여기서, 우리는 호중구 계보 세포의 고차원 질량 세포측정 (비행 시간, CyTOF에 의한 세포 측정) 분석을 위해 마우스 또는 인간으로부터 분리 된 신선한 골수 (BM)를 처리하는 프로토콜을 제시한다.
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이 논문에서
요약
초록
이 문서에서는, 우리는 전체 BM CyTOF 분석을 위한 신선한 BM에 있는 호중구 계보 세포를 보존하기 위하여 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 우리는 골수성 편향 된 39 항체 CyTOF 패널을 사용하여이 프로토콜을 사용하여 호중구 혈통 세포에 초점을 맞춘 조혈 시스템을 평가했습니다. CyTOF 결과는 오픈 리소스 차원 감소 알고리즘, viSNE로 분석되었고, 데이터는 이 프로토콜의 결과를 입증하기 위해 제시되었다. 우리는 이 프로토콜에 근거를 둔 새로운 호중구 혈통 세포 인구를 발견했습니다. 신선한 전체 BM 제제의 이 프로토콜은 1), 전체 BM에서 확인되지 않은 세포 집단을 발견하기 위해 CyTOF 분석을 위해 사용될 수 있습니다, 2), 백혈병과 같은 혈액 장애를 가진 환자를 위한 전체 BM 결점을 조사하는, 3), 의 최적화를 지원 신선한 전체 BM을 활용하는 형광 활성화 유동 세포 분석 프로토콜.
서론
지난 수십 년 동안, 세포 분석 방법은 BM의 조혈 시스템을 조사하는 강력한 도구되었습니다. 이러한 방법은 중금속 표지 항체를 사용하여 형광 활성화 유동 세포 분석 및 CyTOF의 새로운 방법을 포함한다. 그(것)들은 그들의 유일한 표면 마커 발현 단면도의 확인에 의하여 이기종 생물학 견본에 있는 많은 세포 모형의 발견으로 이끌어 냈습니다. 더 많은 채널과 관련된 스펙트럼 중복이 증가하면 형광 활성화 유동 세포 분석 애플리케이션에서 더 높은 데이터 부정확성이 발생합니다. 따라서, 불순한 세포는 형광 활성화 유동 세포 분석 분석을 위한 관심있는 세포 인구를 풍부하게 하기 위하여 일상적으로 제거됩니다. 예를 들어, Ly6G (또는 Gr-1) 및 CD11b는 성숙한 골수성 세포 마커로 간주되며 Ly6G+ (또는 Gr-1+) 및 CD11b+ 세포는 유세포 분석 전에 자기 농축 키트를 사용하여 BM 샘플에서 일상적으로 제거됩니다. 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC) 또는 하나의 덤프 칵테일 채널 1,2,3에이러한 마커를 결합하여. 또 다른 예는 호중구가 면역학 연구를 위한 말....
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프로토콜
모든 실험은 라호야 알레르기 및 면역학 동물 관리 및 사용 위원회의 승인 된 지침을 따랐으며, 설치류 사용에 대한 승인은 라 호야 알레르기 및 면역학 연구소에서 설명 된 기준에 따라 획득되었습니다. 건강의 국가 학회에서 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 가이드.
1. 수확 마우스 골수 (BM)
- 상업 공급 업체에서 C57BL /6J 마우스를 구입. 병원균이 없는 시설에서 마이크로이솔레이터 케이지에 표준 설치류 차우 식단과 집을 먹이라.
- 실험 목적으로 생쥐 6-10주를 사용하십시오. CO2 흡입에 의해 안락사시키고 자궁 경부 탈구가 뒤따릅니다.
- 마우스를 복부 쪽을 위로 올려 놓고 멸균 수술 패드에 놓습니다. 70 % 에탄올을 분사하여 복부와 뒷다리 부위의 피부를 살균하십시오. 복강을 열어 절단해 해부 수술 가위 한 쌍을 사용합니다.
- 뒷다리를 노출하기 위해 피부를 제거합니다. 무딘 팁 드레싱 포셉을 사용하여 마우스 경골을 발목 바로 아래에 고정시됩니다. 또 다른 한 쌍의 커브드레싱 집게를 사용하여 무딘 팁 드레싱 집게 아래의 경골을 안정시보세요. 경골을 부수고 무딘 팁 드레싱 집게로 근육을 찢어 뼈를 노출하십시오.
