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방법 논문

쥐 심방 근세포에서 세포 내 [Na+]의 카메라 기반 측정

1.2K 조회수

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DOI:

10.3791/59600

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2022년 5월 27일

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1Center for Biomedical Engineering and Technology and Department of Physiology, University of Maryland School of Medicine, 2Fischell Department of Bioengineering, University of Maryland

이 논문에서

요약

심장 근세포의 세포 내 Na+ 농도([Na+]i)는 심장 질환 중에 변경됩니다. [나+]i 는 세포 내 Ca2+의 중요한 조절자입니다. EMCCD(electron Multiplying Charged Coupled Device) 카메라와 빠르고 제어 가능한 조명기를 사용하여 갓 분리된 쥐 심방 근세포에서 [Na+]i 를 측정하는 새로운 접근 방식을 소개합니다.

초록

세포 내 나트륨 농도([Na+]i)는 세포 내 Ca2+의 중요한 조절자입니다. 이 연구는 sarcolemmal Na + / Ca2+ 교환기의 활성화, 전압 개폐 Na + 채널 및 Na +, K + -ATPase의 거동에 대한 통찰력을 제공합니다. 세포 내 Ca2+ 신호는 심방세동과 같은 심방 질환에서 변경됩니다. 변형된 세포 내 Ca2+ 항상성의 기저에 있는 많은 메커니즘이 규명되어 있지만, 심방 병리학에서 [Na+]i 의 역할과 조절 장애는 잘 알려져 있지 않습니다. [나+]I 심방 근세포는 자극 속도 증가에 반응하여 증가합니다. 따라서 외부 자기장 자극에 대한 반응성은 이러한 세포의 [Na+]i 측정에 매우 중요합니다. 또한 긴 준비(dye-loading) 및 실험 기간(보정)에는 뛰어난 품질의 심방 근세포를 생성하는 분리 프로토콜이 필요합니다. 쥐 심방의 크기가 작고 세포간 기질의 구성으로 인해 고품질 성체 쥐 심방 근세포를 분리하는 것은 어렵습니다. 여기에서는 고품질의 심방 쥐 근세포를 지속적으로 고수율로 제공하는 최적화된 Langendorff-perfusion 기반 분리 프로토콜에 대해 설명합니다.

나트륨 결합 벤조푸란 이소프탈레이트(SBFI)는 가장 일반적으로 사용되는 형광 Na+ 지시약입니다. SBFI는 유리 피펫을 통해 염 형태로 또는 근세포의 근막을 관통할 수 있는 아세톡시메틸(AM) 에스테르로 심장 근세포에 로드할 수 있습니다. 세포 내에서 SBFI-AM은 세포질 에스테라제에 의해 탈에스테르화됩니다. 멤브레인 침투 및 세포질 탈에스테르화의 가변성으로 인해 각 세포는 현장에서 보정해야 합니다. 일반적으로 SBFI 전체 세포 형광을 사용한 [Na+]i 측정은 광전자 증배관(PMT)을 사용하여 수행됩니다. 이 실험적 설정을 통해 한 번에 하나의 세포만 측정할 수 있습니다. myocyte dye loading의 길이와 각 실험 후 보정으로 인해 데이터 수율이 낮습니다. 따라서 [Na+]i를 측정하기 위한 EMCCD 카메라 기반 기술을 개발했습니다. 이 접근법은 여러 근세포에서 동시 [Na+]i 측정을 허용하여 실험 수율을 크게 높일 수 있습니다.

