여기에서, 우리는 파킨슨 병및 파킨슨 병에 관여하는 알파 시누클레인의 질병 특정 형태 변이체의 식별을 허용하는 피부 생검 섹션에 자유 부동 간접 면역 형광 분석에 대한 프로토콜을 제시하고 말초 신경계.
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방법 논문
자유 부동 면역 형광 분석에 의하여 절단 말초 신경 섬유에 있는 알파 Synuclein 응집체를 표적으로 하는
이 논문에서
요약
초록
현재까지 대부분의 신경 퇴행성 질환의 경우 사후 조직 병리학적 결정적 진단만 가능합니다. 파킨슨 병 (PD)의 경우, 진단은 여전히 도파민성 뉴런의 대부분이 이미 손실 된 질병 과정에서 나중에 나타나는 운동 관련 의 임상 징후에만 의존합니다. 그러므로, 질병의 시작또는 그것을 개발의 위험한 상태에 환자를 확인할 수 있는 biomarker를 위한 강한 필요가 있습니다. 지난 몇 년 동안, 피부 생검은 작은 섬유 신경 병증과 같은 말초 신경 질환에 대한 훌륭한 연구 및 진단 도구로 입증되었습니다. 흥미롭게도, 작은 섬유 신경 병 증 및 알파 synuclein (αSyn) 신경 예금 PD 환자에서 피부 생 검에 의해 표시 되었습니다. 실제로, 피부 생검은 병리학에 수그린 말초 신경 조직의 분석을 허용하는 쉽게 접근할 수 있고, 최소침습및 고통없는 절차인의 큰 이점이 있습니다. 더욱이, 동일한 환자의 후속 조치 과정에서 피부 생검을 반복할 수 있는 가능성은 질병 진행과의 종방향 상관관계를 연구할 수 있게 한다. 우리는 PD 환자의 피부 신경 섬유에서 αSyn 응집체의 존재를 조사하기 위해 표준화 된 신뢰할 수있는 프로토콜을 설정합니다. 이 프로토콜은 몇 가지 짧은 고정 단계, 극저온 절편 및 다음 두 개의 특정 항체와 자유 부동 면역 형광 이중 염색을 포함: 항 단백질 유전자 제품 9.5 (PGP9.5) 검출을위한 절단 신경 섬유 및 항 5G4를 표시하기 위해 αSyn 집계. 그것은 또한 피부 신경에 관심있는 다른 단백질을 대상으로 적용 할 수있는 다재 다능하고 민감하고 수행하기 쉬운 프로토콜입니다. αSyn 응집체를 표시하는 능력은 PD의 사전 모뎀 조직 병리학 진단을 확립하기위한 도구로 피부 생검의 사용에 또 다른 단계 앞으로.
서론
피부 생검은 신경 장애 분야의 진단 및 연구 도구로서 큰중요성을 획득했습니다 1. 실제로, 표피와 진피는 풍부한 신체 감각 신경 섬유를 포함 (myelinated 및 unmyelinated), nociceptive 무료 신경 엔딩, 감각 수용체 및 땀샘의 자율 적 내심, 혈관, 피지선과 근육 arrector pilorum 2.
20세기 중반에, PGP9.5 항체의 면역운동화학에 대한 설정은 인간 표피 포유류 피부의 광범위한 내막의 증거를 허용했다3. PGP9.5는 중추 및 말초 신경계(PNS)의 축축을 따라 균등하게 분포된 카복실 말단 하이드라제이다. 이 항체의 가용성은 피부에서 PNS의 형태 및 해부학을 명확히 할뿐만 아니라3,4와관련된 질병에 대한 연구를 구현할 수있었습니다. 피부 생검은 새로운 임상 엔티티를 정의하는 데 기여했습니다: 작은 섬유 신경병. 몇몇 국제적인 단은 피부 생검 분석에 의하여 작은 섬유 신경병의 경피 신경 섬유의 손실 및 현....
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프로토콜
이 프로토콜은 주 윤리 위원회의 승인을 받았으며 등록된 모든 과목은 연구에 대한 서면 동의를 받았습니다.
1. 피부 생검 컬렉션
- 자격을 갖춘 의사가 적절한 임상 환경에서 피부 생검을 수행하게하십시오.
- 피부 생검을 수행하고 알코올 면봉으로 청소 할 영역을 선택합니다.
- 리도카인 1 cc2 %로 마취 제를 준비하십시오.
- 바늘이 부위와 평행하게 되면 국소 마취를 피하주사하십시오.
- 마취의 효과를 확인 한 후, 3mm 일회용 펀치를 가지고 피하 지방에 도달 할 때까지, 표피와 진피를 통해 아래로 회전 회전 회전 회전 과 섬세한 하향 압력을 적용합니다.
