시험관 내 전사 된 RNA-기반 루시퍼 라 제 리포터 검정은 폭스 바이러스 감염 세포에서 번역 조절을 연구 하기 위해

요약

우리는 시험관 내 전사 된 RNA 기반 루시퍼 라 제 리포터 분석을 사용 하 여 폭스 바이러스에 감염 된 세포에서 mRNA 번역 조절을 연구 하기 위한 프로토콜을 제시 합니다. 분석 법은 5 '-미 번역 지역 (UTR) 및 3 '-UTR를 포함 하 여 mRNA의 cis요소에 의해 번역 조절을 연구 하기 위하여 이용 될 수 있습니다. 이 방법을 사용 하 여 다른 변환 시작 모드를 검사할 수도 있습니다.

초록

바이러스 DNA 복제 후에 전사 된 모든 폭스 바이러스 mRNA는 5 '-UTR의 진화 적으로 보존 된 비 템플릿 기반 5 ' 폴 리 (A) 선두 주자입니다. 폭스 바이러스 감염 시 mRNA 번역에서 5 '-폴 리 (A) 지도자의 역할을 해 하는 우리는 시험관 내 전사 된 RNA 기반 루시퍼 라 제 리포터 검정을 개발 했습니다. 이 리포터 검정은 4 개의 핵심 단계를 포함 한다: (1) 시험관 내 전사를 위한 DNA 템플릿을 증폭 하는 PCR; (2) 시험관 내 전사 T7 RNA 중 합 효소를 사용 하 여 mRNA를 생성 하는 단계; (3) 시험관 내에서 세포 내로 전사 된 mRNA를 도입 하는 형질 전환; (4) 번역의 지표로 서의 루시퍼 라 제 활동의 검출. 여기에 설명 된 RNA 기반 루시퍼 라 제 리포터 분석은 플라스 미드 로부터 폭스 바이러스에 감염 된 세포 및 비밀 전사의 플라스 미드 복제의 문제를 회피 한다. 이 프로토콜은 폭스 바이러스에 감염 된 세포가 아닌 시스템에서 5 '-UTR 및 3 '-UTR를 포함 한 mRNA의 cis원소에의 한 번역 조절을 결정 하는데 사용 될 수 있다. 또한이 방법을 사용 하 여 cap 종속, cap 독립적, 다시 시작 및 내부 시작과 같은 다양 한 번역 시작 모드를 조사할 수 있습니다.

서론

중앙 교리에 따르면, 유전 정보는 DNA에서 RNA로 그리고 마침내 단백질^1,2로 흐릅니다. 유전 정보의이 흐름은 mRNA 번역^3을포함 하 여 많은 수준에서 높게 통제 됩니다,⁴. 유전자 발현 조절을 측정 하기 위한 리포터 분석의 개발은이 과정에 관여 하는 규제 메커니즘의 이해를 용이 하 게 한다. 여기서 우리는 폭스 바이러스에 감염 된 세포에서 시험관 내 전사 된 RNA 기반 루시퍼 라 제 리포터 분석 법을 사용 하 여 mRNA 번역을 연구 하는 프로토콜을 설명 한다.

폭스 바이러스는 많은 매우 위험한 인간과 동물 병원 균을 포함 한다⁵. 다른 모든 바이러스 처럼, 폭스 바이러스 독점적으로 단백질 합성에 대 한 호스트 세포 기계에 의존^6,7,8. 바이러스 성 단백질을 효율적으로 합성 하기 위해 바이러스는 세포 중개 기계를 납치....

프로토콜

1. 시험관 내 전사 를 위한 PCR에의 한 DNA 템플릿 제조

1. PCR에 의해 DNA 템플릿을 제조 하기 위해, 프라이 머를 설계 하였다. 프라이 머를 설계 할 때 뇌관 길이, 어 닐 링 온도 (T_m), GC 내용, G 또는 C 등으로 3 끝과 같은 중요 한 특성을 고려
   참고: 이들 문헌^25,26,27에서 상세히 논의 한다.
2. 다음 원소를 포함 하는 PCR 앰 플 아이콘을 생성 하는 프라이 머를 설계 하 여 5 ' 내지 3 ' 방향: T7, 폴 리 (A) 리더, 반딧불 루시퍼 라 제 ORF 및 폴 리 (A) 꼬리는 T7_12A로 서 지칭 된다. 디자인 프라이 머 (정방향 및 역방향)는 템플릿 DNA에 존재 하지 않는 모든 부가적인 원소 들을 포괄 한다 (도 2a).
   참고: 모든 요소의 시퀀스는 표 1 에서 찾을 수 있습니다.
3. 앞으로 프라이 머 (5T7 ')