서론

심방 질환(예: 심방세동[AF])에서 세포 내 Ca2+ 신호전달은 근본적으로 변화한다1. AF에서 '재모델링된' 세포 내 Ca2+ 신호전달의 많은 기본 메커니즘이 잘 규명되어 있지만, 2,3 변경된 세포 내 나트륨 농도([Na+]i)가 할 수 있는 역할은 잘 알려져 있지 않습니다. [나+]i는 세포 내 Ca2+의 중요한 조절자입니다. [Na+]i에 대한 연구는 sarcolemmal Na+/Ca2+ 교환체(NCX)의 활성화, Na+ 채널 및 Na+,K+-ATPase(NKA)4의 거동에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 우리는 이전에 심방동 중에 발생하는 높은 심방 활성화율이 [Na+]i 1의 현저한 감소로 이어진다는 것을 보여주었습니다. 이전 연구는 AF3에서 NCX 전류 밀도 (INCX) 및 단백질 발현 수준의 증가를 보여주었습니다. 심방세동 환자의 고립된 심방 근세포에서 전압 의존성 Na+ 전류(INa, late)의 후기 성분의 증가도 보고되었다5. 따라서, 심방세동에서 세포 내 Na+ 항상성에 심오한 변화가 있다는 증거가 있습니다. 따라서 고립된 심방 근세포에서 [Na+]i의 신뢰할 수 있고 재현 가능한 측정은 AF 병리학에 대한 이해를 심화하는 데 필요합니다. 여기에서는 [Na+]i 측정에 적합한 고품질 쥐 심방 근세포를 재현성 있게 분리하는 방법을 보여줍니다. 우리는 심방세동의 형질전환(TG) 마우스 모델이 심방세동 연구의 중요한 부분이 되었기 때문에 최적화된 심방세포 분리 프로토콜에 쥐 심방근세포에 초점을 맞췄습니다6. 이러한 마우스는 종종 제한된 수만 사용할 수 있으며 심방은 종종 섬유화되어 세포 분리에 어려움을 겪습니다.

일반적으로 생존 가능한 세포의 [Na+]i는 형광 지표7,8 또는 다양한 유형의 미세 전극9으로 측정할 수 있습니다. 미세 전극 기반 기술은 sarcolemmal membrane의 침투를 필요로합니다. 따라서 이 기술은 더 큰 세포에 국한되며 세포 무결성이 쉽게 손상되는 작고 좁은 심방 근세포에는 적합하지 않습니다.

나트륨 결합 벤조푸란 이소프탈레이트(SBFI)는 Na+ 7 결합 시 큰 파장 이동을 겪는 형광 지표입니다. SBFI는 340 nm와 380 nm에서 교대로 여기하고 방출 필터(510 nm)를 통과한 후 방출된 형광을 수집합니다. 두 여기 파장(F340/380)에서 신호의 비율은 국소 경로 길이, 염료 농도, 파장 독립적 인 조명 강도 및 검출 효율의 변화를 상쇄 할 수 있습니다. 각 셀에서 알려진 나트륨 농도([Na+])를 가진 용액을 사용하여 현장 보정을 수행할 때 실험 중에 얻은 F340/380 비율은 [Na+]i의 정확하고 감도 높은 측정값을 제공합니다. 모든 Na+ 지표와 마찬가지로 SBFI도 K+에 대한 약간의 친화도를 표시합니다. 여기에 표시된 보정 방법을 사용하면 보정 프로세스 중에 [Na+]i 및 세포 내 칼륨 농도([K+]i)를 안정적으로 '고정'할 수 있으므로 [Na+]i가 [K+]i 10의 <10%인 경우에도 안정적으로 보정할 수 있습니다.

SBFI를 사용하여 [Na+]i의 비율계량 측정을 위한 새로운 EMCCD 카메라 기반 기법을 소개합니다. EMCCD 카메라는 최초로 여러 셀에서 동시 [Na+]i 측정(및 보정)을 가능하게 합니다. 이는 동물 수가 제한된 실험 환경(예: 형질전환 마우스 모델)에서 특히 유용합니다. 일반적으로 SBFI를 사용한 [Na+]i 측정은 광전자 증배관(PMT)을 사용하여 전체 세포 상피 형광 1,11을 수집합니다. PMT는 형광 신호의 매우 우수한 시간 분해능을 제공하지만 공간 분해능이 매우 낮고 실험은 한 번에 하나의 세포로 제한됩니다.

당사의 새로운 프로토콜은 [Na+]i의 재현성과 감도가 높은 측정을 용이하게 합니다. 여러 쥐 심방 근세포에서 [Na+]i 의 변화를 동시에 획득하는 데 최적화되어 있지만 다른 많은 세포 유형에 적용할 수 있습니다.

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프로토콜

여기에 설명된 모든 방법은 볼티모어에 있는 메릴랜드 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다.