- 펀치를 철회하십시오.
- 일회용 집게를 사용하여 피부 플러그를 부드럽게 당깁니다.
- 가위를 사용하여 지방 조직의 수준에서 시편의 기저를 잘라냅니다.
- 시편을 10 mL의 주기-리신-파라포름알데히드(PLP) 고정 용액을 함유하는 튜브에 놓습니다.
- 부위를 소독하고 접착제 붕으로 덮습니다.
2. 조직 고정 및 저장
- 새로운 PLP 고정 솔루션을 만듭니다(표
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결과
기재된 절차(그림 1)에 따라, PD 환자의 자율 구조를 내음하는 진피 신경 근막에서 5G4 항체로 표지된 αSyn 응집체를 검출하였다. 알파-시누클레인 침전물의 형태는 진피 신경의 축삭을 따라 점선신호로서 나타난다(그림 2). 실제로, 3개의 해부학적인 사이트 (자궁 경부, 허벅지 및 말단 다리)에 있는 19명의 PD 환자 그리고 17의 통제에 있는 이 프로토콜을 이용하는 우리는 5G4가 건강한 통제에 대하여 감도의 81%와 α-Syn의 86%가 있고 P-Syn은 감도의 56%가 있었다는 것을 것을을 발견했습니다 및 특이성의 100 %19.
특히, 우리는 5G4와 P-αSyn 양성 예금을 주로 땀샘 주위의 신경뿐만 아니라 근육 발기 필리, 작은 혈관 및 피상경 및 진피 신경총에서 발견했으며, 피상경 내 신경 섬유에서는 결코 발견되.......
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토론
우리는 PD의 진단을 위한 피부 생검을 위한 자유 부동 면역형 광형 분석분석서를 기술합니다: 그것은 반대로 PGP9.5 항체를 가진 이중 면역 염색을 이용합니다, panaxonal 마커 및 반대로 5G4, 집합된 양식을 인식하는 형태 특정 항체 αSyn.
PD에 있는 진단 목적을 위한 피부 생검의 큰 이점은 그리고 그밖 단백질 형태 무질서에서: 1) 온화한 침략적인 기술에 의하여 질병에 수그린 신경 조직에 직접 접근하고 이렇게 예상되는 더 나은 결정으로 혈액 또는 CSF 와 같은 생물학적 유체보다 αSyn 응집체에 대한 민감도; 2) 신경 변성의 척도로서 표피 및 자율 신경 섬유 밀도를 검출하고 정량화 할 수있는 기회; 3) 동일한 환자의 후속 조치 과정에서 피부 생검을 반복할 가능성이 있으며, 질병 진행과의 상관관계를 세로방향으로 연구한다.
여기에 제안된 프로토콜은 빠르고 다재다능하며 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 우선, 조.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
우리는 이 연구의 재정적지원을 위해 파킨슨 슈바이츠와 ABREOC(엔테 오스페레아에로 칸토날레의 과학 연구 자문위원회)에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 5G4 (안티 휴먼 &알파; Syneclein 5G4) | Analytik Jena Roboscreen | 847-0102004001 | 마우스 단클론 |
| AlexaFluor 488 염소 안티 토끼 IgG | Invitrogen | 1971418 | 2 mg/mL |
| AlexaFluor 594 염소 안티 마우스 IgG | 인비트로젠 | 1922849 | 2 mg/mL |
| 인산수소이나트륨 용액 | Merk Millipore | 106586 | |
| 에틸렌 글리콜 | 시그마-알드리치 | 324558 | |
| 글리세롤 | 시그마-알드리치 | G7757 | |
| L-라이신 모노하이드로클로라이드 | 시그마-알드리치 | L5626 | |
| 파라포름알데히드 | 알드리치 화학 | ||
| PGP9.5 | Abcam | ab15503 | 토끼 다클론 |
| 염화나트륨 | 시그마 | S3014 | |
| 나트륨 디하이드로겐 포스페이트 일수화물 | Merck Millipore | 106346 | |
| 나트륨(메타)주기물 | 시그마-알드리치 | S1878 | |
| 트리즈마 베이스 | 시그마 | T1503 | |
| Tryton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 벡타실드 | Vector Laboratories | H-1000 | 마운팅 미디어 |
참고문헌
- McArthur, J. C., Griffin, J. W. Another Tool for the neurologist's Tollbox. Annals of Neurology. 57, 163-167 (2005).
- Wilkinson, P. F., Millington, R. Skin. , Cambridge University Press. Cambridge. ISBN 978-0-521-10681-8 49-50 (2009).
- Weddell, G., et al.
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