절차는 머리 고정, 행동 마우스에서 단백질 키나제 A 활동을 시각화하기 위해 제시된다. 향상된 A-키나아제 활동 리포터, tAKARα는 피질 뉴런으로 표현되고 두개골 창을 통해 이미징에 접근할 수 있게 된다. 2 광자 형광 일생 화상 진찰 현미경 검사법은 강제운동 도중 생체 내 PKA 활동을 구상하기 위하여 이용됩니다.
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방법 논문
생체 내 2 광자 형광 평생 이미징 현미경 을 사용하여 머리 고정 행동 마우스에서 단백질 키나제 활동을 시각화
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
신경 변조는 뇌 기능에 대한 강력한 제어를 발휘합니다. 신경 조절 시스템의 기능 장애는 신경 및 정신 장애에 결과. 그들의 중요성에도 불구 하 고, 세포 해상도 신경 변조 이벤트를 추적 하기 위한 기술은 등장 하기 시작. 도파민, 노르에피네프린, 아세틸콜린 및 세로토닌과 같은 신경 조절제는 각각의 G 단백질 결합 수용체를 통해 세포내 신호 전달 이벤트를 트리거하여 신경 흥분성, 시냅스 통신 및 기타 뉴런을 조절합니다. 신경 네트워크에서 정보 처리를 조절할 수 있습니다. 위에서 언급 한 신경 조절제는 cAMP / 단백질 키나아제 A (PKA) 통로에 수렴합니다. 따라서, 단일 세포 해상도를 가진 생체 내 PKA 이미징은 신경 전기 활동을 위한 칼슘 이미징과 유사한 방식으로 신경 조절 이벤트에 대한 판독으로 개발되었다. 본 명세서에서, 헤드 고정 행동 마우스의 피질에서 개별 뉴런의 수준에서 PKA 활성을 시각화하는 방법이 제시된다. 이를 위해, 개선 된 A-키나아제 활동 리포터 (AKAR), 라는 tAKARα, Förster 공명 에너지 전송 (FRET)를 기반으로 사용 됩니다. 이 유전자 부호화 된 PKA 센서는 DNA 플라스미드의 자궁 전기 천공 (IUE) 또는 아데노 관련 바이러스 (AAV)의 입체 적 주입을 통해 모터 피질에 도입됩니다. FRET 변화는 광산성 뇌 조직에서 FRET 신호를 정량화하기 위한 비율 메트릭 FRET 측정에 비해 이점을 제공하는 2광자 형광 평생 이미징 현미경(2pFLIM)을 사용하여 이미지화됩니다. 강제 운동 중 PKA 활동을 연구하기 위해 tAKARα는 속도 제어 전동 러닝 머신에서 실행하거나 쉬는 깨어있는 머리 고정 마우스의 피질 위의 만성 두개골 창을 통해 이미지화됩니다. 이 화상 진찰 접근은 생체 내 화상 진찰을 위한 그밖 FLIM 기지를 둔 센서에 대응하는 행동 유도한 PKA 활동을 공부하기 위하여 많은 그밖 두뇌 지구에 적용될 것입니다.
서론
또한 느린 시냅스 전송으로 알려진 신경 변조는 스트레스, 각성, 주의 및 운동과 같은 다른 행동 상태동안 뇌 기능에 대한 강력한 제어를 부과 1,2,3, 4. 그 중요성에도 불구하고, 신경 조절 이벤트가 일어나는 시기와 장소에 대한 연구는 아직 초기 단계에 있습니다. 아세틸콜린, 도파민, 노르아드레날린, 세로토닌 및 많은 뉴로펩타이드를 포함한 신경 조절제는 G 단백질 결합 수용체(GPCRs)를 활성화하여 광범위한 기간의 확장창을 통해 세포내 두 번째 메신저 경로를 트리거합니다. 초에서 시간까지. 각 신경 조절기는 신호 이벤트의 뚜렷한 세트를 트리거하는 동안, cAMP /단백질 키나제 A (PKA) 통로는많은 신경 조절제 1,5에대한 일반적인 다운스트림 통로입니다. cAMP/PKA 통로는 신경 흥분성, 시냅스 전송 및 가소성 6,7,
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프로토콜
여기에 설명된 모든 방법은 오리건 보건 과학 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. 2pFLIM 현미경 설치
- 제조업체 설명서에 따라 광자 타이밍 카운팅 모듈(PTCM, 재료표)을 설치하고 컴퓨터에 연결합니다(그림 1).
