방법 논문

사이토 솔 릭 siRNA 전달을 위한 중성 충전, pH 반응 형 고분자 나노 입자의 제조

DOI:

10.3791/59549

⸱

2019년 5월 2일

 ,  , 
1Department of Chemical Engineering, University of Mississippi, 2Department of BioMolecular Sciences, University of Mississippi, 3Biomedical Engineering Program, University of Mississippi

이 논문에서

요약

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화학적 성질을 준비 및 특성화 하는 방법 및 중성 충전 된, pH 반응 siRNA 나노 입자의 생물 활성이 제시 된다. 성공적인 siRNA에 대 한 기준은 크기, 형태학, 표면 전 하, siRNA 하 중 및 유전자 침묵과 같은 나노 의약품에 대해 논의 된다.

초록

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표적으로 하는 분자 의학으로 siRNA의 성공은 병리학 조직 내 세포에 대 한 효율적인 사이토 졸 전달에 달려 있습니다. 이전 ' undruggable ' 간 질환 표적을 siRNA로 치료 하기 위한 임상 성공이 달성 되었다. 그러나 효율적인 종양 siRNA 전달은 긴 순환 시간, 틈새 장기의 회피 (예: 간과 신장) 및 종양 침투 및 유지 를 포함 하는 추가적인 약동 학적 설계 고려 사항을 필요로 합니다. 여기서, 우리는 특히 종양과 같은 비 간 조직에 효율적인 siRNA 전달을 위해 설계 된 중합체 나노 입자의 제제 및 시험관 내 물리 화학적/생물학적 특성화를 설명 한다. 상기 siRNA 나노 입자는 폴 리 이온 복합체를 형성 하는 siRNA와 디 블록 공중 합체 (dimethylamino) 에틸 메타 크 릴레이 트코뷰 틸 메타 크 릴레이 트) (PEG-db)의 정전기 적 복합체에 의해 제조 된다 ( 상기 siRNA는 폴 리 플렉스 코어 내에 금속 이온이 격리 되 고, PEG는 친수성, 중 화제의 코로나를 형성 한다. 더욱이, 상기 DB 블록은 내 상 염색체 통로의 소포가 산성화 함에 따라 막 용 해 되 고 (< pH 6.8), 내 상 염색체의 탈출 및 siRNA의 사이토 솔 릭 전달을 유발 한다. SiRNA의 물리 화학적 특성을 특성화 하는 방법으로는 크기, 표면 전 하, 입자 형태학 및 siRNA 하 중 등이 기재 되어 있다. SiRNA 나노 입자의 생물 활성은 신속 하 고 높은 처리량의 유전자 침묵 분석에서 모델 유전자로 서 루시퍼 라 제를 사용 하 여 측정 된다. 이러한 초기 테스트를 통과 한 설계 (예: PEG-DB 기반 폴 리 플렉스)는 종양 또는 병리학의 다른 사이트에 대 한 siRNA의 전달을 평가 하는 전 임상 동물 연구로의 번역에 적합 한 것으로 간주 됩니다.

서론

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Sirnas는 mRNA 서 열에서 단백질의 번역을 억제 하기 때문에 이론적으로는 모든 알려진 병 리 제1,2,4,5의 약물에 사용 될 수 있습니다. 그러나, 의학에서 sirna의 사용은 sirna 분자6,7의 포괄적으로 가난한 약물 동태 학적 프로 파일에 의해 제한 된다. 정 맥 주사 시, sirnas는 뉴 클레 아 제8,9에 의해 신장 및/또는 저하를 통해 급속히 제거 된다. 그것의 큰 크기 및 음 전 하 때문에, siRNA는 세포에 들어갈 수 없고 또는 내 생포 하는 통로를 이스케이프 하 여 사이토 솔 (10)에 상주 하는 RNA 유도 침묵 복합체 (RISC)에 접근 하 고, 13. 따라서, 광범위 한 노력은 siRNA 전달 전략 (14)의 설계 및 구현에 초점을 맞추고 있다. 이러한 노력은 주로 siRNA를 패키지 하는 지질 및 폴리머 기반 나노 입자의 개발에 초점을 맞추고, 생체 내에서의 클리어런스 및 분해 로부터 보호 하 고, 이온화 가능한 양이온 성 아민 기를 통해 세포 흡수 및 내 염색체 탈출을 개시 한다. 많은 사전 임상 성공이 보고 되 고 가장 최근에는 유전 트랜스 티 레 틴 매개 (해 트) 아 밀 로이드 증15를 치료 하기 위해 나노 입자 기반 간 siRNA 전달에 대 한 첫 번째 임상 성공은 보고 되었습니다.

