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방법 논문

세포 내 이미징 및 고정 조직 분석을 사용하여 암 세포 보급과 관련된 전이 의 종양 미세 환경 평가

8.5K 조회수

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DOI:

10.3791/59633

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2019년 6월 26일

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1Department of Anatomy and Structural Biology, Albert Einstein College of Medicine, 2Gruss-Lipper Biophotonics Center, Albert Einstein College of Medicine, 3Integrated Imaging Program, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Surgery, Montefiore Medical Center, 5Department of Pathology, Montefiore Medical Center

이 논문에서

요약

우리는 쥐에 있는 고분자량 (155 kDa) dextran의 정맥 주입을 사용하여 전이 (TMEM) 출입구 기능 및 암 세포 intravasation의 종양 미세 환경과 관련되었던 과도 혈관 투과성을 평가하기 위한 2개의 방법을 기술합니다. 방법은 살아있는 동물에 있는 활력 화상 진찰 및 면역 형광을 사용하여 고정된 조직 분석을 포함합니다.

초록

암 관련 사망의 가장 흔한 원인은 전이이며, 1 차 종양에서 이차 부위로 암세포를 보급해야하는 과정입니다. 최근에, 우리는 1 차적인 유방암에 있는 암 세포 보급이 폐에 있는 전이성 사이트에 전이의 종양 MicroEnvironment에게 불린 출입구에서만 발생한다는 것을 설치했습니다 (TMEM). TMEM 출입구 번호는 유방암 환자에서 전이성 질환의 먼 재발에 대한 예후입니다. TMEM 출입구는 이 두 세포가 혈액에 단단히 결합되어 있는 TIE2및 VEGF의 상부를 발현하는 경막, proangiogenic 대식세포와 직접 접촉하여 액틴 조절 단백질 Mena를 과발현하는 암세포로 구성됩니다. 혈관 내피 세포. 암세포는 TMEM 관련 대식세포 및 TMEM 관련 메나 발현 암 세포의 관절 활성에 의해 조율된 일시적인 혈관 투과성으로 인해 TMEM 출입구를 통해 인트라스타시화할 수 있다. 이 원고에서, 우리는 TMEM 중재한 과도 혈관 투과성의 평가를 위한 2개의 방법을 기술합니다: 활력 화상 진찰 및 고정된 조직 면역 형광. 두 방법 모두 장점과 단점을 가지고 있지만, 두 가지를 결합하면 TMEM 기능을위한 미세 환경 전제 조건뿐만 아니라 TMEM 매개 혈관 투과성의 가장 완벽한 분석을 제공 할 수 있습니다. 유방암에 있는 전이성 프로세스, 및 가능하게 그밖 모형암때문에, TMEM 출입구를 통해암세포 보급을 관련시키기 때문에, TMEM 출입구 활동의 분석을 위한 잘 확립된 방법을 채택하는 것이 필수적입니다. 여기에 설명된 두 가지 방법은 암세포를 예방하는 제제의 전임상 시험에서 가장 중요한 순진한 동물또는 약리학적으로 처리된 동물에서 TMEM 출입구 활성 분석에 대한 포괄적인 접근법을 제공합니다. TMEM을 통해 보급될 수 있습니다.

서론

암 전이에 대한 우리의 이해에 있는 최근 어드밴스는 상피-중간엽 전이 (EMT) 및 철새/침략적인 암 세포 소집단의 유도가, 그 자체로, 혈류 보급을 위해 충분하지 않다는 것을 발견했습니다 1. 실제로, 종양 관절이 종종 낮은 pericyte 커버리지를 특징으로하기 때문에 암 관련 내피의 전체를 통해 암 세포를 전이하는 것은 매우 투과성이 고도로 투과성이 있다고 생각되었다. 불안정한2,3,4. 종양 내의 불완전한 기능의 높게 암시하더라도, 발암 도중 혈관 수정은 종양 세포가 통제되지 않는 방식으로 혈관을 쉽게 관통할 수 있다는 것을 se 당 증거를 제공하지 않습니다. 종양 세포가 형광 태그가 부착되고 혈관 구조가 형광 프로브의 정맥 주사를 통해 표지되는 Intravital 이미징 (IVI) 연구에서 얻은 통찰력은 종양 혈관이 균일하게 진행되는 동안 형광 프로브 (예 : dextran 또는 양자점)의 정맥 주사를 통해 표지됩니다. 낮은 분자량 덱스 트랜스 (예를 들어 70 kD), 고분자 덱스 트랜스 (155 kD) 및 종양 세포에 투과성 혈관 분기 점에 우선적으로 위치한 내화의 전문 부위에서만 내피를 교차 할 수 있습니다5, 6개 , 7.동물 모델과 인간 환자 유래 물질을 사용한 면역성 화학 (IHC) 분석은 이러한 사이트가 혈관 투과성을 국부적으로 및 일시적으로 조절하는 "출입구"임을 보여주었습니다. 순환을 입력 하는 철새/침략적인 암 세포에 대 한 기회. 이러한 출입구는 "전이의 종양 미세 환경"또는 "TMEM"이라고하며, 예상대로, 그들의 밀도는 유방암 환자에서 전이성 질환을 개발할위험이 증가와 상관 관계 8,9, 10.

