이 프로토콜은 프로브 기반 실시간 중합효소 연쇄 반응(PCR), 설포호다민 B(SRB) 분석, 3' 번역되지 않은 영역(3' UTR) 클로닝 및 루시퍼라제 분석제를 사용하여 관심 있는 miRNA의 표적 유전자를 확인하고 miRNA의 기능을 이해합니다.
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이 논문에서
요약
초록
MicroRNAs (miRNAs)는 암을 포함하여 몇몇 질병에 있는 수많은 세포내 신호 통로를 조절하기 위하여 인식되는 작은 규정하는 RNA입니다. 이 작은 조절 RNA는 주로 그들의 표적 메신저 RNA (mRNA)의 3' 번역되지 않은 지구 (3' UTR)와 궁극적으로 mRNA의 디코딩 프로세스의 억제 및 표적 mRNA 분해의 확대의 결과로 상호 작용합니다. 발현 수준 및 세포내 기능에 기초하여, miRNA는 종양발생 및 종양 억제 mRNA의 조절 인자로 작용할 수 있다. 수백 또는 수천 개의 계산 예측 표적 중에서 miRNA의 선의의 표적 유전자를 식별하는 것은 관심 있는 miRNA의 역할 및 기본 분자 메커니즘을 분별하는 중요한 단계이다. 다양한 miRNA 표적 예측 프로그램은 가능한 miRNA-mRNA 상호작용을 검색할 수 있다. 그러나, 가장 어려운 질문은 관심의 miRNA의 직접적인 표적 유전자를 확인하는 방법입니다. 이 프로토콜은 miRNA의 기능과 관련된 miRNA 표적을 식별하는 방법에 대한 주요 방법의 재현 가능한 전략을 설명합니다. 이 프로토콜은 miRNA 모방 형질감염에 따른 프로브 기반 실시간 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 설포호다민 B(SRB) 분석사를 사용하여 miRNA 수준, 기능 및 관련 표적 mRNA를 밝히기 위한 단계별 절차에 대한 실용적인 가이드를 제시합니다. , 투여 량 -응답 곡선 생성, 및 루시 퍼래스 분석 유전자의 3'UTR의 복제와 함께, 이는 개별 miRNAs의 역할의 적절한 이해에 필요하다.
서론
MicroRNAs (miRNAs)는 주로 선의의 표적 유전자에서 3'번역되지 않은 영역 (3' UTR)에 반응하여 메신저 RNA (mRNAs)의 번역 및 분해 과정을조절하는 작은 조절 RNA이다 1. miRNAs의 발현은 전사 및 전사 후 메커니즘에 의해 조절될 수 있다. 이러한 규제 메커니즘의 불균형은 암을 포함한 수많은 질병에서 통제되지 않고독특한 miRNAs 발현 수준을 가져온다 2. 단일 miRNA는 다양한 mRNA와 다중 상호작용을 가질 수 있다. 그에 상응하여, 개별 mRNA는 다양한 miRNA에 의해 제어될 수 있다. 따라서 세포내 신호 네트워크는 생리적 장애 및 질병이 시작되고 악화될 수 있는 특유의 발현 된 miRNAs에 의해 복잡하게 영향을 받습니다2,3,4. 5개 , 6. miRNAs의 변경된 표현이 암의 각종 모형에서 관찰되었더라도, miRNAs와 함께 암세포의 매너를 조절하는 분자 기계장치는 아직....
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프로토콜
1. 성숙한 마이크로RNA (miRNA) 발현 분석
-
성숙한 miRNA 상보적인 DNA (cDNA) 종합
- 총 RNA 254 ng와 데옥시리보뉴클리스 I(DNase I) 혼합물 4.5μl을 첨가한 다음, PCR 스트립 튜브에 초순수를 첨가하여 최대 18 μL(그림2A)을만듭니다. 총 반응 수에 기초하여 충분한 양의 DNase I 혼합물을 사용하여 여러 세포주로부터 정제된 각 총 RNA 샘플에 대한 반응을 준비한다.
