.
2. 2광자 레이저를 제어하는 소프트웨어를 사용하여 2광자 여기 레이저 파장을 960nm로 설정합니다.
3. 4% 이소플루란을 사용하여 마우스를 마취시다. 꼬리 꼬집기와 호흡 속도를 관찰하여 적절한 마취를 확인합니다. 즉, 꼬리 꼬집기에 대한 반응이 없어야하며 호흡 속도는 초당 ~ 1 호흡으로 감소되어야합니다. 불필요한 절차 시간을 최소화하고 마취가 2 ~ 3 분 동안만 지속되기 때문에 눈 윤활유는 사용되지 않습니다.
4. 마취된 마우스를 전동 러닝머신(도2C)으로옮기고 마우스의 헤드플레이트를 러닝머신 셋업의 헤드플레이트 홀더에 장착합니다(자세한 내용은 도 2 참조). 70% 에탄올로 마우스의 두개골 창 커버슬립 표면을 청소합니다.
5. 전동 러닝머신을 장착된 마우스를 2pFLIM 목표 아래에 놓습니다. 두개골 창 덮개 슬립과 목표 사이에 증류수 한 방울을 바칩니다.
6. 장착된 마우스가 마취에서 깨어나서 러닝머신과 현미경 환경에 적어도 10분 동안 익숙해지게 하십시오.
7. 에피 조명 아래의 사출 위치로 이동합니다. 후속 이미징 세션 동안 동일한 관심 영역(ROI)의 이미징을 돕기 위해 밝은 시야 아래에 있는 피덕셜 기능(즉, 혈관)을 문서화합니다.
8. 뇌 조직에서 방출된 빛 이외의 들어오는 빛을 제거합니다. 에피 조명 광원을 끄고 2pFLIM 장비의 인클로저를 닫습니다. 하드웨어 명령 전압 제어를 켜서 2pFLIM PMT를 활성화합니다.
9. 깨어있는 마우스에서 tAKARα 양성 소마타를 이미징하기 위한 다음 권장 설정을 사용하여 2pFLIM 획득 소프트웨어 FLIMimage를 사용하여 z-stack 2pFLIM 이미지를 획득한다. 프레임 평균을 3프레임으로 설정하고, 스캔 속도를 2ms/line으로, 이미지 크기를 128 x 128픽셀로, 시야를 90-100μm로 설정합니다. 준비 및 하드웨어 구성에 따라 이미징 설정을 조정합니다.
10. FLIMview에서 획득한 이미지를 검사합니다(사내에서 개발된 사용자 지정 소프트웨어; 섹션 6 참조). 5.9단계 에 이어 이미징 설정을 조정하여 광자 수를 최적화하고 광표백을 최소화합니다.
    참고: 생체 내에서 tAKARα 양성 소종의 일생 이미징을 위한 ROI에서 실행 가능한 통합 광자 수는 특정 자극으로부터 발생하는 신호 진폭에 따라 ~1,000-10,000 광자입니다(토론 참조).
    1. 필요한 경우 시야 감소, 스캐닝 속도 감소, 레이저 전력 증가, 평균 프레임 수 증가를 사용하여 통합 된 광자 수를 늘리고 수명 추정 오차를 줄입니다. 동시에 최소한의 필수 레이저 파워, 프레임 평균화 및 스캐닝 속도를 사용하여 광표백을 최소화해야 합니다.
11. 5.10단계에서 결정된 설정을 사용하여 z-스택 획득을 반복함으로써 일정한 시간 간격(예를 들어, 30~60초마다)으로 이미지화한다. 러닝머신 제로 속도로 최소 15분 동안 베이스라인 2pFLIM 이미지를 획득합니다.
12. 러닝머신 회전 속도를 2pFLIM 이미지를 획득하는 동안 15분 동안 ~15cm/s로 설정합니다. 러닝머신 회전을 끄고 20분 동안 영상을 계속하여 강제 운동을 중단한 후 PKA 활성 의 지속 시간을 평가합니다.

6. 2pFLIM 이미지 분석

1. FLIMview에서 획득한 이미지를 열고 FLIMview에서 다음 매개 변수를 설정합니다.
   참고: 매개 변수 세부 정보는 설명에 설명되어 있습니다.
   1. FLIMview에서 단일 광자 계수(SPC) 최소 및 최대 범위 필드를 클릭합니다. 일반적으로 각각 1.2-2와 10−12 ns 사이의 적절한 최소 및 최대 SPC 범위 값을 입력합니다.
   2. FLIMview에서 t₀ 값 필드를 클릭하고 t₀ 값(일반적으로 ~2ns)을 입력합니다. FLIMview에서 수명 휘도 최소 임계값 필드를 클릭하고 원하는 임계값을 5-30 광자로 입력합니다.
2. 새 그룹 단추(N)를 클릭하고 실험 그룹 이름을 할당합니다. 이렇게 하면 추가된 각 FLIM 이미지의 데이터를 결합하는 그룹이 생성됩니다.
