Method Article

단일 T 세포또는 면역 학적 단세포 힘 분광학을 위한 단입자를 가진 원자력 현미경 캔틸레버의 기능화

DOI:

10.3791/59609

⸱

July 10th, 2019

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences and School of Basic Medicine, Peking Union Medical College, 2Institute for Immunology, School of Medicine, Tsinghua University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 면역학적 연구를 위한 단 하나 T 세포 및 비드 입자를 가진 원자력 현미경 (AFM) 캔틸레버를 기능화하는 프로토콜을 제시합니다. AFM에 의해 단일 쌍 T 세포 수지상 세포 결합을 조사하고 형광 이미징을 통해 AFM에 의해 단일 고체 입자에 대한 대식세포의 실시간 세포 반응을 모니터링하는 절차가 도시된다.

Abstract

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원자력 현미경 검사법 기반 단일 세포 힘 분광법 (AFM-SCFS)은 살아있는 세포의 생물 물리학적 특성을 연구하기위한 강력한 도구입니다. 이 기술은 세포, 수용체 및 리간드 사이, 그리고 많은 그밖 변이와 더불어 그(것)들을 포함하여 살아있는 세포막에 상호 작용 힘 그리고 역학을 탐구하는 것을 허용합니다. 그것은 또한 spatiotemporally 통제된 방식으로 단 하나 세포에 물리적 또는 생화확적인 자극을 전달하는 기계장치로 작동합니다, 따라서 살아있는 세포와 결합될 때 특정 세포 활성화 및 후속 세포 사건을 실시간으로 감시될 수 있게 합니다 형광 이미징. 이러한 AFM-SCFS 측정의 핵심 단계는 AFM-캔틸레버 기능화 또는 즉, 관심 있는 주제를 캔틸레버에 부착하는 것입니다. 여기에서, 우리는 면역학 연구를 위한 단 하나 T 세포 및 단 하나 폴리스티렌 비드를 각각 가진 AFM 캔틸레버를 수정하는 방법을 제시합니다. 전자는 단일 T 세포를 용액의 평평한 캔틸레버 끝에 결합하는 생체 적합성 접착제를 포함하고, 후자는 공기 환경에서 단일 비드 접착을 위해 에폭시 접착제에 의존합니다. 각 캔틸레버 수정과 관련된 두 가지 면역 학적 응용 분야도 제공됩니다. 여기서 설명한 방법은 다양한 세포 유형 및 고체 입자에 쉽게 적응할 수 있습니다.

Introduction

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원자력 현미경 검사법 (AFM), 다재 다능한 도구는세포 생물학 연구 1, 2,3,4,5에서많은 응용 프로그램을 발견했습니다. 고해상도 이미징 기능 외에도, 네이티브 포스 프로빙 기능은 살아있는 세포의 생물 물리학적 특성을 단일 세포 수준6,7에서현장에서 직접 조사 할 수 있게합니다. 이들은 세포내 세포 구조 또는 전체 세포 8,9,10,11,12,특정 리간드/수용체 결합 강도의 강성을 포함합니다. 세포 표면(13)에대한 단일 분자 수준, 고체 입자와 세포의 단일 쌍 또....

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Protocol

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마우스 실험 프로토콜은 칭화대학의 동물 관리 지침을 따릅니다.

1. 단일 T 셀로 캔틸레버 기능화

  1. 마우스 비장 세포 준비
    1. 마우스를 희생 (나이의 8-16 주 (어느 섹스); 예를 들어, C57BL/6 변형) 이산화탄소를 사용 하 여, 자궁 경 부 탈구 다음.
    2. 75% 에탄올로 마우스를 청소하고 비장 절제술 에 이어 중간 선 피부 절개를합니다.
    3. 유리 슬라이드를 사용하여 2% 태아 소 혈청(FBS)을 함유하는 PBS의 4 mL에서 비장을 균질화하고 70 μm 메쉬 나일론 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 통과시킴으로써 응집체 및 이물질을 제거한다.
    4. 세포 현탁액을 5분 동안 500 x g에서 원심분리하고, 상복부 세포를 폐기하고, 적혈구 용해 완충액 2 mL(실온에서 균형)에서 5분 동안 재중단한다.
    5. 세포 현탁액을 5분 동안 500 x g에서 원심분리하고 2% FBS 및 1 mM EDTA(솔루션 A로 표시됨)를 포함하는 PBS에서 1 x 108 셀/mL의 밀도로 세포를 재중단시키고, 전형적으로 세포 밀도에 따라 0.25-2 mL. 재부유 된 세포를 5 mL (12 x 75 mm) 폴리스티....

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Results

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그림 4A는 단일 T 셀과 단일 DC 간의 결합 상호 작용으로부터의 일반적인 힘 거리 곡선을 하나의 접근-리트랙트 사이클에서 보여줍니다. 연한 빨간색 곡선은 확장 곡선이고 진한 빨간색 곡선은 후퇴 곡선입니다. 확장 곡선은 일반적으로 들여쓰기 또는 강성 분석에 사용되므로 여기서는 후퇴 곡선만 셀 접착에 대해 우려됩니다. 곡선의 최소값(녹색 원)은 최대 접착력을 측정합니다. 곡선 아래의 영역(그늘진 영역)은 T 셀을 DC로부터 분리하는 데 필요한 작업(에너지)을 나타냅니다. 완전한 분리 전에 날카롭고 단계별 파열 사건이 종종 관찰됩니다. 이것은 세포/세포 인터페이스에서 강한 결합으로 인해 세포 표면에서 멤브레인 테더가 당겨지고 연속 당김 하에서 개별적으로 파괴되는 것으로 해석됩니다. 상기 단계의 개수, 높이 및 길이는 세포막(21)의 기계적성질을 특성화하는데 사용될 수 있다. T.......