참고: PTCM은 전형적으로 광증층 튜브(PMT)로부터 레이저 펄스 타이밍 및 광자 입력에 대한 "동기화" 입력을 수신하는 컴퓨터 보드이다. 또한 2광자 이미징 제어 소프트웨어에서 픽셀, 선 및 프레임에 대한 클럭 타이밍을 수신합니다. PTCM은 클럭 신호를 사용하여 개별 광자를 다른 픽셀과 프레임으로 분리합니다. - >200MHz 대역폭의 포토다이오드를 추가하여 레이저 타이밍을 측정합니다. 레이저 광의 작은 분획을 광이오디오드에 반사하도록 광경로에 표준 유리 커버슬립을배치하여 광경로에 수직으로 배치하였다(도 1). 포토다이오드 출력을 PTCM의 "동기화" 입력에 연결합니다.
참고: 많은 현대 레이저는 또한 레이저 타이밍을 출력. 이러한 레이저의 경....
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결과
FRET-FLIM 센서는 신경 변조에 관여하는 cAMP/PKA 경로를 포함하여 다양한 신호 전달 경로를 시각화할 수 있습니다. 현재 프로토콜은 2pFLIM과 함께 최근에 개발된 tAKARα 센서를 사용하여 머리 고정 된 행동 마우스에서 PKA 활동을 시각화합니다. 대부분의 기존 2광자 현미경은 그림 1에 나와 있는 것처럼 3~4개의 구성 요소를 추가하여 2pFLIM 기능으로 업그레이드할 수 있습니다(섹션 1 참조). 2pFLIM 획득 이미지에서 FRET를 시각화하기 위해 픽셀당 수집된 광자 타이밍의 히스토그램 플롯에서 평균 수명의 정량화를 수행하였다(도3A,B). 평균 수명은 PKA 활성화가 수명의 감소로 이어지기 때문에 높은(차가운 색상) 및 낮음(따뜻한 색상)이 각각 낮고 높은 PKA 활동을 나타내는 의사 색 이미지를 사용하여 시각.......
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토론
이 프로토콜은 FRET-FLIM 센서 tAKARα를 사용하여 머리 고정 된 행동 마우스에서 신경 변조 트리거 PKA 활성을 시각화하는 것을 보여줍니다. 본 출원은 얻어진 FLIM 신호가 생리학적 신경조절 이벤트(17)와 관련이 있음을 입증하기 위해 시험관내 및생체내 tAKARα의 광범위한 시험 및 특성화에 기초한다. 여기서, 하나의 생체 내 응용 프로그램, 운동 유도 PKA 활성 모터 피질에서, 뇌에 센서를 전달하기위한 절차를 설명하기 위해 사용, 이미징을위한 동물 수술, 행동 및 이미징 데이터 수집을위한 하드웨어 및 소프트웨어 요구 사항 및 데이터 분석을 이미징하기 위한 소프트웨어 및 알고리즘을 제공합니다.