기존의 약리학 (즉, 소 분자 약물)에 의해 현재 "undruggable" 되는 많은 암 유발 유전자 들이 암 치료 용 고분자 siRNA 나노 입자의 설계에 동기를 부여 하 고 있다. 그러나, 비 간장 siRNA 납품을 위해 고려 되어야 하는 디자인 매개 변수의 개별적인 세트가 있습니다. 전달 시스템은 전신 순환17,18,19내에서 응집을 야기 하는 폴 리 플렉스의 양이온 성 전 하를 차폐 한다. 종양 전달을 위해, 구체적으로, si-NP 안정성은 향상 된 투과성 및 유지 (epr) 효과를 통해 종양 내에 축적이 증가 하 고 따라서 긴 순환을 부여 하는 것이 필수적 이다20,21. 더욱이, si-NP 크기에 대 한 제어는 약 20-200 nm 직경 크기의 나노 입자만을 레버리지로 서 필수적 이며, 보다 작은 Si-NPs (~ 20 50 nm 직경) 더 큰 크기의 나노 입자에 대 한 개선 된 종양 침투를 나타낸다 미세 입자23.

이러한 추가적인 설계 제약을 해결 하기 위해 정 맥 내 투여에 따르는 siRNA의 전신 종양 전달을 위한, 중성-충전, pH 반응 시-NPs가 개발 되었다 (도 1)24. 이러한 si-NPs는 페 길 화 된, 또는 가장 최근에는, 중성 표면 전 하 및 순환에 있는 단백질 흡착 및 오 손 화에 저항을 위한 Zwitterionated25입니다. 그들은 세포내 전달을 구동 하기 위해 양이온 성 문자에 전적으로 의존 할 수 없기 때문에, 매우 효율적인 내 염색체 탈출은 강력한 유전자 침묵을 달성 하기 위한 필수적 이다. 따라서, 이러한 si-NPs의 코어는 세포 외 pH (7.4)에서 불활성 인 고 내 분 비 핵으로 구성 되어 있으 나,이는 내 리소 소 통로의 산성화 조건에서 스위치 유사 방식으로 촉발 된다 [pH 6.8 (초기 내 상 염색체) – 5.0 ( ). 마지막으로, si-NPs의 코어 내에서 양이온 성 및 소수 성 함량의 혼합물은 정전기 및 반 데르 발스 안정화 힘을 모두 제공 하 여, 단지 양이온 시스템에 비해 혈액에서의 시-NPs의 안정성을 향상 시킨다.

