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방법 논문

과일 파리, 초파리 melanogaster에 비보 먹어서 분석 결과 사용 하 여의 세포 면역 반응 평가

7.3K 조회수

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DOI:

10.3791/59543

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2019년 4월 10일

이 논문에서

요약

이 프로토콜에서는 성인 초파리 melanogaster 식 인식 및 미생물 감염의 계량에서 vivo에서 먹어서 분석 결과를 설명 합니다.

초록

모든 동물에서 타고 난 면제는 광범위 한 병원 균에 대 한 즉각적이 고 강력한 방어를 제공합니다. 체액과 세포 면역 응답은 타고 난 면제의 주요 지점 그리고 이러한 응답을 조절 하는 요인의 많은 무척 추 동물과 포유류 사이 보존 진화론은. 식 균 작용, 세포 타고 난 면제의 중심 구성 요소 특수 혈액 세포의 면역 시스템에 의해 수행 됩니다. 과일 파리, 초파리 melanogaster, 분자 메커니즘 먹어서 전체 동물에서의 생리 적 영향을 조사 하는 강력한 유전자 모델로 떠오르고 있다. 여기 우리 초파리 혈액 세포, hemocytes에 의해 입자 통풍 관 그리고 파괴를 계량을 vivo에서 먹어서 주입 기반 분석 결과를 보여 줍니다. 절차 수 연구원은 정확 하 게 제어할 입자 농도 복용량, 시간의 짧은 시간에 높은 재현성 결과 얻을 수 있습니다. 실험은 양적, 수행, 쉽게 그 영향 병원 체 인식, 이해, 및 허가 호스트 요소에 대 한 화면에 적용할 수 있습니다.

서론

타고 난 면역 방어는 병원 성 미생물에 대 한 방어의 첫 번째 줄을 형성 한다. 이러한 응답 기능 둘 다 생식 인코딩 패턴 인식 수용 체 (호흡기) 병원 체 관련 된 분자 패턴 (PAMPs)1감각에 의해 중재는 체액과 세포 타고 난 면역으로 나눌 수 있습니다. 신호 통로의 많은 및 타고 난 면제의 effector 메커니즘 포유류에는 선 충 류, 꼬마 선 충, 과일 파리, 초파리 melanogaster2같은 무척 추 동물 보존 됩니다. 과일 파리 감염 미생물3에 대 한 호스트 방어를 공부 하는 강력한 시스템으로 떠오르고 있다. 초파리 유전자 온순한 쉽고 저렴 하 게 실험실에 reared 이며 짧은 생성 시간을 보내고 있다. 또한, 과일 파리는 다양 한 세균, 바이러스, 세균, 곰 팡이, 또는 기생 하는 병원 체에 대 한 호스트의 시험 사용에 대 한 매우 효율적인 방어를 전시 한다.

초파리 immunologists 앞으로 유전 스크린, 게놈 넓은 중재 하는 RNA 간섭 (RNAi) 곤충 세포 라인의 검사 및 검사에 지도 하는 타고 난 면제-돌연변이 비행 긴....

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프로토콜

1. 주입 Fluorescein 입자 준비

  1. 상용, 열 살해 박테리아의 10 밀리 그램을 다시 구성 입자 fluorescein 표시 ( 재료의 표참조) 추가 하 여 990 µ L 살 균 1 x PBS 그리고 10 µ L 50 m m 나트륨 아 지 드 10 mg/mL의 농도 재고를. 소용돌이를 섞어입니다.
    1. 단일 사용 8 µ L aliquots 0.2 mL 튜브에로 분할 하 고 빛이 관련 된 감도 최소화 하기 위해 4 ° C에서 어두운 상자에서 저장.
      참고: 나트륨 아 지 드 방부 제는 선택 사항이 며 10 mg/mL 주식 1 mL 균 1 x PBS, 만들어진 경우 생략할 수 있습니다 aliquoted, 및-20 ° c.에 저장
  2. 5% 식품 500 µ L 주사기 필터링 녹색 식품 색소와 9.5 mL 살 균 1 x PBS를 혼합 하 여 1 x PBS에 색소의 10 mL 솔루션을 확인 합니다.
  3. 나트륨 아 지 드를 제거 하는 주사 하기 전에 입자를 씻어. PBS와 1.7 mL 튜브에 10 mg/mL의 8 µ L x 믹스 42 µ L 살 균 1. 실 온에서 2.5 분에 대 한 최대 속도로 원심.
    1. 제거는 상쾌한, 실 온에서 2.5 분에 대 한 최대 속도 50 µ L 1....