tAKARα 센서는 Dna 플라스미드 또는 AAV 입자의 입체 주사의 IUE에 의해 피질에 도입된다. 전기 화 파라미터 및 DNA 농도에 따라, IUE는 피질25에서상대적으로 넓은 영역에 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
테스 J. 라마이어, 루스 프랭크, 마이클 A. 무니악 박사와 맥스 플랑크 플로리다의 야스다 료헤이 박사에게 2pFLIM 인수 소프트웨어에 감사드립니다. 이 작품은 두 개의 브레인 이니셔티브 어워드 U01NS094247 (H.Z. 및 T.M.) 및 R01NS104944 (H.Z. 및 T.M.), R01 교부금 R01NS081071 (T.M.), R21 교부금 R21NS097856 (H.Z)에 의해 지원되었습니다. 모든 상은 미국 국립 신경 장애 및 뇌졸중 연구소에서.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.2 &무; m 셀룰로오스 아세테이트 주사기 필터 | Nalgene | 190-2520 | 단계 3.2.2. |
| 16x 0.8 NA 침수 대물렌즈 | 니콘 | MRP07220 | 5.5단계. |
| 3핀 케이블 | US 디지털 | CA-MIC3-SH-NC | 단계 2.5. 회전 센서를 현미경 |
| 알루미늄 브레드 보드 | Thorlabs | MB1012 | 2.5단계. |
| AnimalTracker MATLAB 소프트웨어 | 해당 | 사항 없음 | 2.5단계 및 섹션 5 - 6. 요청 시 주 저자인 |
| 대역 통과 장벽 필터 | Chroma | ET500-40m | Step 1.4 |
| 케이지 플레이트 | Thorlabs | CP01 | 단계 2.4. 회전 센서의 마운트로 사용 |
| 마이크로 드릴용 탄소강 버, 0.5mm 팁 직경 | FST | 19007-05 | 단계 3.2.3. 및 4.4. |
| 원형 커버슬립(직경 5mm) | VWR | 101413-528 | 단계 4.5. |
| 맞춤형 주사 바늘 홀더 | N/A | N/A | 단계 3.2.4. 기술 세부 정보는 주 저자 요청 시 제공: |
| Dental acrylic | Yates, Motloid | 44114 | 단계 4.3. 및 4.5. |
| 치과 드릴; Microtorque ii | Ram 제품 | 66699 | 단계 3.2.3. 및 4.4. |
| Dowsil 투명 폴리머 | The Dow Chemical Company | 3-4680 | 단계 4.5. 인공적인 dura |
| Electroporation 전극 | Bex | 단계 | 3.1.4 LF650P5. |
| Electroporator | Bex | CUY21 | 단계 3.1.4. |
| 빠른 녹색 FCF | 시그마-알드리치 | F7258-25G | 단계 3.1.1. |
| FLIMimage MATLAB 소프트웨어 | 해당 사항 없음 | 섹션 5. 친절하게 제공: Ryohei Yasuda, Max Planck Florida | |
| FLIMview MATLAB 소프트웨어 | N/A | N/A | 섹션 5. 및 6. 주 저자 인 |
| Foam-compatible glue (Gorilla White Glue) | Gorilla | 5201204 | Step 2.3에 |
| 헤드플레이트 | N/A | 해당 없음 | 단계 4.3. 기술 세부 정보 요청 시 주 저자 |
| 헤드플레이트 홀더 | 제공 N/A | 해당 없음 | 2.6단계. 기술 세부 정보 요청 시 제공, 마운팅 포스트 브래킷 및 직각 브래킷과 함께 사용 |
| 유압 미세 조작기 | Narishige | MO-10 | 단계 3.2.4. |
| 크레이지 접착제 | 크레이지 접착제 | KG82648R | 단계 4.3. 시아노아크릴레이트 기반 접착제 |
| 저소음 고속 광전자 증배관 | Hamamatsu | H7422PA-40 또는 H10769PA-40 | 단계 1.3. |
| MATLAB 2012b | Mathworks | N/A | 단계 2.6, 섹션 5 및 6. 현미경 수집 및 데이터 분석 소프트웨어 |
| Motor | Zhengke | ZGA37RG | 2.4단계를 |