1. 성체 쥐 심장에서 심방 근세포의 분리

  1. 각 마우스를 100% 산소에 이소플루란이 함유된 정밀 기화기 및 유도 챔버에 넣습니다.
  2. 동물이 반응이 없을 때까지 이소플루란 흐름을 1%로 설정한 후 안락사 15분 전에 복강내(IP) 헤파린 주사(1–1.25 U/g)를 투여합니다.
  3. 이소플루란 마취를 5%로 증가시켜 마우스를 심층 마취하고 발 꼬집기로 마취의 심부 평면을 확인합니다.
  4. 빠른 개흉술을 시행하여 안락사를 수행한다12; 표준 패턴 집게와 수술용 가위를 사용하여 흉부를 엽니다. 심장과 폐를 수동적으로 동원하고, 대동맥궁을 분리하고, 집게로 잡고 대동맥을 잘라 심장을 제거합니다.
  5. 심장을 얼음처럼 차가운 Ca2+-free cell isolation buffer(CIB, 표 1)에 놓습니다.
  6. 22G 캐뉼라로 대동맥을 캐뉼레이트하고 CIB 용액에서 3배 배율로 광학 현미경으로 실크 봉합사를 사용하여 묶습니다(그림 1A, B).
  7. 주사기에 연결된 캐뉼러를 통해 CIB 용액을 전달하여 캐뉼라가 대동맥동보다 훨씬 위에 있는지 확인하고 현미경으로 관상동맥 관류를 확인합니다.
    참고: 이 단계는 심방 조직의 적절한 관류를 보장하는 데 중요한데, 그 이유는 관상동맥 해부학적 구조가 생쥐에서 매우 가변적이라는 것이 밝혀졌기 때문이다13.
  8. 중력 기반 Langendorff 설정에 심장을 장착하고 37°C에서 5분 동안 Ca2+-free CIB 용액으로 관류하여 용리액이 투명해질 때까지 남아 있는 혈액을 씻어냅니다(그림 1C).
  9. 효소 용액(표 2)으로 전환하고 심방 조직이 부드럽고 이완될 때까지 37°C에서 3-5분 동안 관류합니다.
  10. 슈퍼 그립 집게와 작은 스프링 가위를 사용하여 우측 및 좌측 아트리움을 절제하고 1.8단계에서 사용되었지만 0.15mM CaCl2 가 포함된 CIB 효소 용액이 포함된 작은 배양 접시로 옮기고 37°C의 인큐베이터에서 5-8분 동안 배치합니다(그림 1D).
  11. 심방을 4mL 예열(37°C) 보관 용액(15mM 소 혈청 알부민 및 30mM 2,3-부탄디온 모노옥시를 함유하는 변형된 Tyrode 용액(표 3))을 포함하는 세포 배양 접시에 옮깁니다.
  12. 작은 스프링 가위와 슈퍼 그립 집게를 사용하여 심방을 작은 조직 스트립(심방 크기에 따라 10-20)으로 자릅니다.
  13. 기계적 해리를 위해 2-5mm 사이의 구멍이 있는 다른 화염 광택 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 조직 현탁액을 부드럽게 흡인합니다. 가장 큰 피펫 팁으로 시작하여 가장 작은 피펫 팁으로 이동하여 피펫당 5-10회 흡입합니다.
  14. 200μm 필터를 통해 세포 현탁액을 변형시키고 10분마다 3회 CaCl2 를 첨가하여 0.3mM의 최종 농도를 달성합니다.

2. 세포 품질 평가

  1. 갓 분리된 심방 근세포를 포함하는 세포 현탁액 200μL를 유리 커버슬립에 놓습니다.
  2. 10x 대물렌즈를 사용하여 시야각의 모든 셀을 세고 원형 또는 막대 모양으로 분류합니다. 막대 모양의 세포 중 얼마나 많은 세포가 명확한 교차 줄무늬를 보이는지 확인합니다(결정하기 어려운 경우 25x 대물렌즈로 전환, 그림 2C 참조).
  3. 2.1–2.2단계를 반복합니다.
  4. 투명한 십자 줄무늬 셀이 있는 둥글고, 막대 모양, 막대 모양의 백분율을 계산합니다.
  5. 세포의 80%가 명확한 교차 줄무늬가 있는 막대 모양이 될 때까지 세포 분리 절차를 수정합니다.
  6. 500μL의 심방 세포 현탁액을 라미닌 코팅된 유리 커버슬립에 놓고 세포 챔버를 도립 현미경에 놓습니다. 세포가 5분 동안 가라앉도록 합니다. 1.8mM Ca2+를 함유한 Tyrode의 용액으로 관류합니다.
  7. 세포 자극기 시스템을 사용하여 0.5Hz에서 전기장 자극(2ms 바이폴라 펄스, 30V)을 시작하고 10x 대물렌즈의 시야에서 수축하는 세포의 수를 계산합니다.
  8. 3Hz에서 외부 자기장 자극으로 반복합니다.
  9. 0.5 및 3Hz 자극 속도에 반응하는 세포의 백분율을 계산합니다( 그림 2B 참조). 세포의 50%가 3Hz 자기장 자극에 반응할 때까지 세포 분리 프로토콜을 개선합니다.