참고: DNase I 혼합물은 DNase I(1.8 μL), 리보누클레스 억제제(0.3 μL), 및 25 mM MgCl2(2.4 μL)로 구성된다. 재현가능한 전체 RNA를 조달하기 위해 페놀-클로로포름 기반 추출 방법을 사용하는 대신 컬럼 기반 추출 방법을 적용하였다. 페놀-클로로포름 기반 추출방법(11,12)을사용할 경우 일부 miRNA의 추출 수율이 세포 수에 따라 달라질 수 있다고 보고되었다. - 열 사이클러에서 튜브를 배양합니다. 튜브를 37°C에서 10분 동안 실행하고, 90°C에....
- 총 RNA 254 ng와 데옥시리보뉴클리스 I(DNase I) 혼합물 4.5μl을 첨가한 다음, PCR 스트립 튜브에 초순수를 첨가하여 최대 18 μL(그림2A)을만듭니다. 총 반응 수에 기초하여 충분한 양의 DNase I 혼합물을 사용하여 여러 세포주로부터 정제된 각 총 RNA 샘플에 대한 반응을 준비한다.
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결과
miRNA 수준의 성공적이고 정확한 확인은 질병의 발달 및 진행에서 miRNA의 예상 역할에 기초하여 miRNA의 분류가 가능한 데이터의 해석에 중요합니다. miRNA-107 및 miRNA-301의 수준은 프로브 기반 정량적 PCR을 사용하여 3개의 췌장 세포주에서 측정되었다. 특정 miRNA 및 동일한 반응에서 기준 유전자 모두의 cdNAs의 합성은 데이터의 재현성을 증가시킬 수 있다. PANC-1 및 CAPAN-1은 인간 췌장 덕트 선암 세포주이며, HPNE는 인간 텔로머라아제 역전사(hTERT) 유전자를 항하는 레트로바이러스 발현 벡터로 트랜스화된 불멸의 췌장 덕트 세포주이다. miRNA-107은 HPNE 세포와 비교하여 PANC-1 및 CAPAN-1 세포에서 현저히 감소하였다(도2C). miRNA-301의 수준은 HPNE 세포와 비교하여 PANC-1 및 CAPAN-1 세포에서 현저하게 상승 조절되었다. 이러한 결과는 miRNA-107이 췌장암 세포에서 후생유전학적으로 불활성화되고 miRNA-.......
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토론
관심있는 miRNA의 기능을 가진 선의의 miRNA 표적의 결정을 위한 전략은 miRNA의 다중 역할의 이해를 위해 필수적입니다. miRNA 표적 유전자의 식별은 세포에서 miRNAs에 의해 변조된 세포 신호 이벤트를 해석하기 위한 지침일 수 있다. miRNA의 기능적으로 중요한 표적 유전자의 공개는 암에 있는 miRNA 기지를 둔 치료를 개발하기 위하여 근본적인 지식을 제공할 수 있습니다.
마이크로어레이, 소형 RNA 라이브러리 시퀀싱, 딥 시퀀싱, 시투 PCR의 역전사, 북부 블로팅과 같은 여러 가지 방법이 세포주 및 조직으로부터 분리된 총 RNA를 사용하여 miRNA 발현 수준을 탐구하기 위해 적용될 수 있다24, 25,26. miRNAs의 높은 처리량 프로파일링은 암 발달의 유전적 기초에 대한 귀중한 통찰.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 연구는 교육부의 지원을 받는 국립연구재단(NRF)을 통해 기초과학 연구 프로그램에 의해 지원되었다(2017R1D1A3B03035662); 및 한림대학교 연구기금, 2017(HRF-201703-003)
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 15 mL 코니컬 튜브 | SPL Life Sciences | 50015 | |
| 24웰 플레이트 | Thermo Scientific | 142475 | |
| 50 mL 코니컬 튜브 | SPL Life Sciences | 50050 | |
| 6웰 플레이트 | Falcon | 353046 | |
| 6x DNA 로딩 염료 | Real Biotech Corporation | RD006 | 1 mL |
| 8-cap 스트립 | 적용 Biosystems | N8010535 | cDNA 합성용 |
| 8-튜브 스트립 | Applied Biosystems | N8010580 | cDNA 합성용 |
| 96-웰 플레이트 | Falcon | 353072 | |
| Acetic acid | Sigma | A6283-1L | 1 L |
| Agarose A | Bio Basic | D0012 | 500 g |
| 알칼리성 포스파타제 | New England Biolabs | M0290S | 10,000 U/mL |
| 암피실린 | 바이오 베이직 Canada Inc | AB0028 | 25 g |
| AriaMx 96 튜브 스트립 | Agilent Technologies | 401493 | 실시간 PCR |
| AriaMx real-time PCR 시스템 Agilent | Technologies | G8830A | qPCR 증폭, 검출 및 데이터 분석 |
| AsiSI | New England Biolabs | R0630 | 10,000 units/mL |
| CAPAN-1 세포 | ATCC | HTB-79 | |
| 세포 배양 후드 | Labtech | 모델: LCB-1203B-A2 | |
| V-슬래시가 있는 계수 챔버 | Paul Marienfeld | 650010 | 세포 카운터 |
| CutSmart 버퍼 | New England Biolabs | B7204S | 10X 농도 |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | 500mL |