| 모터 속도 컨트롤러 | Elenker | EK-G00015A1-1 | 단계 2.5. |
| 전동 마이크로 매니퓰레이터 | 셔터 | MP-285 | 단계 3.2.4. |
| 마운팅 베이스 | Thorlabs | BA1S | 단계 2.5. PH4 및 TR2 |
| 마운팅 포스트 | Thorlabs | P14 | 단계 2.6과 함께 모터 및 센서용 포스트에 사용됩니다. PB2 |
| 마운팅 포스트 베이스 | Thorlabs | PB2 | Step 2.6과 함께 헤드플레이트 홀더 포스트에 사용됩니다. P14 |
| 마운팅 포스트 브래킷 | Thorlabs | C1515 | 단계 2.6과 함께 헤드 플레이트 홀더 포스트에 사용됩니다. 직각 브래킷 및 헤드플레이트 홀더와 함께 사용 |
| 광학 포스트 | Thorlabs | TR2 | 단계 2.5. BA1S 및 PH4 |
| 인산염 완충 식염수 | Ν/&Alpha | ν/&알파; | 단계 3.2.2. 프로토콜: Cold Spring Harbor Protocols 2006, doi: 10.1101/pbd.rec8247 |
| 포토다이오드 | Thorlabs | FDS010 | 단계 1.2. |
| 광자 타이밍 카운팅 모듈 | Becker 및 Hickl | SPC-150 | 단계 1.1. |
| 플라스미드 : tAKAR α (CAG-tAKAR&알파;-WPRE) | Addgene | 119913 | 단계 3.1.3. |
| 포스트 홀더 | Thorlabs | PH4 | 단계 2.5. BA1S 및 TR2 |
| 직각 브래킷 | Thorlabs | AB90 | 단계 2.6 마운팅 포스트 브래킷 및 헤드 플레이트 홀더와 함께 사용 |
| 회전 인코더 | US 디지털 | MA3-A10-250-N | 단계 2.4. |
| 고무 매트 | Rubber-Cal | B01DCR5LUG | 단계 2.1. |
| 샤프트 커플링(1/4인치 x 1/4인치) | McMaster | 6208K433 | 단계 2.3. 및 2.4. |
| ScanImage 3.6 | Svoboda Lab/Vidrio Technology | N/A | 단계 5.9. 및 6.1. |
| 신호 분배 | Becker와 Hickl | HPM-CON-02 | 단계 1.3.1. |
| 스테인레스 스틸 액슬 (직경 1/4 인치, L = 12 인치) | McMaster | 1327K66 | 단계 2.3. |
| 입체 택시 정렬 시스템 | David kopf | 1900 | 단계 3.2. 및 4.1. 수정됨; Sutter micromanipulator, 맞춤형 주입 바늘 홀더, 유압 micromanipulator |
| 이광자 현미경 | N/A | N/A | 섹션 5. HHMI Janelia Research Campus(https://www.janelia.org/open-science/mimms)의 모듈식 생체 내 다광자 현미경 시스템(MIMMS)을 기반으로 구축Vetbond |
| 조직 접착제 | 3M | 14006 | 단계 3.2.6. |
| 바이러스: tAKARα (AAV2/1 hSyn-tAKARα-WPRE) | Addgene | 119921 | 단계 3.2.2. |
| 백색 PE 거품 롤러 (8 인치 x 12 인치) | 제작 기업 INC. | 30-2261 | 단계 2.1.1. |
| 백색 폴리스티렌 fom 공 반쪽 | GrahamSweet | 200mm 직경 2 중공 반쪽 | 단계 2.1.1. |
| Zipkicker | PACER | PT29 | 단계 4.3. 경화 촉진제 |
참고문헌
- Greengard, P. The Neurobiology of Slow Synaptic Transmission. Science. 294 (5544), 1024-1030 (2001).
- Petersen, S. E., Posner, M. I. The attention system of the human brain: 20 years after. Annual Review of Neuroscience. 35 (2), 73-89 (2012).
- Sun, Y., Hunt, S., Sa....
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