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Discussion

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AFM 기반 단세포 힘 분광법은 살아있는 세포의 생물물리학적 특성을 해결하는 강력한 도구로 발전했습니다. 이러한 응용 프로그램의 경우, 캔틸레버는 관심 있는 세포에 대한 특정 상호 작용 또는 특성을 조사하기 위해 제대로 기능화되어야 합니다. 여기서, 단일 T 세포와 단일 미크로넨 크기의 비드를 팁리스 캔틸레버에 결합하는 방법이 각각 기재되어 있다. 단일 T 세포를 캔틸레버에 부착하기 위해 생체 적합성 접착제를 세포 접착제로 선택했습니다. 해양 홍합에서 추출한 특수 한 단백질 용액입니다. 그것의 접착성은 하이드록실 그룹이 비특이적 인 방식으로 세포 표면에 노출 된 잔류물과 수소 결합을 형성 할 수있는 폴리 페놀 성 잔류물에서 비롯됩니다. 이 결합 방법은 일반적으로 결합 된 세포의 세포 기능을 방해하지 않습니다. 적절한 접착을 위해 부착할 세포의 조건도 중요합니다. 갓 정제된 마우스 CD4+T 세포의 경우, 캔틸레버 기능화에 사용되기 전에 인간 IL-2로 하룻밤 동안 먼저 처리해야 합니다. 그렇지 않으면, 그들은 오히려 빨리 세포 .......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgements

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이 작품은 중국 일반 프로그램의 국립 자연 과학 재단 (31370878), 국가 키 프로그램 (31630023) 및 혁신적인 연구 그룹 프로그램 (81621002)에 의해 지원됩니다.

....

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Materials

2

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Material
10 μ l 피펫 팁Thermo Fisher104-Q
15 ml 튜브Corning430791
직경 6cm 배양 접시NALGENE nunc150462
6-well culture plateJETTCP011006
AFM 캔틸레버NanoWorldArrow-TL1-50팁리스 캔틸레버
&베타;-MercaptoethanolSigma7604
생체 적합성 접착제BD Cell-Tak354240
CD4+ T cell isolation CocktailSTEMCELL19852C.1
DC2.4 cell lineK. Rock(University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA)의 선물덱
스트란 코팅 자성 입자STEMCELLSV30010
EDTAGENErayGeneray-E1101-500 ml
에폭시ERGO7100
에탄올twbio00019
FBSEx Cell BioFSP500
FcR 차단제STEMCELL18731
유리 커버슬립로컬 벤더(Hai Men Lian Sheng)HX-E3724mm 직경, 0.17mm 두께,
유리 슬라이드JinTong 실험실 및 장비 관리 부서, Haimen N / A맞춤형
H < 서브 > 2 < / 서브 > O< 서브 > 2 < / 서브 > (30 %)중국 제약10011218
H < 서브 > 2 < / 서브 > SO < >4 < >80120892
Hepes시그마51558
자석STEMCELL18000
메쉬 나일론 스트레이너BD 팔콘REF 352350
Moesin-EGFPN/A실험실에서 복제됨
마우스 CD25 Treg 세포 양성 분리 키트STEMCELL18782구성 요소: FcR 차단제, 조절 T 세포 양성 선택 칵테일, PE 선택 칵테일, Dextran RapidSpheres,
마우스 CD4+ Tcell 분리 키트STEMCELL19852구성 요소: CD4+T 세포 분리 칵테일, 스트렙타비딘 RapidSpheres, 쥐 혈청
NaOHLanyi 화학 제품 유한 회사? 베이징1310-73-2
PBSSolarbioP1022-500
PE 선택 칵테일STEMCELL18151
페니실린-스트렙토마이신하이클론SV30010
PLCδ-PH-mCherryAddgene36075
폴리스티렌 마이크로스피어 6.0μ m Polysciences07312-5
폴리스티렌 라운드 바닥 튜브BD 팔콘352054
랫 세럼STEMCELL13551
RAW264.7  ATCC
재조합 인간 인터루킨-2PeprotechPeprotech, 200-02-1000
적혈구 용해 완충액BeyotimeC3702
조절 T 세포 양성 선택 칵테일STEMCELL18782C
RPMI 1640LifeC11875500BT
샘플 챔버집에서 만든
스트렙타비딘 코팅 자성 입자STEMCELL50001
형질주입 키트클론텍631318
트립신 0.25% EDTA생명25200114
핀셋JDN/A
NameCompany카탈로그 번호< strong>Comments
Equipment
20x objective NA 0.8Zeiss420650-9901Plan-Apochromat
Atomic force microscopeJPKcellHesion200
CentrifugeBeckman coulterAllegra X-12R
형광 이미징Zeiss 현미경 스탠드를 기반으로 한 집에서 만든 대물렌즈 형 전반사 형광 현미경
가습 CO 인큐베이터 Thermo Fisher HERACELL 150i 도립광 현미경 Zeiss Observer A1 설명서

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Benoit, M., Gabriel, D., Gerisch, G., Gaub, H. E. Discrete interactions in cell adhesion measured by single-molecule force spectroscopy. Nature Cell Biology. 2 (6), 313-317 (2000).
  2. Chen, J., et al.

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