3. 갓 분리된 쥐 심방 근세포의 Na+ 지표 로딩

  1. 형광 지시약 나트륨 결합 벤조푸란 이소프탈레이트(SBFI-AM)의 세포 투과성 아세톡시메틸(AM) 에스테르를 사용합니다.
  2. 염료 분산을 촉진하고 균일한 세포 로딩을 달성하기 위해 SBFI를 디메틸설폭사이드(DMSO) 및 적절한 계면활성제 폴리올(예: 플루론)에 용해시켜 세포 현탁액에서 10μM SBFI의 최종 농도를 달성합니다.
  3. 실온에서 로커의 빛으로부터 보호된 60분 동안 SBFI로 셀을 로드합니다.
  4. 세포를 30분 동안 안정시키고 상등액을 제거한 다음 펠릿을 보관 용액(1-2mL)에 다시 현탁시킵니다.
    참고: 실험은 세포 분리 후 4시간 이내에 수행해야 합니다. BDM은 실험14 시작 전에 Tyrode의 용액을 사용한 관류에 의해 씻겨 나갑니다.

4. 계측, [Na+]i 측정 및 [Na+]i 교정

참고: 그림 3 은 실험 기기의 광 경로 회로도를 보여줍니다.

  1. 표 4–6에 설명된 대로 Na+ 농도가 증가하는 보정 용액을 준비합니다.
  2. 투과화제 그라미시딘 D(10μM, -20°C에서 보관된 원액에서)와 Na+, K+ ATPase 억제제인 스트로판티딘(100μM, -20°C에서 보관된 원액)을 각 보정 용액에 추가합니다. 잘 소용돌이치거나 초음파 처리기를 사용하여 gramicidin과 strophantidin이 완전히 용해되었는지 확인하십시오.
  3. 4.1 및 4.2 단계에서 준비된 증가하는 [Na+]o 를 포함하는 보정 용액으로 다중 배럴 관류 시스템을 채웁니다. 느린 관류 속도(~1mL/분, 관류 속도는 세포 챔버의 부피에 따라 달라질 수 있음)를 사용하여 세포 챔버에 연결합니다.
  4. 흡입을 세포실에 연결하고 바닥의 적절한(유리) 용기에 관류액을 수집합니다.
  5. 관류 및 흡입을 중지합니다.
  6. 30분 동안 SBFI 탈에스테르화를 허용한 후, 농축된(3.5단계) 염료 로딩 세포 현탁액 100μL를 도립 현미경의 40x 대물렌즈 시야 위의 라미닌 코팅 유리 커버 슬립에 놓습니다.
  7. 300W 크세논 광원이 있는 급속 스위칭 조명기를 사용하십시오. 고속 스위칭 스캐닝 미러와 협대역폭 여기 필터(340nm ± 10nm, 380nm ± 10nm)를 사용하여 두 가지 여기 파장(340nm 및 380nm)으로 광시야 이미징을 달성할 수 있습니다.
  8. EMCCD 카메라의 시야를 최적화합니다. 관찰 영역이 클수록 프레임 시간이 길어집니다. 프레임 시간이 길수록 인디케이터가 더 많이 표백됩니다. 따라서 프로브의 눈에 띄는 백화가 발생하지 않도록 시야 크기와 프레임 시간의 균형을 맞춥니다.
  9. 세포의 고유 형광이 배경 형광과 유사한지 확인하여 SBFI가 로드되지 않은 심방 세포의 하위 집합에 최소한의 고유 형광만 있는지 확인합니다( 그림 4 참조).
  10. 실험 설계에 따라 적절한 샘플링 속도를 결정합니다([Na+]i 의 변화가 상대적으로 느리기 때문에 샘플링 속도가 낮을 수 있습니다(예: 10-20초마다 하나의 데이터 포인트 획득).
  11. 적절한 ND(Neutral Density) 필터를 사용하고 광원 강도를 적절하게 줄임으로써(예: 운영 소프트웨어에서 강도를 변경하여) 여기광을 감쇠합니다.
  12. 도립 현미경에 연결된 EMCCD 카메라로 적절한 필터를 사용하여 510 ± 40nm에서 방출광을 수집합니다.
  13. 각 셀에 대한 관심 영역(ROI)과 배경 ROI를 정의합니다( 그림 4 참조). 기록된F340 및F380 신호에서 배경을 뺍니다(온라인 또는 데이터 분석 중).
  14. 데이터 수집을 시작합니다.
  15. 관류 및 흡입을 다시 시작합니다. 1.8mM Ca2+ 를 함유한 Tyrode의 용액으로 10-15분 동안 관류하고 실험을 시작하기 전에 안정적인 F340/380 기준선을 기록합니다.
    참고: 10-15분 동안 안정적인 기준선을 기록해야 합니다. 표백이 발생하는 경우(예: F340/380 기준선 감소) ND 필터 밀도를 높이거나 여기광 신호 강도 및/또는 획득 프레임 시간을 줄여 조명 강도를 더욱 약화시키는 것을 목표로 합니다(단계 4.10–4.11 참조).
  16. 연구 질문에 따라 [Na+]i 측정을 시작합니다.

