Method Article

자극된 라만 산란을 기반으로 한 비선형 현미경 구현

DOI:

10.3791/59614

⸱

July 6th, 2019

 ,  ,  , 
1National Research Council, Institute for Microelectronics and Microsystems, Naples Unit, Italy

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 원고에서, 레이저 스캐닝 현미경과 SRS 실험 설정의 통합에 의해 얻어진 자극된 라만 산란(SRS) 현미경의 구현이 설명된다. SRS 현미경은 두 개의 펨토초(fs) 레이저 소스, Ti-Sapphire(Ti:Sa) 및 동기화된 광학 파라메트릭 발진기(OPO)를 기반으로 합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

자극 된 라만 산란 (SRS) 현미경 검사법은 근적외선 여기 광을 사용합니다. 따라서, 그것은 많은 다중 광자 현미경 화상 진찰 속성을 공유합니다. SRS 이미징 양식은 적절한 대역 통과 필터와 잠금 증폭기(LIA) 검출 체계가 있는 비스캔 된 전방 검출기를 장착하여 상업용 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 얻을 수 있습니다. 일반적인 SRS 현미경의 회로도 레이아웃은 다음을 포함합니다: 2개의 펄스 레이저 빔, (즉, 스캐닝 현미경으로 향하는 펌프 및 프로브), 이는 이미지 평면에서 공간과 시간 둘 다에서 중첩되어야 하고, 현미경 목표에 의해 집중되어야 합니다 x-y 평면을 가로질러 초점 지점을 래스터하는 두 개의 스캐닝 미러(SM)를 통해 샘플을 채취한다. 샘플과의 상호 작용 후, 전송된 출력 펄스는 상부 목표에 의해 수집되고 반전된 현미경에 삽입된 전방 검출 시스템에 의해 측정됩니다. 펌프 펄스는 광학 필터 스택에 의해 제거되는 반면, 시편의 초점 부피에서 발생하는 SRS 공정의 결과인 프로브 펄스는 포토다이오드(PD)에 의해 측정됩니다. PD의 판독은 변조 깊이를 추출하기 위해 LIA에 의해 복조됩니다. 2차원(2D) 이미지는 전방 검출 유닛을 현미경 스캐닝 유닛과 동기화하여 수득됩니다. 이 백서에서는 SRS 현미경의 구현이 설명되고 성공적으로 입증되었으며 직경 3 μm의 폴리스티렌 비드의 라벨이없는 이미지의 보고도 설명되고 성공적으로 입증되었습니다. SRS 현미경은 상업적으로 사용할 수 없으므로 이러한 특성을 활용하기 위해 집에서 만든 건설이 유일한 옵션입니다. SRS 현미경 검사법은 많은 분야에서 인기를 끌고 있기 때문에, SRS 현미경 구현의 이 신중한 설명은 과학 적인 사회를 위해 아주 유용할 수 있다는 것을 믿습니다.

Introduction

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생명 과학 응용 분야에서 SRS 현미경 검사는 라벨없는 이미징을위한 강력한 도구로 부상했습니다. SRS 현미경 검사법의 기본적인 아이디어는 진동 콘트라스트의 강도와 몇 초 안에 이미지를 획득 하는 기능을 결합 하는 것입니다.

SRS는 두 레이저 빔 주파수 사이의 주파수 차이 (펌프 신호와 다른 주파수에서 스톡 스 신호)가 조사 된 샘플의 분자 진동과 일치하여 자극 된 라만 산란 및 상당한 원인이되는 프로세스입니다. 스톡스 신호가 증가합니다. 선형 라만 분광법과 달리 SRS는 들어오는 광장에 비선형 의존성을 나타내며 일관된 방사선을 생성합니다. SRS에는 두 가지 근본적인 장점이 있습니다: 1) 속도는 샘플 이동 또는 저하로 인해 발생하는 아티팩트에 덜 민감하게 만들고, 2) 우수한 신호 대 잡음 비(SNR)를 제공합니다. 또한, SRS는 자발적라만과 동일한 스펙트럼을 나타내고, SRS 신호는 1, 2,3,4, 화학적 결합의 농도에 선형적으로 비례한다. 5