| DNA 겔 추출 키트 | 생체 공학 | DN30200 | 200 prep |
| DNA ladder | NIPPON Genetics EUROPE | MWD1 | 1 Kb ladder |
| DNase I | Invitrogen | 18068015 | 100 units |
| Dual-luciferase reporter assay system | Promega | E1910 | 100 assay |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140-079 | 500 mL |
| HIT competent cells | Real Biotech Corporation(RBC) | RH617 | 유능한 세포 |
| HPNE 세포 | ATCC | CRL-4023 | |
| LB 한천 국물 | Bio Basic | SD7003 | 250 g |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | 0.75 mL |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778-075 | 0.75 mL |
| 광도계 | Promega | 모델 : E5311 | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 22431021 | |
| Microplate reader | TECAN | Infinite F50 | |
| miRNA control mimic | Ambion | 4464058 | 5 nmole |
| miRNA-107 mimic | Ambion | 4464066 | 5 nmole |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | 50 prep |
| Mupid-2plus (전기영동 시스템) | TaKaRa | 모델: AD110 | |
| NotI | New England Biolabs | R3189 | 20,000 units/mL |
| Oligo 탐색기 프로그램 | GeneLink | 프라이머 설계용 | |
| 광학 튜브 스트립 캡(8x 스트립) | Agilent Technologies | 401425 | 실시간 PCR |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | 500 Ml |
| PANC-1 셀 | ATCC | CRL-1469 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | Gibco | 15140-122 | 100mL |
| 인산염 완충액 식염수 | Gibco | 14040117 | 1000mL |
| 플라스미드 DNA miniprep S& V kit | Bionics | DN10200 | 200 prep |
| PrimeSTAR GXL DNA 중합효소 | TaKaRa | R050A | 250 단위 |
| Shaker | TECAN | 쉐이킹 플랫폼 | |
| 쉐이킹 인큐베이터 | 랩텍 | 모델: LSI-3016A | |
| Sigmaplot 14 소프트웨어 | Systat Software Inc | 용량 반응 곡선 생성용 | |
| Sulforhodamine B 분말 | Sigma | S1402-5G | 5 g |
| SYBR 그린 마스터 믹스 | Smobio | TQ12001805401-3 | 용 결합 형광 염료 |
| TaKaRa | 2011A | 25,000 U | |
| TaqMan 마스터 믹스 | Applied Biosystems | 4324018 | 200회 반응, AmpErase UNG |
| TaqMan microRNA assay (has-miR-107) | Applied Biosystems | 4427975 | Assay ID: 000443 (50RT, 150 PCR rxns) |
| TaqMan microRNA assay (has-miR-301) | Applied Biosystems | 4427975 | Assay ID: 000528 (50RT, 150 PCR rxns) |
| TaqMan miR RT kit | Applied Biosystems | 4366597 1,000 reactions | |
| Thermo CO2 incubator (BB15) | ThermoFisher Scientific | 37 ° C 및 5% CO2 배양 | |
| 트리클로로아세트산 | Sigma | 91228-100G | 100g |
| Trizma base | Sigma | T4661-100G | 100g |
| 초순수 | Invitrogen | 10977-015 | 500mL |
| Veriti 96 well thermal cycler | Applied Biosystems | DNA(또는 cDNA) 증폭용 | |
| XhoI | New England Biolabs | R0146 | 20,000개/mL |
참고문헌
- He, L., Hannon, G. J. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nature Reviews Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).
- Park, J. K., Doseff, A. I., Schmittgen, T. D. MicroRNAs Targeting Caspase-3 and -7 in PANC-1 Cells. International Journal of Mole....
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재인쇄 및 허가