결과

시험관 내 전사 된 RNA-기반 루시퍼 라 제 리포터 분석의 4 단계: 시험관 내 기록 체에 대 한 DNA 템플릿 생성 PCR, mRNA 트랜스 펙 션 및 루시퍼 라 제 측정을 생성 하는 생체 외 전사, 개략도에서 볼 수 있다 ( 그림 1). DNA 템플릿 (Fluc 및 Rluc) 모두를 위한 프라이 머의 설계 및 오버행 확장 PCR의 일반적인 계획은 도식 적으로 예시 된다 (도 2a). PCR 후, 정확한 크기의 PCR 산물을 아가 로스 겔 전기 영동에 의해 검출 하였다 (도 2b). 이어서, PCR 산물은 시험관 내에서 RNA를 합성 하는 템플릿으로 서 사용 된다 (도 3a),이는 정제 되 고 tbe 겔 전기 영동으로 실행 되어 크기를 확인 한다 (

토론

모든 4-코어 단계는 시험관 내 전사 된 RNA 기반 루시퍼 라 제 리포터 분석의 성공에 매우 중요 합니다. 특히 T7 프로모터 서 열에 대 한 프라이 머 디자인에 특별 한 주의가 주어져야 한다. T7 RNA 중 합 효소는 T7 프로모터의 밑줄이 그어진 첫 번째 G (gGG-5'-UTR) 로부터 전사를 시작 하 여 5 ' UTR 서 열 전에 첨가 하였다. 전사 개시 사이트 (TSS)는 5 ' 말단에서 제 1 G 로부터 시작 하지만, T7 프로모터 영역에서의 G의 3 미만의 수를 감소 시키면 RNA를 시험관 내 전사에서 수율/산출 하였다. 실험 동안, 우리는 젤 정제 된 DNA 생성물이 수율과 RNA의 질이 더 낮 았 기 때문에 시험관 내 전사에 대 한 최고가 아니었다는 것을 관찰 했습니다. 우리는 1% 아가 로스 겔 전기 영동에서 PCR 반응의 5-10%만을 실행 하 여 나머지 90-95%를 정제 하 고, PCR 정제 키트를 사용 하 여, 시험관 내 전사에 사용 될 수 있다. PCR 로부터 비 특이 적 증폭의 경우,.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2X-Q5 마스터 믹스	New England Biolabs	M0492	High-Fidelity DNA Polymerase used in PCR
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA 캡 구조 아날로그	New England Biolabs	S1411L	안티 리버스 캡 아날로그 또는 ARCA
Corning 96 웰 하프 영역 흰색 평면 바닥 폴리스티렌 마이크로플레이트	Corning	3693	불투명 벽 96웰 흰색 플레이트(단단한 바닥
포함)듀얼 루시페라제 리포터 분석 시스템	Promega	E1960	듀얼 루시페라제 분석 키트(DLAK)
E.Z.N.A. 사이클 퓨어 키트	OMEGA BIO-TEK	D6492	PCR 정제 키트
GloMax Navigator Microplate Luminometer	Promega	GM2010	다중 모드 플레이트 리더 광도계라고 함
HiScribe T7 빠른 고수율 RNA 합성 키트	New England Biolabs	E2050S	In 체외 전사 키트
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019	양이온성 지질 형질주입 시약
NanoDrop2000	Thermo Fisher Scientific	ND-2000	DNA 및 RNA 농도 측정에 사용
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	31985070	저혈청 배지
Purelink RNA Mini Kit	Thermo Fisher Scientific	12183018A	RNA 정제 키트
Vaccinia 캡핑 시스템	New England Biolabs	M2080	캡핑 시스템