여기에서, 중요한 뒷다리 허혈 실험 모형은 혈관 신생 치료의 효과를 평가하기 위하여 기능적, 적학 및 분자 시험의 건전지에 선행됩니다.
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중요한 사지 허혈은 (CLI) 더 낮은 사지 절단의 고위험을 수반하는 심각한 상태입니다. 금 표준 치료인 재혈관화에도 불구하고, 상당수의 CLI 환자는 외과적 또는 혈관내 혈관 혈관 혈관 혈관 화에 적합하지 않습니다. 혈관 신생 치료는 이 환자를 위한 선택권으로 나오고 있습니다 그러나 현재 조사되고 있습니다. 인간에 있는 신청의 앞에, 그 치료는 동물 모형에서 시험되어야 하고 그것의 기계장치는 명확하게 이해되어야 합니다. 뒷다리 허혈 (HLI)의 동물 모델은 쥐에서 말단 외부 불역및 대퇴 동맥 및 정맥의 결찰 및 절제에 의해 개발되었습니다. 기능, 기능학 및 분자 수준에서 허혈 및 가용 혈관 신생 요법의 효과를 평가하기 위해 포괄적 인 테스트 패널이 모였습니다. 레이저 도플러는 관류의 유량 측정 및 기능적 평가에 사용되었다. 조직 반응은 위장근육의 조직학적 섹션상에서 항 CD31 항체로 염색한 후 모세관 밀도를 분석하고 대각선 화 후 부수적인 혈관 밀도를 측정하여 평가하였다. 혈관신생 유전자의 발현은 쥐 위장관 근육으로부터 레이저 포획 미세내부를 포착한 후 내피 세포(ECs)에서만 선택된 혈관신생 인자를 대상으로 RT-PCR 표적화에 의해 정량화되었다. 이 방법은 허혈성 및 비 허혈성 사지 사이 그리고 처리되고 처리되지 않은 사지 사이 다름을 확인하는 에서 민감했습니다. 이 프로토콜은 CLI의 재현 가능한 모델과 혈관 신생 요법을 테스트하기위한 프레임 워크를 제공합니다.
말초 동맥 질환 (PAD)은 주로 더 낮은 사지에 영향을 미칩니다. PAD는 동맥 경화증, 하반신의 혈류에 심각한 제한을 일으킬 수있는 동맥폐쇄에 의해 발생 1. 간헐적 파행은 PAD의 첫 번째 징후이며 걸을 때 근육 통을 말합니다. CLI는 PAD의 가장 가혹한 단계, 허혈성 나머지 통증, 궤양 또는 회지2를 보여주는 환자에서 진단되고. CLI를 가진 환자는 절단의 고위험이 있습니다, 치료되지 않는 경우에 특히3. 더 낮은 사지 revascularization (개천 수술 또는 혈관 내 절차에 의해) 현재 사지 회수를 달성하는 유일한 방법입니다. 그러나, CLI 환자의 약 30%는 병변의 위치, 동맥 폐색의 패턴 및 광범위한 동반변을 포함하는 이유로 이러한절차에 적합하지 않습니다 4,5. 그러므로, 혈관신생의 승진이 더 강렬한 조사에서 전략인 것과 더불어, 이 그렇지 않으면 치료할 수 없는 환자를 위해 새로운 치료가 필요합니다.
인간에서 테스트하기 전에 생체 내 새로운 치료법의 효과와 안전성을 ....
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모든 동물 절차는 지침 2010/63/EU에 따라 되며 기관 동물 복지 기구의 승인을 받았으며 포르투갈 동물 보호 당국인 DGAV의 허가를 받았습니다(면허 번호 023861/2013).
주의: 프로토콜에 사용된 몇몇 화학물질은 독성이 있고 유해합니다. 모든 적절한 안전 관행 및 개인 보호 장비(장갑, 실험실 코트, 전신 바지, 발가락 신발)를 사용하십시오.
1. 뒷다리 허혈의 뮤린 모델
참고: 모든 실험은 22주 된 C57BL/6 암컷 마우스에서 수행됩니다.
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기재된 프로토콜을 사용하여, 탯줄 중간엽 줄기 세포 및 저용량 이온화 방사선(LDIR)을 가설 혈관신생 요법으로 시험하였다 11,12. 레이저 도플러 관류 판독값은 허혈 유도 전과 허혈 유도 직후부터 허혈 후 45일까지 미리 지정된 시점에서 수득하였다. 레이저 도플러에 의한 조직 관류 수치는 색으로 구분된 이미지로 기록되었으며, 관류는 진한 파란색으로 표시되지 않고 가장 높은 관류 수준은 빨간색으로 표시되었습니다. 도 2A 및 3A에 도시된 바와 같이, 도 2B 및 3B에서정량화하고, 뒷다리 허혈의 유도 직후 모든 마우스에서 힌달보 관류의 완전한 손실이 관찰되었고, 뒷다리 허혈을 유도하기위한 기술의.......