참고: ....
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결과
도 1은 CyTOF 실험으로부터의 예로 제시된다. 이러한 tSNE 플롯상에서 여러 마우스 조직에 걸친 세포는 33-파라미터 CyTOF 패널에 의해 측정된 그들의 표면 마커 발현 프로파일의 유사성에 기초하여 서브세트로 군집되었다. 더 유사한 특성을 가진 세포는 각 세포상에 33개의 마커의 발현에 기초하여 호중구, 대식세포, 또는 DC와 같은 함께 자동으로 클러스터되었다.
도 2는 본 연구에 제시된 프로토콜을 이용하여 마우스 BM CyTOF 실험에 대한 예로서 제시된다. 이 프로토콜은 전체 BM의 무결성을 보존하여 호중구(Ly6G +, 도 2A)및 HSPC(CD117+,도 2B)시그니처 표면 마커를 공동 발현하는 이전에 알려지지 않은 세포 집단의 발견으.......
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토론
지난 수십 년 동안, 형광 계류 세포측정은 세포 혈통 및 이질성을 연구하는 주요방법으로 사용되었다 1,2,3. 유세포측정법이 다차원 데이터를 제공했지만 이 방법은 매개 변수 와 스펙트럼 중복의 선택에 의해 제한됩니다. 유세포 분석의 약점을 극복하기 위해 우리는 형광단 대신 중금속 동위원소를 사용하여 검출기 채널 또는 세포의 자가 형광 사이의 누화를 제거하는 항체에 라벨을 붙이는 CyTOF를 활용했습니다. 단일 세포 수준에서 동시에 더 많은 매개 변수를 생성하고 세포 다양성12의훨씬 더 깊은 평가를 생성합니다. 고갈 또는 게이팅 과정에서 과거에 생략된 세포 집단, 특히 호중구 계보 세포와 같은 중요한 면역 세포는 오랫동안 균질한 것으로 여겨졌던13,
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
우리는 대량 세포 분석 절차에 도움을 LJI 흐름 세포 분석 코어에 감사드립니다. 이 작품은 NIH 보조금 R01HL134236, P01HL136275 및 R01CA202987 (모두 C.C.H) 및 ADA7-12-MN-31 (04) (C.C.H. 및 Y.P.Z)에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| CyTOF 항체 (mouse) | |||
| Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y | Fluidigm | Cat# 3089005B | |
| Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb | Fluidigm | Cat# 3176002B | |
| Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purified | Biolegend | Cat# 120402; RRID:AB_961070 | |
| 안티 마우스 CD115 (CSF-1R) (클론 AFS98)-정제 | 바이오레전 | Cat# 135502; RRID:AB_1937293 | |
| 안티-마우스 CD117/c-kit (클론 2B8)-166Er | 플루이다임 | Cat# 3166004B | |
| 안티-마우스 CD11a (클론 M17/4)-Purified | Biolegend | Cat# 101101; RRID:AB_312774 | |
| 안티-마우스 CD11b (클론 M1/70)-148Nd | 플루이다임 | Cat# 3148003B | |
| 안티-마우스 CD11c (클론 N418)-142Nd | 플루이다임 | Cat# 3142003B | |
| 안티-마우스 CD127 (IL-7Rα) (클론 A7R34)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| 안티-마우스 CD150 (클론 TC1512F12.2)-167Er | 플루이다임 | Cat# 3167004B | |
| 안티-마우스 CD16.2 (Fcγ RIV) (클론 9E9)-정제된 | 바이오레전 | Cat# 149502; RRID:AB_2565302 | |
| 안티 마우스 CD162(클론 4RA10(RUO))-정제 | BD Biosciences | Cat# 557787; RRID:AB_647340 | |
| 안티 마우스 CD169 (Siglec-1) (클론 3D6.112)-정제된 | 바이오레전 | Cat# 142402; RRID:AB_10916523 | |
| 안티 마우스 CD182 (CXCR2) (클론 SA044G4)-정제 | 바이오레전 | Cat# 149302; RRID:AB_2565277 | |
| 안티 마우스 CD183 (클론 CXCR3-173)-정제 | 바이오레전 | Cat# 126502; RRID:AB_1027635 | |
| 안티 마우스 CD335 (NKp46) (클론 29A1.4)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 137625; RRID:AB_2563744 | |
| 안티 마우스 CD34 (클론 MEC14.7)-정제된 | 바이오레전 | Cat# 119302; RRID:AB_345280 | |
| 안티 마우스 CD41 (클론 MWReg30)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| 안티-마우스 CD43 (클론 S11)-146Nd | Fluidigm | Cat# 3146009B | |
| 안티-마우스 CD48 (클론 HM48.1)-156Gd | 플루이다임 | Cat# 3156012B | |
| 안티-마우스 CD62L (클론 MEL-14)-MaxPar Ready | ThermoFisher | Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481 | |