3. FLIMview의 Roi 컨트롤 모듈에서 ROI 버튼을 클릭하고 tAKARα 양성 소마 주위에 ROI를 그립니다. FLIMview의 z 스택 제어 슬라이더에서 하부 및 상부 z 한계를 이동하여 z 스택 범위를 줄이면 다른 z 깊이의 배경 광자에서 발생하는 신호 오염을 최소화할 수 있습니다.
4. + 버튼을 클릭하여 FLIM 이미지를 그룹에 추가합니다(6.2단계). Calc 버튼을 클릭하여 ROI 및 수명 추정 오차(δδ)에 대한 평균 수명(LT, 평균 광자 방출 시간[MPET]이라고도 함)을 계산합니다.
5. 만성 2pFLIM 이미징 시리즈에서 다음 파일을 엽니다. 6.4단계를 반복합니다. 시간이 지남에 따라 조직이 표류할 수 있기 때문에 ROI 및 z-stack 범위의 위치를 조정하여 시간이 지남에 따라 동일한 tAKARα 양성 소종을 측정해야 합니다.
6. 그룹 컨트롤 모듈의 드롭다운 메뉴에서 deltaMPET/MPET_0을 선택합니다. 기준선# 필드를 클릭하고 인덱스(들)를 입력합니다(예: 6.3단계에서 만든 그룹의 처음 5개 이미지에 대해 1 2 3 4 5)를 입력합니다. 이렇게 하면 기준 수명(LT 0)을계산하는 데 사용되는 이미지가 정의됩니다.
7. 플롯을 클릭하여 정의된 ROI에서 실험 중에 tAKARα의 FLIM 응답(ΔLT/LT 0)을 포함하는 그래프를 생성합니다. 해당 기준 선회 수명(LT 0)에 의한 개별ROI의 정규화된 변경(ΔLT)을 통해 다른 ROI에서 운동 중 PKA 활동을 비교할 수 있습니다.

FRET-FLIM 센서는 신경 변조에 관여하는 cAMP/PKA 경로를 포함하여 다양한 신호 전달 경로를 시각화할 수 있습니다. 현재 프로토콜은 2pFLIM과 함께 최근에 개발된 tAKARα 센서를 사용하여 머리 고정 된 행동 마우스에서 PKA 활동을 시각화합니다. 대부분의 기존 2광자 현미경은 그림 1에 나와 있는 것처럼 3~4개의 구성 요소를 추가하여 2pFLIM 기능으로 업그레이드할 수 있습니다(섹션 1 참조). 2pFLIM 획득 이미지에서 FRET를 시각화하기 위해 픽셀당 수집된 광자 타이밍의 히스토그램 플롯에서 평균 수명의 정량화를 수행하였다(도3A,B). 평균 수명은 PKA 활성화가 수명의 감소로 이어지기 때문에 높은(차가운 색상) 및 낮음(따뜻한 색상)이 각각 낮고 높은 PKA 활동을 나타내는 의사 색 이미지를 사용하여 시각화되었습니다. SPC 범위를 올바르게 설정하려면 주의를 기울여야 합니다. 이 범위는 하드웨어 에지 아티팩트를 최소화한 레이저 펄스 간격(예: 80MHz의 펄스 속도 12.5ns) 내에서 설정해야 합니다(섹션 6 및 토론 참조). ROI 내에서PKA 활동의 계산은 주어진 ROI 내에서 모든 픽셀의 LT를 결합하여 수행하였다(도3C,D). 헤드 고정 된 깨어 마우스기저 수명 1.3 및 1.8 ns (그림3E). 헤드 고정 된 깨어 있는 마우스에서 모터 피질에서 tAKARα의 이미징은 기저 및 강제 운동 동안 세포 분해능으로PKA 활성의 실시간 정량화를 허용하였다(도 4). 실험은 며칠 및 몇 달에 걸쳐 반복될 수 있습니다. 강제 운동은 마우스 모터 피질17의표면 층 내의 뉴런의 집단에서 PKA 활동을 트리거합니다. 이러한 PKA 활성은 β-아드레날린 및 D1 수용체(17)의 활성화를통한 신경 변조에 의존한다.