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Protocol

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1. 레이저 시스템 시작

  1. 냉각기의 온도가 20 °C 이하로 유지되는지 확인하십시오.
  2. 습도 제어 장치가 제대로 작동하고 습도가 약 40%의 값으로 유지되었는지 확인합니다.
  3. Ti:Sa 레이저를 켜고 설명서의 지침에 따라 엄격하게 설정합니다.
  4. 파장을 810 nm로 설정합니다.
  5. OPO 및 연결된 미니 컴퓨터를 켭니다. OPO 레이저를 제어하는 응용 프로그램을 실행합니다.
  6. OPO 상자의 출구에서 Ti:Sa 레이저 출력의 100%가 필요한 경우 우회를 선택합니다.
  7. OPO 상자의 출구에서 Ti:Sa 레이저 출력과 OPO 레이저 출력의 20%가 필요한 경우 바이패스를 해제합니다.
  8. Ti:Sa의 셔터를 열고 Ti:Sa 빔을 OPO 입력에 놓습니다.
  9. 신호 아웃 및 펌프 아웃을 클릭하여 OPO 출구에서 두 개의 레이저 빔을 놓습니다.
  10. 레이저 Ti: Sa 및 OPO가 안정화될 때까지 기다립니다(약 45-60분).
  11. 종이 검출기 카드를 사용하여 Ti:Sa 및 OPO 의 O....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SRS 측정의 예(즉, 샘플의 단일 지점에서의 SRS 측정)는 도7에 보고된다. 빔이 시간 또는 공간에서 중첩되지 않으면 얻어진 결과는 도 8a에보고된다. 오프 공진에서 LIA로 측정된 신호의 진폭은 0이고 LIA로 측정된 신호의 위상은 음수값과 양수 값 사이를 이동합니다. 반면, 빔이 공간에서 중첩되면, 적절한 범위에서 지연 선을 이동하면, 얻어진 결과는 도 8b에보고된다. LIA에 의해 측정된 신호는 빔이 시간에 완벽하게 중첩될 때 최대값에 도달하고 위상은 빔이 시간에 중첩되는 동안 고정값을 달성하기 시작합니다.

동일한 폴리스티렌 비드의 단일 빔(Ti:Sa 또는 OPO)을 사용하여 얻어진 흡수 이미지는 도 9a, b에서 6 μm의 스케일 바.......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SRS 현미경 검사법은 세포와 세포 건축에 근본적인 지질과 같은 복잡한 생물학 구조물의 연구 결과에서, 특히 새로운 고도에 라벨 자유로운 화상 진찰을 취했습니다. 지질은 생물학적 막의 생산과 같은 여러 생리학적 경로에 관여하며, 이들은 생합성 전구체 및신호 변환기(10)로서 작용한다. 지질은 또한 지질 방울에게 불린 전문화한 세포내 세포기관으로 포장됩니다 (LDs). 그들의 직경은 마이크로 미터11,12의수십 나노 미터의 수십에서 다양합니다. LDs 뿐만 아니라 지방에 풍부 하 게 참여- 그리고 스테로이드 생산 세포 뿐만 아니라 다른 세포 주에서 존재. LDs는 지질 저장과 같은 몇몇 생리적인 프로세스에서 협력합니다. 그(것)들은 일반적인 병리 (예를 들면, 변경한 콜레스테롤 물질 대사)13,

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IMM CNR의 V. Tufano는 귀중한 기술 지원과 니콘 인스트루먼트의 제품 전문가인 Giacomo Cozzi에게 유용한 토론과 지속적인 지원을 해 주셔서 감사합니다. 이 작품은 부분적으로 이탈리아 국립 운영 프로그램 PONa3 00025 (BIOforIU)와 유로 바이오 이미징 대규모 범유럽 연구 인프라 프로젝트에 의해 지원되었다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Acquisation toolNikonNikon C2ToolAcquisation supported tool
APE Pulse link control softwareAPE-APEPulse link control softwaresoftware control
autocorrelatorAPE APEPulseCheck USB 50Autocorrelator
DetectorThorlabsThorlabs DET10APhotodiode
Detector cardThorlabsThorlabs VRCIR 검출기 카드
이색성 거울SemrockSemrock FF875-Di01-25X36이색
거울 이색성 거울SemrockFF875-Di01-25X36이색성 거울
EOMConoptics(EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P).포켈스 셀
빠른 검출기ThorlabsThorlabs DET025AL/M포토다이오드
빠른 미러 스캐닝 유닛NikonC2Microscpe 스캐닝 헤드
펨토초 레이저 Ti:SACoherentCoherent 카멜레온 Ultra II카멜레온 Ultra II
함수 발생기TTiTG5011 AIM – TTi함수 발생기
도립 광학 현미경NikonEclipse TE-2000-E, NikonEclipse TE-2000-E, Nikon
락인앰플리파이어스탠포드 연구 시스템SR844-200 MHz 스탠포드 리서치 시스템의 이중 위상 A 락인앰플리파이어
노치 필터,SemrockNF03-808E-25노치 필터
광학 지연선뉴포트뉴포트 M-ILS200CC조정 가능한 광학 지연선
광학 파라메트릭 발진기코히런트코히런트 컴팩트 OPO코히런트 컴팩트 OPO
오실로스코프웨이브러너640Zi 4GHz OSC/LeCroy디지털 오실로스코프
PCI 카드내쇼날인스트루먼트NI PCIe 6363데이터 수집 카드
위치 센서 검출기뉴포트뉴포트 코넥스 PSD9위치 감지기 센서
파워 미터 헤드CoherentPowerMax PM10,레이저 파워 검출기
번역 스테이지ThorlabsThorlabs PT1/MMeachnical 번역 스테이지(표준 마이크로미터 포함
성 )

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Saar, B. G., et al. Video-Rate Molecular Imaging in Vivo with Stimulated Raman Scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
  2. Zhang, D., Wang, P., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. Fast Vibrational Imaging of Single Cells and Tissu....

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Stimulated Raman ScatteringNonlinear MicroscopyLaser AlignmentLock in AmplifierForward DetectionBeam OverlapLabel free ImagingPolystyrene BeadsVibrational ContrastMicroscope Implementation

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