| 안티 마우스 CD71 (클론 RI7217)-정제된 | 바이오레전 | Cat# 113802; RRID:AB_313563 | |
| 안티 마우스 CD90 (클론 G7)-정제 | 바이오레전 | 고양이# 105202; RRID:AB_313169 | |
| 안티-마우스 F4/80 (클론 BM8)-159Tb | 플루이다임 | Cat# 3159009B | |
| 안티-마우스 Fcε 리&알파; (클론 MAR-1)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 134321; RRID:AB_2563768 | |
| 안티 마우스 GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-정제 | BD Biosciences | Cat# 554404; RRID:AB_395370 | |
| 안티 마우스 I-A/I-E (클론 M5/114.15.2)-174Yb | Fluidigm | cat# 3174003B | |
| 안티 마우스 Ki67 (클론 B56 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 556003; RRID:AB_396287 | |
| 안티-마우스 Ly-6A/E (Sca-1) (클론 D7)-169Tm | Fluidigm | Cat# 3169015B | |
| 안티-마우스 Ly6B (클론 7/4)-정제된 | abcam | Cat# ab53457; RRID:AB_881409 | |
| 안티 마우스 Ly-6G(클론 1A8)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 127637; RRID:AB_2563784 | |
| 안티 마우스 NK1.1 (클론 PK136)-165Ho | Fluidigm | cat# 3165018B | |
| 안티 마우스 Siglec-F (클론 E50-2440 (RUO))-정제 | BD Biosciences | Cat# 552125; RRID:AB_394340 | |
| 안티-마우스 TCR&베타; (클론 H57-597)-143Nd | Fluidigm | (클론 H57-597)-143Nd | |
| 안티 마우스 TER-119/적혈구 세포(클론 TER-119)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 116241; RRID:AB_2563789 | |
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| Antibody Stabilizer | CANDOR Bioscience | Cat# 130050 | |
| 소 혈청 알부민 | Sigma-Aldrich | Cat# A4503 | |
| Cisplatin-194Pt | Fluidigm | Cat# 201194 | |
| eBioscience 1x RBC 용해 버퍼 | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| eBioscience Foxp3 / 전사 인자 염색 버퍼 세트 | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| EQ 네 가지 요소 보정 비드 | Fluidigm | Cat# 201078 | |
| 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) | ThermoFisher | Cat# AM9260G | |
| 태아 소 세럼 | Omega Scientific | Cat# FB-02 | |
| HyClone Phosphate 완충 식염수 GE | Lifesciences | Cat#SH30256.01 | |
| Intercalator-Ir | Fluidigm | Cat# 201192B | |
| MAXPAR 항체 라벨링 키트 | Fluidigm | http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php | |
| 파라포름알데히드 | Sigma-Aldrich | Cat# 158127 | |
| 아지드화 | 나트륨시그마-알드리치 | Cat# S2002 | |
| 트리톤 X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# X100 | |
| Trypsin EDTA 1x | Corning | Cat# 25-053-Cl | |
| 실험 모델: Organism/Strains | |||
| Mouse: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 재고 번호: 000664 | |
| Software Alogrithm | |||
| 비드 기반 노멀라이저 | Finck et al., 2013 | https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf | |
| Cytobank | Cytobank | https://www.cytobank.org/ | |
| Cytofkit v1.r.0 | Chen et al., 2016 | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html | |
| t-SNE | van der Maaten and Hinton, 2008 | https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html | |
참고문헌
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
- Iwasaki, H., Akashi, K. Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell. Immunity. 26....
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재인쇄 및 허가