그림 1: 2pFLIM 시스템의 개략적. 2pFLIM은 노란색 강조 하드웨어 구성 요소를 추가하여 기존의 2 광자 현미경에 구현 될 수있다 : 광자 타이밍 카운팅 모듈, 저잡음 빠른 광 증식 튜브 (PMT), 포토 다이오드 (레이저가없는 경우에만 필요) 레이저 타이밍을 위한 출력 신호) 및 선택적 신호 스플리터. 이 그림은 Ma et al.17에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 맞춤형 전동 러닝머신 설계. (A) 앞면(왼쪽 위), 측면(오른쪽 상단), 상단 뷰(왼쪽 아래)에서 러닝머신 디자인의 회로도가 있습니다. 러닝머신(폼 볼) 차축은 회전식 인코더와 모터에 연결되어 있으며, 이 모터는 견고한 알루미늄 빵 플레이트의 두 기둥에 집합적으로 장착됩니다. 직각 브래킷의 헤드플레이트 호환 홀더는 견고한 포스트에 고정되어 러닝머신 위에 배치됩니다. 회로도 도면은 배율을 조정하지 않습니다. 전면(B) 및 측면 (C) 러닝 머신의 사진을 볼 수 있습니다. 러닝머신에서 마우스의 적절한 위치는 패널 C에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 2pFLIM 데이터의 정량화. (A) 각 픽셀의 의사 색이 있는 FLIM 이미지는 해당 픽셀의 모든 광자의 평균 수명(LT)을 기준으로 레이저 타이밍을 기준으로 나타냅니다. (B) 단일 픽셀 내의 광자 도착 시간(패널 A의보라색 사각형)을 히스토그램(왼쪽 패널)으로 플롯하였다. 단일 광자 계수 범위(SPC, 회색)를 결정하기 위해 통합 경계를 설정하였다. SPC 범위 내에서 광자 타이밍의 적분은 총 광자 수로 나눈 다음 t 0(1.65ns, 파선)으로 차감하여 평균 수명(LT, 파선선과 점선 사이의 거리)이 1.74ns입니다. 전체 시야의 평균 수명(패널 A의 연한 파란색 사각형)의 평균 수명을 정량화하는 것은 모든 픽셀(오른쪽 패널)에서 수집된 광자 타이밍의 통합을 포함하여 평균 수명을 1.7ns로 생성합니다. 인세트는 반 로그 배율에서 동일한 데이터를 표시합니다. (C와 D) 관심 지역당 평균 수명(ROI) 정량화 (C) 2pFLIM 이미지의 대표적인 예. 2개의 ROI는 모터 피질의 층 2/3에 있는 2개의 somata 의 주위에 그려졌습니다. (D) 각 ROI 내의 모든 픽셀에 통합된 광자 타이밍 분포(왼쪽 패널). 셀 ROI는 색으로 코딩(패널 C에도시된 바와 같이) 적색, 셀 1; 파란색, 셀 2. 정규화된 광자 카운트는 두 ROI(오른쪽 패널, 평균 수명, 셀 1, 셀 1.33 ns, 셀 2, 1.73 ns) 간의 광자 타이밍 분포를 비교할 수 있습니다. 인세트는 반 로그 배율에서 동일한 데이터를 표시합니다. (e) 모터 피질의 표면 층에서 254 개의 이미지 된 세포로부터의 평균 기초 수명의 분포 플롯. L1 세포 (n = 186 세포 / 11 동물, 왼쪽 패널), 피아 아래 100 μm 이내 거주, AAV2 / 1-hSyn-tAKARα-WPRE의 입체 주입 후 tAKARα를 발현, L2 / 3 피라미드 세포 (n = 68 세포 / 4 동물, 오른쪽 패널), 적어도 150 μm 아래 거주 CAG-tAKARα-WPRE DNA 구조의 IUE 후 tAKARα를 발현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 4: tAKARα는 운동 피질에서 운동 유도 PKA 활동을 추적한다. (A) 대표적인 강도(왼쪽 패널) 및 모터 피질에서 3개의 L1 세포의 수명(중간 및 우측 패널) 이미지. 셀 ROI는 색상으로 코딩되었다: 오렌지, 셀 1; 파란색, 셀 2; 노란색, 셀 3. (B) 기저 상태 동안 셀 1(상부 패널)에서 측정된 광자 타이밍 분포(중간 패널 Α에서측정된 주황색 트레이스) 및 강제 운동(오른쪽 패널 A에서측정된 바와 같이 연한 주황색 트레이스). 정규화된 광자 개수는 광자 타이밍 분포를 직접 비교할 수 있습니다(하부 패널, 평균 수명: 기저, 1.72 ns, 운동, 1.42 ns). 인세트는 반 로그 배율에서 동일한 데이터를 표시합니다. (C) Δ수명/수명0(ΔLT/LT 0)해당 셀의 트레이스(위쪽 패널, 패널 A참조)와 강제 운동 속도(하부 패널). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 공개 할 것이 없다.