다양 한 기능을 비교적 단순한 설계로 통합 하는 것은 가역 적인 추가-프 래그 멘 테이 션 체인 트랜스퍼 (뗏목) 제어 중 합을 사용 하 여 복잡 한 구조와 정밀한 조성을 가진 폴리머를 생산할 수 있습니다. 중성 표면 전 하, pH 반응성 및 NP 안정성을 갖춘 dimethylamino를 생산 하기 위해 폴 리 에틸렌 글리콜을 합성 하는 데 사용 됩니다() 에틸 메타 크 릴레이 트공동부 틸 메타 크 릴레이 트)) (PEG-DB; 그림 1a). PEG-DB는 PEG 코로나 및 DB/siRNA 코어를 사용 하 여 시-NPs를 형성 하는 siRNA와 함께 정전기 적으로 복합 화 된다 (도 1b). PEG는 si-NP 코로나 상에 서 불활성의 중립-충전 된 친수성 층을 형성 한다. 상기 DB 블록은 2-dimethylamino) 에틸 메타 크 릴레이 트 (DMAEMA) 및 부 틸 메타 크 릴레이 트 (BMA)의 50:50 몰 비로 이루어진다. 양이온 DMAEMA 정전기 적으로 복합체는 음으로 충전 된 siRNA. BMA는 np 안정성을 증가 시키고 반 데르 발스 상호 작용에의 한 NP 코어 내에서의 자가 동료 이다. 함께, DMAEMA 및 BMA는 DB 폴리머 블록에 pH 의존적 지질 이중-용 해 거동을 부여 한다. 세포 외 pH에서, DB 블록은 si-NP 코어에 금속 화 되 고 지질 이중 층에 불활성 이다. 내 상 염색체 통로 내에 있는 것과 같은 산 성 조건 하에서, DB 블록 내 이온화 가능한 DMAEMA는 양성자 스폰지 효과를 용이 하 게 하 고, 내 상 염색체 완충은 삼 투 팽 윤 및 파열을 유도 한다26. 추가적으로, DB 블록 내의 소수 성 BMA 모이 어 티는 지질 이중 층으로 활발 하 게 통합 되 고, 강력한 내 혈관 분해를 초래 한다. 따라서, siRNA는 PEG-DB와 함께 복합 화 되어 세포 외 pH에서 중립으로 충전 되 고 안정성이 높게 유지 되 고 있으 나 산 성 pH에서 지질 이중 층을 교란 시켜 siRNA 페이로드의 세포 졸 전달을 보장 한다.

본 명세서는 PEG-DB 로부터 si-NPs를 생산 하는 실험 절차를 설명 한다. 이 화학적 매개 변수를 특성화 하는 방법과 si-NPs의 생물 활성을 제시 하 고 논의 합니다. 신속 하 게 si-NP 생물 활성을 평가 하기 위해, 루시퍼 라 제는 녹 다운 연구를 위한 모델 유전자로 서 사용 된다. 반딧불이의 루시퍼 라 제에는 ' 글로우 '를 담당 하는 프로 틴27가 있습니다. 이에 따라, 상기 반딧불 루시퍼 라 제 유전자로 형질 감염 된 포유류 세포는 루미 노 미터를 이용 하 여 포획 하 여 루시퍼 라 제 발현 수준을 정량화 할 수 있는 바이오 발광 ' 발광 '을 생성 한다. 여기서 우리는 루시퍼 라 제를 사용 하 여 루시퍼 라 제에 대 한 siRNA를 제공 하 고 루시퍼 라 제 발현 세포의 생물 발광에 상응 하는 감소를 정량화 하 여 스크램블 된 siRNA를 받는 세포와 비교 하 여 시-NPs의 생물 활성을 평가 합니다.