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CLI의 뮤린 모델은 대부분 프로펀다 페모리스 4,5,6,7,8,9의 기원에 불과한 대퇴동맥의 결찰로 이루어져있다. 이것은 7 일 9안에 사지에 혈류량을 복구하는 부수적인 순환의 대부분을 그대로 두는 것을 보여주었습니다. 부수적 인 침대의 제거는 대퇴 동맥의 절제에 의해 달성 될 수있다. 그러나, 원래 혈류량의 3 분의 1까지 는 대부분의 부수적인 혈관이 내부 장골 동맥 7에서 발생한다는 것을 감안할 때 시술 후 7 일 이내에 즉시 회복 될 수 있습니다. Lejay 외는 일반.......
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저자는 공개 할 것이 없다.
우리는 호세 리노와 타니아 카르발호, 생물 이미징 시설의 머리와 인스티투토 드 메디치나 분자 주앙 로보 Antunes의 조직학 및 비교 병리학 연구소의 머리, 각각 감사합니다. 우리는 또한 노바 의과 대학 / Faculdade 드 Ciências 메디카스, 유니버시 다드 노바 드 리스보아의 해부학학과에서 Vyacheslav Sushchyk 감사합니다.
자금 지원 참조: UID/IC/0306/2016 Fundação 파라 a Ciência e a Tecnologia에 의해 투자된 프로젝트. 폴라 드 올리베이라는 Fundação 파라 아 시에엔시아 e 테크놀로지아에서 펠로우십(SFRH/BD/80483/2011)에 의해 지원됩니다.
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| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 7500 Fast Real-Time PCR | 응용 바이오시스템 | 기기 | |
| 아세톤 | 머크 | 1000141000 | 시약; 주의 - 고인화성 |
| 아데노신 | 발데팜 | 시약 | |
| 아티파메졸 | 오리온제약 | 시약 | |
| 황산바륨(마이크로불페이크) | Guebert | 8671404(ref. Infarmed) | 시약 |
| 부프레노르핀 | 리히터제약 | 시약 | |
| Carl Zeiss Opmi-1 FC 수술 현미경 | Carl Zeiss 현미경, 독일 | 기기 | |
| cDNA RT2 PreAMP cDNA 합성 키트 | Qiagen | 7335730 | 시약 |
| 저온 유지 장치 Leica CM Leica | Microsystems | 3050S | 기기 |
| DAB peroxidase 기판 키트 | DAKO; Vector Laboratories | K3468 | 시약 |
| , 수소 과산화효소 | Merk | 1072090250 | 시약; 주의 - nocif |
| 소수성 펜 | Dako | 411121 | 시약; 주의 - 독성 |
| Ketamidor | Richterpharma | CN:580393,7 630/01/12 Dfvf | 시약 |
| 레이저 도플러 관류 이미저 moorLDI2-HIR | MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK | 5710 | Instrument |
| Leica DM2500 정립 명시야 현미경 | Leica Microsystems | Instrument | |
| Medetor | Virbac | 037/01/07RFVPT | 시약 |
| 메탄올 | VWR UN1230 | 시약; 주의 - 독성 및 인화성이 높은 | |
| Papaverine | Labesfal | 시약 | |
| Pentano Isso | Merk | 1060561000 | 시약; 주의 - 고인화성 |
| Power SYBR® Green | Applied Biosystems | 4309155 | 시약 |
| 정제 쥐 안티 마우스 CD31 | Pharmingen | 550274 | 시약 |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | 시약 |
| Surgic-Pro 6.0 | Medtronic (Coviden) | VP733X | 봉합사 |
| VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxidase, Rat IgG) | Vectastain ABC 키트; Vector Laboratories | PK-4004 | 시약 |
| Vicryl5.0 / Vicryl 6.0 | Medtronic (Covidien) | UL202 / UL101 | 봉합 |
| Zeiss PALM MicroBeam 레이저 미세 해부 시스템 | Carl Zeiss 현미경, 독일 | 1023290916 | 기기 |
| 입체 현미경 | Carl Zeiss 현미경, 독일 | 기기 | |
| 디지털 카메라 | Linux | 악기 |
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