5. [Na+]i 캘리브레이션

  1. 실험 종료 후(단계 4.16) 각 전지에서 현장에서 F340/380 신호의 보정을 수행합니다.
  2. SBFI가 로드된 근세포를 보정 용액으로 관류하여 F340/380 신호를 보정합니다(4.1–4.3단계에서 준비).
  3. [Na+]o 를 0에서 20mM로 올리기 위해 단계적으로 관류합니다. 다음 농도로 이동하기 전에 안정적인 F340/380 신호를 기다립니다(유속에 따라 ~5분, 그림 3B 및 그림 5A 참조).
    알림: F340/380 신호와 교정 용액의 [Na+] 사이의 관계는 F340/380 신호의 유효한 교정을 위해 선형이어야 합니다(그림 5 및 그림 6).

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결과

심방세포 품질 평가
새로 분리된 심방 근세포는 6개의 연속 심방 세포 분리에서 프로토콜에 설명된 대로 세포 형태 및 자기장 자극에 대한 반응성을 기반으로 평가되었습니다. 그림 2 에 표시된 데이터는 명확한 교차 줄무늬를 유지하는 막대 모양의 심방 근세포의 비율이 매우 높다는 것을 보여줍니다. 마찬가지로, 심방 세포의 약 50%가 최대 3Hz의 높은 비율의 외부 자기장 자극에 반응합니다.

SBFI 캘리브레이션
심방근세포에서 SBFI로 측정할 수 있는 [Na+]i 의 상한을 40mM의 [Na+]o 까지 보정 실험을 수행하여 평가했습니다. 최대 [Na+

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토론

여기에서는 나트륨 결합 벤조푸란 이소프탈레이트(SBFI)를 사용하여 여러 생존 가능한 심방 근세포에서 [Na+]i 의 동시 정량 측정을 위한 새로운 EMCCD 카메라 기반 기술을 소개합니다. 여기에 설명된 접근 방식은 여러 세포에서 [Na+]i 를 동시에 측정할 수 있는 최초의 방법입니다. 이 새로운 프로토콜이 제공하는 주요 이점은 (i) 실험 수율의 현저한 증가와 (ii) EMCCD 카메라의 고감도로 인한 조명 강도 및 지속 시간의 감소로 인해 세포 손상을 크게 줄인다는 것입니다.