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프로토콜

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1. 시-NPs의 준비 및 특성화

  1. si-NP 준비
    1. 3.33 Mg/ml의 구 연산 완충 액 (pH 4.0)에서 10 mM의 고분자를 녹 이세요. 중합체는 먼저 용 해를 보장 하기 위해 에탄올에 10 배 농도로 용 해 될 수 있다.
      참고: 고분자는 낮은 농도에서 용 해 될 수 있지만, 3.33 mg/m l 이상의 농도에서 사용 하 여 균질 한 NP 형성을 방지할 수 있습니다.
    2. SiRNA (50 μ m)를 추가하 여 N+:P 10의 비율로 생성 한다. 파이 펫 팅으로 폴리머 및 siRNA 용액을 철저히 혼합 하 고 30 분 동안 배양 하십시오. 상기 N+:P 비는 상기 siRNA 상에 음으로 하 전 된 인산 염 기의 수에 대 한 고분자 상의 양 전 하를 띤 아민 기의 수를 나타내고, 하기의 화학식으로 계산 된다:
      figure-protocol-1
      여기서, 몰 폴은 폴리머의 몰 양 이며, RU 아민은 폴리머 당 양의 아민의 반복 단위의 수 이며, 몰 siRNA는 sirna의 몰 량 이며, bp siRNA는 siRNA 분자 당 염기 쌍의 수 이다.
    3. 10mm 인산 염 완충 액 (pH 8.0)을 5 배로 추가 하 고 튜브를 피 펫 팅 하거나 반전 시켜 부드럽게 섞어 줍니다. 최종 pH가 중성 (~7.2-7.5) 임을 확인 하기 위해, pH 시험 스트립 위에 10 μ l의 si-NP 용액을 피 펫 한다.
      참고: 시트르산 및 인산 염 버퍼는 밀리 포어 시그마 버퍼 레퍼런스 센터 차트에 따라 제조 된다.
  2. Si-NPs의이 화학적 특성 분석
  3. 동적 광산 산란 (DLS)을 사용 하 여 결과의 si-NPs의 크기 및 표면 전 하를 기록 합니다. 0.45 μ m 포어 사이즈 시린 지 필터를 통해 사각 쿼 츠 또는 폴리스 티 렌 큐 벳으로 0.1의 1Ml(5-1.0 mg/ml)를 여과 하 여 DLS 샘플을 준비 합니다. 제조업체의 사양에 따라 DLS 계측기를 사용 하 여 크기 및 표면 전 하 측정을 기록 합니다.
    1. 투과 전자 현미경 (TEM)을 이용한 이미징 분석을 통해 si-NPs의 크기와 형태를 확인 합니다.
      1. 1 mg/ml에서 5 μ l의 si-NP 용액을 TEM 그리드에 추가 하 고 3 초 동안 60 건조 시킵니다.
      2. 3% uranyl 아세테이트 용액을 5 μ l 씩 첨가 하 고 20 초 동안 건조 시킵니다. 건조 한 격자에 밤새 탈수 하 여 말립니다.
      3. 사용 되는 특정 현미경에 대해 확립 된 프로토콜에 따른 이미지 그리드.
    2. 아가 로스 겔 지체를 사용 하 여 다양 한 N+:P 비율로 siRNA의 로딩을 특성화 합니다.
      1. 2% 아가 로스 겔을 생산 하기 위해 pH 8.0에서 전기 영동 학년 아가 로스 분말 2 g을 100 mL의 1x 태 (트리-아세테이트-EDTA) 버퍼에 추가 합니다. 아가 로스를 중단 하도록 저 어 주세요. 모든 아가 로스가 용 해 될 때까지 열을 전자 렌지에서 밝혀 냅니다 (1-3 분).
      2. 식힌 후에 티 듐 브 로마 이드 (10mg/ml)의 5 μ l를넣고 잘 섞어 줍니다. 아가 로스를 젤 트레이에 붓고 빗을 넣어 우물을 만들어 30 분간 건조 시킵니다. 우물을 적재 하는 빗을 조심 스럽게 제거 하 고 젤 트레이를 1x 태 버퍼를 사용 하 여 최대 필 라인에 채웁니다.
      3. 위의 절차에 따라 0, 1, 2, 5 및 40 N+:P 비율로 si NPs를 생성 합니다. 각각의 si-NP 제형에 대해 파라핀 막에 로딩 염료 (SDS 및 환 원제 없음)의 2 μ l 분 취 액을 넣습니다. 피 펫에 의해 파라핀 필름에 로딩 염료와 함께 si-NP 용액 10 μ l를 혼합 한다.
      4. 아가 로스 젤 웰에 si-NP/로딩 염료 용액을 추가 합니다. 35 분 동안 또는 샘플이 겔 길이의 80%를 통과 할 때까지 100 V에서 전압 소스를 실행 하십시오.
      5. 제조업체의 사양에 따라 UV 트랜스 조명에 siRNA 밴드를 시각화 합니다.