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결과

Vivo에서 먹어서 분석 결과 fluorescein 표시 된 입자를 사용 하 여의 회로도 그림 1A에 표시 됩니다. 파리 탑재 된 복 부 측 아래로 전기 테이프의 조각에 있으며 등 쪽 혈관이 있는 곳, 복 부의 첫번째 2 개의 세그먼트는 명확 하 게 보이는 (그림 1B). 실험적인 과실의 주요 소스는 주입 및 이미징 절차 (그림 1C)의 단계에서 발생 한다. 비행 조직 또는 입자 막힌 될 수 발생할 수 있습니다 같은 바늘을 사용 하 여 여러 파리를 삽입 ( 그림 1C에서 상단 왼쪽된 패널). Drosophila 자동-fluoresces GFP 빛 아래에서 때문에 막힌된 바늘으로 주입 하는 파리 희미하게 형광 하지만 분명, punctate 형광 .......

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토론

상용, 붙일 레이블 입자는 일반 (0.2 µ m 카복실산 수정 스피어)에 식 균 작용 또는 미생물 (붙일 레이블 열-화학적 살해 박테리아 또는 효 모)의 식 균 작용을 평가 하는 데 사용 됩니다. Phagosome 성숙 평가, 연구원은 입자는 phagolysosome에서 산 성 하에서 중립 pH 감소 때 fluoresces pH에 민감한 염료와 함께 표시를 선택할 수 있습니다. 또는, 먹어서, 병원 체 인식 및 이해의 초기 단계를 검사 하 연구원은 입자 내부와 세포 외부 형광 형광 태그로 표시를 선택 해야 합니다.

신중 하 게 통제 실험 조건 vivo에서 먹어서 분석 결과 재현할 수 있는 방식으로 수행 됩니다 있도록 열쇠입니다. 첫째, 초파리 실험에 사용 하는 파리 4-7 일의 범위 내에서 최적의 나이 일치 해야 하므로 세포 immunosenescence32, 겪 습. 둘째, 주사 사이 기간 일관 .......

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

저자는 vivo에서 먹어서 실험 수행 지원을 위한 닥터 베스 곤잘레스와 박사 Aprajita Garg을 감사 합니다. NSF UMD 사전 시드 부여 및 UMD NIH T32 훈련 보조금, 셀 및 분자 생물학 (CMB)과 호스트 병원 체 상호 작용 (HPI),이 작품을 자금.

....

