이 방법은 복잡한 숙주 공급원에서 세균막, 특히 황색포도상구균에외인성 지방산의 통합을 연구하기위한 프레임 워크를 제공합니다. 이를 달성하기 위해, 닭 계란 노른자및 질량 분석법을 활용하는 세균성 인지질의 후속 지방산 프로파일링에서 지단백질 입자의 농축을위한 프로토콜이 설명된다.
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이 논문에서
요약
초록
황색포도상구균 및 그밖 그람 양성 병원체는 막 인지질로 환경에서 지방산을 통합합니다. 감염 도중, 외인성 지방산의 대다수는 호스트 지단백질 입자 내의 존재합니다. 불확실성은 숙주 지방산의 저장소와 박테리아가 지단백질 입자에서 지방산을 추출하는 메커니즘에 관해서는 남아 있습니다. 이 작품에서는 닭 달걀 노른자에서 저밀도 지단백 (LDL) 입자를 농축하고 LDL이 S. 아우레우스의지방산 저장소역할을 하는지 여부를 결정하는 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 편견없는 지질 분석과 닭 LDL을 악용, LDL과 박테리아 사이의 상호 작용의 탐구를위한 효과적이고 경제적 인 모델. LDLs에서 외인성 지방산의 S. 아우레우스 통합의 분석은 박테리아의 지방산 조성의 특성화를 가능하게 하는 고분해능/정확한 질량 분광법 및 탠덤 질량 분광법을 사용하여 수행됩니다. LLDLs에 노출시 세균막 지질에서 발생하는 지방산의 새로운 조합의 막과 편견 없는 식별. 이러한 고급 질량 분석 기술은 인지질에 통합된 특정 외인성 지방산을 밝혀지방산 혼입의 비교할 수 없는 관점을 제공합니다. 여기에 설명 된 방법은 다른 세균성 병원체 와 복잡한 지방산의 대체 소스의 연구에 적응할 수 있습니다.
서론
메티실린 내성 S. 아우레우스(MRSA)는 헬스케어 관련 감염의 주요 원인이며 관련 항생제내성은 상당한 임상적 과제1,2,3이다. 따라서 새로운 치료 전략의 개발이 높은 우선 순위입니다. 그람 양성 병원체에 대한 유망한 치료 전략은 지방산 합성을 억제하는 것입니다, 막 인지질 생산을위한 요구 사항, S. 아우레우스에서,인산 을 포함 (PG),리실 -PG, 및 심장 리핀 4. 박테리아에서, 지방산 생산은 진핵 대응과 상당히 다른지방산 합성 II 통로 (FASII) 5를 통해 발생하며, FASII를 항생제 개발을위한 매력적인 표적으로 만들기5,6 . FASII 억제제는 주로 지방산 탄소 사슬 신장에 필요한 효소인 FabI를 표적으로7. 이 파비 억제제 트리클로산은 소비재 및의료기기 8,
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프로토콜
참고 : 닭 계란 노른자에서 LDL 입자의 농축을위한 다음 프로토콜은 무사 등에서 파생됩니다.
1. LDL 입자의 농축을위한 닭 계란 노른자 준비
- 70% 에탄올 용액으로 껍질을 세척하여 두 개의 큰 닭고기 계란을 소독하고 공기 건조를 허용합니다.
- 70% 에탄올 용액을 사용하여 계란 분리기를 소독하고 공기 건조를 허용합니다. 중간 크기의 비커의 입술에 계란 분리기를 부착합니다.
- 각 달걀을 개별적으로 계란 분리기로 부수고 알부민이 비커로 흘러 들어오도록 합니다. 그대로 달걀 노른자는 분리기에 의해 유지됩니다.
- 달걀 노른자를 30 mL의 멸균 인산완충식염수(PBS)로 두 번 세척하여 잔류 알부민을 제거합니다.
- 달걀 노른자를 필터 용지에 부드럽게 놓습니다.
- 멸균 피펫 팁으로 비텔린 멤브레인을 뚫고 멤브레인의 내용물을 멸균 된 50 mL 원추형 원심 분리관으로 배출하십시오. 멤브레인과 여과지를 버리십시오.