2. 시-NPs의 시험관 내 생물 활성 결정

  1. 모델 유전자 루시퍼 라 제의 녹 다운
    1. 루시퍼 라 제 (위의 절차에 따라)를 생성 하 여 루시퍼 라 제 siRNA 및 스크램블 된 시-NPs를 대조 군으로 하 여 스크램블 된 siRNA 서 열을 사용 한다. 모두 si-NPs와 동일한 최종 N+:P 비율로, 아가 로스 겔 위상차 연구에 의해 확인 된 최적 비율로 formualte. 예시 된 siRNA 서 열은 재료의 표에포함 되어 있다.
    2. 루시퍼 라 제 셀 [MDA ~ 231/루시퍼 라 제 안정 세포] 96-우물에서 2000 세포의 밀도에 있는 검은 색 벽 플레이트. 배양 기 (37, 5% CO2, 95% 습도)에서 풀 미디어 (DMEM 10% FBS)에서 밤새부착 하도록 허용 한다.
    3. Si-NPs를 웰 당 100 μ l의 최종 부피 및 100 nM의 siRNA 농도로 완전 한 혈 청 배지로 희석 한다. Si-NPs를 가진 24 시간 동안 세포를 취급 하십시오.
    4. 24 시간 후, 처리를 제거 하 고 150 μ g/m l 루시페린를 포함 하는 전체 혈 청 매체로 배지를 교체 하십시오. 제조업체의 사양에 따라 플레이트 리더 또는 생체 내 광학 이미징 시스템에서 발광을 측정 하기 전에 5 분 동안 세포를 배양 하십시오.
    5. 루시페린 포함 된 매체를 신선 하 고 완전 한 혈 청 매체로 바꾸고 24 시간 더 배양 하십시오. 위 단계를 반복 하 여 배지를 제거 하 고 150 μ g/m l 루시페린를 함유 하는 전체 혈 청 배지로 교체 하 고, 48 h timepoint에서 발광을 측정 하기 전에 5 분간 인큐베이션 하였다.
    6. 세로 연구의 경우, 냉 광을 측정 하는 동안 무 균 상태에서 세포를 유지. 루시페린를 교체한 후에는 측정 간의 신선 하 고 완전 한 미디어로 계속 문화를 유지 하십시오.
      참고: 적절 한 siRNA 농도는 다른 si-NPs 및 siRNA 분자에 따라 달라질 수 있습니다. 내 분 자체 코어 (예: PEG-DB)를 사용 하 여 중성자 충전 된 폴 리 플렉스를 사용할 경우, 100 nM는 일반적으로 세포에 의해 잘 용납 루시퍼 라 제 녹 다운 > 75%를 생산 합니다. 10n+:P 비 및 100 nM에서 sirna에 대한 PEG -db의 질량 비 sirna 처리 (26 bp sirna를 가정)는 23.3, 즉 sirna의 모든 1.0 ng에 대해 peg-db의 23.3 ng를 추가 한다. 예를 들어, 96-웰 플레이트 (웰 당 100 mL 미디어 볼륨)에서 100 nM에서 잘 치료 하기 위해 siRNA의 166.5 ng에 대 한 3.33 mg/mL 중합체의 1.16 μ l를 추가 하십시오.

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결과

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생체 내 siRNA 전달을 위한 효과적인 si-NPs의 몇 가지 필수적인 특성은 적절 한 크기 (~ 200 nm 직경), siRNA 패키징 및 유전자 침묵 생물 활성 이다. 이것은 완전 한 목록 (토론에서 언급 된 대로)이 아니지만, 이러한 기본 특성은 제제의 추가 테스트를 고려 하기 전에 확인 되어야 합니다.

도 2 는 제제 화 시의 SI-NP 크기 및 표면 전 하의 특성화를 도시 한다. DLS 및 TEM은 si-NP 크기 (둘 다), 다 분산 지 및 형태학을 관찰 하기 위한 보완적인 방법으로 사용 됩니다. DLS 측정은 다 분산 지 1의 평균 직경이 35 nm, 단일 피크의 존재에 의해 표시 되는 유 니 모달 분포 및 상대적으로 좁은 피크 폭에 의해 지시 되는 낮은 (그...