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.2&뮤; m Red Fluorescent Carboxylate Modified FluoSpheresInvitrogenF8810식세포의 일반적인 식세포 능력을 테스트하기 위한 형광 표지 라텍스 비드. (~580/~605nm) PBS에 1:20 희석액을 5% 염료로 주입합니다.
5430-10 PicoNozzle KitWorld Precision Instruments5430-101.0mm 피펫
용 홀더E. coli(K-12 균주) 생체 입자, Alexa Fluor 488 접합체InvitrogenE13231사멸 E. coli Alexa Fluor 488로 라벨링됨. 그람 음성 박테리아의 식세포 인식 및 흡수를 테스트하는 데 사용합니다. (~495/~519 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugateInvitrogenE23370Alexa Fluor 594로 라벨링된 E. coli 사멸. 그람 음성 박테리아의 식세포 인식 및 흡수를 테스트하는 데 사용합니다. (~590/~617nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugateInvitrogenE2861FITC(Fluorescein)로 표지된 E. coli 사멸. 그람 음성 박테리아의 식세포 인식 및 흡수를 테스트하는 데 사용합니다. (~494/~518nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugateInvitrogenE2863Killed E. coli Texas Red로 라벨링. 그람 음성 박테리아의 식세포 인식 및 흡수를 테스트하는 데 사용합니다. (~595/~615nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugateInvitrogenE2863Killed E. coli Texas Red로 라벨링. 그람 음성 박테리아의 식세포 인식 및 흡수를 테스트하는 데 사용합니다. (~595/~615nm)
바늘 피펫 풀러David Kopf Instruments모델 725
pHrodo Red E. coli BioParticles Phagocytosis 용 접합체InvitrogenP35361사멸 E. coli pHrodo Red로 라벨링. 그람 음성 박테리아의 식세포 재조정, 흡수 및 식체 성숙을 테스트하는 데 사용합니다. (~560/~585nm)입니다. Trypan Blue로 담금질할 필요가 없습니다.
pHrodo Red S. aureus BioParticles Conjugate for PhagocytosisInvitrogenA10010사멸 S. aureus pHrodo Red로 표지. 그람 양성 박테리아의 식세포 재조정, 흡수 및 식체 성숙을 테스트하는 데 사용합니다. (~560/~585nm)입니다. Trypan Blue로 담금질할 필요가 없습니다.
공압 PicoPump PV820World Precision InstrumentsSYS-PV820World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820은 차압을 사용하여 주입 사이에 유리 바늘에 액체를 고정합니다. 사용자는 수동으로 가스 압력의 짧은 폭발을 제어하여 액체를 배출합니다. 나노리터 미만의 부피를 전달할 수 있습니다. 전달되는 액체의 양은 두 가지 주요 변수에 따라 다릅니다. 유리 바늘 개구부의 크기와 사출 압력이 가해지는 시간. 기기를 100ms로 설정 " 시간 초과" 모드.
S. aureus (단백질 A가 없는 목재 균주) 생체 입자, Alexa Fluor 488 접합체InvitrogenS23371Alexa Fluor 488로 표지된 S. aureus 사멸. 그람 양성 박테리아의 식세포 인식 및 흡수를 테스트하는 데 사용합니다. (~495/~519 nm)
S. aureus (단백질 A가 없는 목재 균주) 생체 입자, Alexa Fluor 594 conjugateInvitrogenS23372Alexa Fluor 594로 표지된 S. aureus 사멸. 그람 양성 박테리아의 식세포 인식 및 흡수를 테스트하는 데 사용합니다. (~590/~617nm)
S. aureus (단백질 A가 없는 목재 균주) 생체 입자, 플루오레세인 접합체InvitrogenE2851사멸 S. aureus FITC(플루오레세인)로 표지됨. 그람 양성 박테리아의 식세포 인식 및 흡수를 테스트하는 데 사용합니다. (~494/~518nm)
얇은 벽 유리 모세 혈관세계 정밀 기기TW100F-3주입 바늘. OD = 1.0mm
Trypan Blue Solution (0.4%)SigmaT8154Fluorescein, Alexa Fluor 또는 Texas Red 표지 입자의 세포 외 형광을 소멸시키는 데 사용됩니다.
ZEISS SteREO 현미경 (Discovery.V8)ZeissSteREO Discovery.V8이미징 플라이용 도립 형광 현미경. 디지털 카메라(예: AxioCam HC 카메라) 및 함께 제공되는 소프트웨어(예: AxioVision 4.7 소프트웨어)를 사용하여 사진을 촬영합니다.
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugateInvitrogenZ23373Alexa Fluor 488로 라벨링된 사멸. 효모의 식세포 인식 및 흡수를 테스트하는 데 사용합니다. (~495/~519 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugateInvitrogenZ23374Alexa Fluor 594로 라벨링 된 사멸. 효모의 식세포 인식 및 흡수를 테스트하는 데 사용합니다. (~590/~617nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Fluorescein conjugateInvitrogenZ2841FITC (Fluorescein)로 표지 된 사멸. 효모의 식세포 인식 및 흡수를 테스트하는 데 사용합니다. (~494/~518nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Texas RedInvitrogenZ2843텍사스 레드로 라벨링된 사멸. 효모의 식세포 인식 및 흡수를 테스트하는 데 사용합니다. (~595/~615nm)

참고문헌

  1. Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124 (4), 783-801 (2006).
  2. Kim, D. Studying host-pathogen interactions and innate immunity in Caenorhabditis elegans. Disease Models & Mechanisms. 1 (4-5), 205-208 (2008).

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