2. 닭 계란 노른자에서 LDL 함유 플라즈마의 분획
- 약 2부부0.17M NaCl을 pH 7.0에 달걀 노른자에 넣고 힘차....
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결과
닭 계란 노른자에서 LDL의 농축을위한 프로토콜은 그림1에 도시되어 있습니다. 이 과정은 전체 달걀 노른자를 식염수로 희석시키고 LDL을 함유하는 수용성 또는 혈장 분획으로부터 과립으로 지칭되는 달걀 노른자 고형물을 분리하는 것으로 시작된다(도1)33. 혈장 분획의 LDL 함량은 ~ 30-40 kDa β-livetins의 침전에의해 더욱 농축된다 (도 2)33. 140, 80, 65, 60 및 15 kDa에서 단백질 밴드의 존재는 LDL의아포단백질과 상관관계가 있다 (도 2)33,3.......
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토론
S. 아우레우스는 외인성 지방산을 막 인지질27,32,43에통합합니다. 외인성 지방산을 이용한 인지질 합성은 FASII 억제를 우회하지만 또한 막27,32,44의생물물리학적 특성을 변화시킵니다. 그람 양성 병원균의 인지질에 외인성 지방산을 혼입시키는 것은 잘 문서화되어 있지만, 3가지 주요 포도상 구균 인지질 유형각각에 대한 호스트 지방산 저장소의 정체성과 구조적 변이에 대한 간격은 남아 있습니다. 외인성 지방산 혼입으로 인한 결과입니다. 여기에서, 우리는 고용될 수 있는 프로토콜을 기술합니다: i) 닭 계란 노른자, 지방산의 근원에서 LDL 입자를 풍부하게 하고, ii) S.......
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공개 사항
저자는 아무런 공개가 없습니다.
감사의 글
우리는 원고와이 작품의 지원에 대한 비판적 평가에 대한 해머 연구소의 회원들에게 감사드립니다. 콜로라도 의과 대학의 알렉스 호스윌 박사는 친절하게 AH1263을 제공했습니다. 미시간 주립 대학의 크리스 워터스 박사는 시약을 제공했습니다. 이 작품은 미국 심장 협회 보조금 16SDG30170026 및 미시간 주립 대학에 의해 제공 된 창업 기금에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 황산 암모늄 | 피셔 | BP212R-1 | ≥ 99.5% 순수 |
| 세포 배양 인큐베이터 | Thermo | MaxQ 6000 | |
| Centrafuge | Thermo | 75-217-420 | Sorvall Legen XTR, 로터 F14-6x250 LE |
| Costar 분석 플레이트 | Corning | 3788 | 96 웰 |
| 여과지 | Schleicher & Schuell | 597 | |
| Large chicken egg | N/A | N/A | Common store bought egg |
| Microplate spectrophotometer | BioTek | Epoch 2 | |
| NaCl | Sigma | S9625 | |
| S. aureus strain AH1263 | N/A | N/A | 의 Alex Horswill 제공 |
| MWCO | |||
| Tryptone | Becton, Dickison and Company | 211705 | |
| 0.5mm 산화지르코늄 비드 | Next Advance | ZROB05 | |
| 총알 블렌더 | Next Advance | BBX24B | |
| 메탄올(LC-MS 등급) | Fisher | A4561 | |
| 클로로포름(시약 등급) | Fisher | MCX10559 | |
| 이소프로판올(LC-MS 등급) | Fisher | A4611 | |
| Dimyristoyl phosphatidylcholine | Avanti 극성 지질 | 850345C-25mg | |
| 암모늄 바이카보네이 | 시그마 | 9830 | ≥ 99.5% 순수 |
| 포름산암모늄 | Sigma | 70221-25G-F | |
| Xcalibur 소프트웨어 | Thermo Scientific | OPTON-30801 | |
| LTQ-Orbitrap Velos 질량 | Thermo Scientific | 고해상도/정밀 질량 MS | |
| Agilent 1260 모세관 HPLC | Agilent | ||
| SpeedVac 진공 농축기 | Thermo Scientific |
참고문헌
- Noskin, G. A., et al. National trends in Staphylococcus aureus infection rates: impact on economic burden and mortality over a 6-year period (1998-2003). Clinical Infectious Diseases. 45 (9), 1132-1140 (2007).
- Noskin, G. A., et al.
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