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토론

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여기에 설명 된 si-NPs는 음이온 성 siRNA와 양이온 고분자를 폴 리 이온 복합체 (폴 리 플렉스)로 정전기 협회에 의해 형성 됩니다. PEG-DB 중합체의 siRNA 및 양이온 DB 블록의 정전기 적 복합체는 낮은 pH (4.0)에서 혼합 하 여 촉진 된다. PH 4.0에서 DMAEMA는 고도로 양성자 화 되어 결과적으로 DB 블록이 매우 충전 됩니다. 이것은 중합체가 미 셀을 형성 하는 것과 반대로 용액에서 unimers로 용 해 되 고 siRNA로 효율적으로 DB 복합체를 만드는 것을 보장 한다. 이어서, 용액의 pH를 중성 (pH 7.4)으로 조정 하 여 DB 블록의 ' hydrophobization ', 미 셀 형성 및 생성 된 폴 리 플렉스의 코어 내에서 복합 된 siRNA의 포획을 유발 한다. 이러한 폴 리 플렉스는 PEG가 DB/siRNA 코어 주위의 친수성, 불활성 쉘을 형성 하도록 설계 되어 전신 투여에 필요한 중성 표면 전 하를 초래 합니다. 고분자 화학 및 폴 리 플렉스 형성 과정은

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공개 사항

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저자는 잠재적인 이해 상충을 공개 하지 않습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 크레이그 듀발과 레 베 카 쿡이 연구를 수행 하기 위한 데이터 및 실험실 리소스에 액세스 할 수 있도록 감사 합니다. 저자는 DLS와 TEM (NSF EPS 1004083) 계기에 접근 하기를 위한 나노 규모 과학 및 공학 (VINSE)에 대 한 밴 더 빌 트 연구소에 감사 합니다. 저자 들은 대학원 연구 펠로 우 십 프로그램 (NSF # 1445197)을 지원 하기 위한 국립 과학 재단에 감사 드립니다. 저자는 재정 지원 (NIH R01 EB019409)에 대 한 국가의 건강 연구소에 감사 합니다. 저자는 국방 CDMRP (OR130302) 재정 지원을 위한 국방부 의회 감독 의료 연구 프로그램에 감사 드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.45 μ m 기공 크기 주사기 필터Thermo Fisher ScientificF2513317mm 직경, PTFE 멤브레인
0-14 pH 테스트 스트립Millipore SigmaP4786
10x TAE 버퍼Thermo Fisher Scientific/InvitrogenAM9869
6-7.7 pH 테스트 스트립Millipore SigmaP3536
96웰 블랙 월 플레이트Corning3603조직 배양 처리
된 아가로 오스 분말Thermo Fisher Scientific / Invitrogen16500
구연산 일 수화물Millipore SigmaC1909
이염기성 인산나트륨 수화물Millipore Sigma71643
D-luciferinThermo Fisher Scientific88294모노 칼륨 염
DMEMGibco11995065고포도당 및 피루브산
에탄올Millipore Sigma459836
에티듐 브로마이드Thermo Fisher Scientific/Invitrogen15585011
FBSGibco26140079
loading dyeThermo Fisher Scientific/InvitrogenR0611
Luciferase siRNAIDT해당 없음안티센스 스트랜드 시퀀스: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGC
AAUUGUU
Sense Strand 시퀀스: CAAUUGCACU
GAUAUGAACUCCT*C* *DNA 염기
MDA-MB-231 / 루시퍼라아제(Bsd) 안정 세포GenTarget IncSC059-Bsd루시퍼라제 발현 세포 si-NP 생체 활성을 평가하기 위해 고소됨
단일염기성 인산나트륨 일수화물Millipore SigmaS9638
Scarmbled siRNAIDTN/ 안티센스 스트랜드 시퀀스: AUACGCGUAUU
AUACGCGAUUAACGAC
Sense Strand 시퀀스: CGUUAAUCGCGUAUAAC
GCGUA*T* *DNA 염기
사각 폴리스티렌 큐벳Fisher Scientific14-955-1294.5mL 용량
TEM 그리드Ted Pella, Inc.1GC50PELCO 중앙 표시 그리드, 50 메쉬, 3.0mm OD, 구리
삼 나트륨 시트르산 이수화물Millipore SigmaS1804
우라닐 아세테이트Polysciences, Inc.21447-25
년

참고문헌

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