SBFI의 아세톡시메틸에스테르(AM)를 사용한 근세포 로딩은 플루오레세인 기반 발색단의 AM을 사용한 세포 로딩보다 훨씬 더 오래 걸립니다(예: Fluo-3, Fluo-4, 각각 45-90분 vs. 20분). 또한 각 셀에서 현장 보정이 필요한 [Na+<...

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공개 사항

저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 미국 심장 협회(American Heart Association, 14SDG20110054)에서 MG에 대한 과학자 개발 보조금(Scientist Development Grant)의 지원을 받았습니다. LG에 대한 NIH Interdisciplinary Training Grant in Muscle Biology(T32 AR007592) 및 NIH Cardiovascular Disease Training Grant(2T32HL007698-22A1); 미국심장협회(American Heart Association)의 과학자 개발 보조금(15SDG22100002)은 LB로, NIH는 WJL에 R01 HL106056, R01 HL105239 및 U01 HL116321 보조금을 지급합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2,3-부탄디온 단산소(BDM)시그마-알드리치B0753
340 여기 필터크로마ET40X25mm
380 여기 필터크로마ET80X25mm
510 방출 필터크로마ET510/80m25mm
소 혈청 알부민(BSA)시그마-알드리치A7906
버블 트랩BD Medical Technologies904477
캐뉼라BD Medical Technologies30516722 G x 1 1/2 인치 바늘로 만든 튜브 경로에 위치한 5ml Luer Lok 주사기로 만든 맞춤형으로 제작되었습니다. 1인치로 자르고 말단 끝을 1mm 샌딩합니다.
Cell Chamber: 25mm 유리 커버 슬립을 단단히 고정할 수 있는 개구부와 관류를 위한 입구와 출구 포트가 있는 커버로 맞춤 가공되었습니다.
순환 수조VWR
Collagenase IIWorthingtonLS004176특정 활동 290 U/g
크레아티닌시그마-알드리치C0780
DG5-plus illuminatorSutter instrumentLambda DG-4/DG-5 Plus
DMSOThermo FischerBP231
EGTASigma-AldrichE4378
EMCCD 카메라Princeton InstrumentsProEM-HS
미세 지혈과학 도구130-20
미세 가위정밀 과학 도구14060-10
집게 Supergrip미세 과학 도구00632-11
유리 커버 슬립VWR483808925mm 서클
포도당Sigma-AldrichG7528
Gramicidin DSigma-AldrichG5002
HEPESSigma-AldrichH3375
내부 실리콘 튜빙VWRVWRselect 브랜드 실리콘 튜빙
도립 현미경Nikon InstrumentsNikonTE 2000 U
절연 도구
K 글루코네이시그마-알드리치P1847
KCI시그마-알드리치P5405
KH2PO4Calbiochem529568
Langendorff 관류 장치
MgCl2.6H2O *시그마-알드리치M0250
MyoPacer 세포 자극기IonOptix
Na 글루코네이트시그마-알드리치S2054
NaCl시그마-알드리치S9888
NaH2PO4시그마-알드리치S9390
내츄럴 마우스 라미닌써모 피셔23017015>0.5-2.0 mg/ml
외부 튜브VWR
페트리 접시 35X10 mmFalcon351008
PowerLoadThermo FischerP10020
프로테아제 XXIVSigma-AldrichP8038
SBFI-AMThermo FischerS1264
실크 봉합사Fine Science Tools18020-50직경 0.12 mm
Small Spring scissorsFine Science Tools15000-03
표준 패턴 집게Fine Science Tools11000-12
StrophanthidinSigma-AldrichG5884
수술용 가위 터프 컷Fine Science Tools14054-13
봉합사 묶는 집게Fine Science Tools00272-13
타우린Sigma-AldrichT0625
Trisbase시그마-알드리치트리스-RO
트립신시그마-알드리치T0303
UVFS 반사 0.1 ND 필터ThorlabsNDUV01B25 mm
UVFS 반사 0.2 ND 필터ThorlabsNDUV02B25 mm
UVFS 반사 0.3 ND 필터ThorlabsNDUV03B25 mm
UVFS 반사 0.5 ND 필터ThorlabsNDUV05B25mm
UVFS 반사 1ND 필터ThorlabsNDUV010B25mm
관류 용액에서 캐뉼라 CaCl2 용액 Sigma-Aldrich 21115 정밀 트

참고문헌

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