각 TMEM 출입구는 세 가지 유형의 세포로 구성되어 있습니다: 시막 대식세포, 액틴 조절 단백질 포유류 를 과도하게 발현하는 종양 세포(Mena), 및 내피 세포, 모두 서로 직접 적인접촉1, 5,9,10,11,12,13. TMEM이 내막통로로서의 기능을 위한 주요 이벤트는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)를 근간 대식세포(14)에 의해 기본 혈관상에국지화방출하는 것이다. VEGF는 내피 세포15,16,17,18,19,일시적인 혈관 누설을 초래하는 현상, 또한 사이의 상모 접합을 방해 할 수 있습니다. IVI 연구에 설명 된 대로 "파열"투과성으로 알려진 5. TMEM 대식세포는 VEGF 매개 TMEM 기능 및 이러한 대식세포의 호밍에 필요한 티로신 키나아제 수용체 TIE2를 경측틈새 시장5,20,21로 발현하는 것으로 나타났다. , 22. 암 세포 보급 및 전이를 조절하는 것 외에도 TIE2+ 대식세포는 종양 혈관 신생의 중심 조절자로 나타났습니다21,22,23, 24,25,26,27,28,29,30,31. 이와 같이, TIE2+ 대식세포는 종양 미세환경 및 전이성 캐스케이드의 주요 조절제의 중요한 성분을 나타낸다.

TMEM 매개 혈관 투과성 (즉, "파열")을 더 잘 개념화하려면 내피 세포 - 세포 접합의 용해와 관련이없는 다른 혈관 투과성 모드와 구별하는 것이 매우 중요합니다. 손상되지 않은 내피 (단단하고 접합 접합이 중단되지 않는 혈관 투과성)의 세 가지 주요 유형이 있습니다 : (a) 섭취 된 물질의 트랜스 시토시스에 결합 될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있습니다. (b) 내피페네스트라를 통한 물질의 수송; (c) 내피 단단한 접합부15,16,17,18,19,32에 의해 조절되는 파라셀룰러 통로를 통한 물질의 수송 , 33세 , 34. 비록 많은 종양에서 조절되었지만, 앞서 언급한 혈관 투과성 모드는 정상 조직 생리학 및 항상성의 맥락에서 주로 기술되어 왔으며, 그 중 극단은 제한된 투과성을 가진 조직이다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽, 혈액-고환 장벽), 또는 풍부한 투과성(예를 들어, 신장 사구체 장치의 페네스티드 모세혈관)34,35,36,37.

다광체 내 화상 진찰 및 다중면역형 광형 현미경 검사법을 사용하여, 우리는 유방 종양에 있는 TMEM 중재한 관 투과성 ("파열") 및 유방 종양에 있는 관 투과성의 그밖 모드 사이에서 구별할 수 있습니다. 이를 달성하기 위해, 우리는 마우스에서 고분자, 형광 표지 프로브의 단일 정맥 주입을 수행합니다. 자발적인 파열 이벤트는 다음 라이브 마우스에서 활력 내 이미징을 사용하여 캡처 할 수 있습니다; 또는 대안적으로, 프로브의 외삽은 혈액 혈관 구조 (예를 들어 CD31+ 또는 Endomucin +) 및 면역형광 현미경 검사법을 사용하여 TMEM 출입구와 공동 국소화 연구에 의해 정량화 될 수있다. 여기에 제시된 프로토콜은 독립적으로 또는 서로 함께 사용할 수 있는 이러한 기술을 모두 설명합니다.

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프로토콜

살아있는 동물을 사용하는 모든 실험은 동물 사용 및 관리 지침 및 규정에 따라 수행되어야합니다. 이 연구에서 설명한 절차는 실험 동물의 관리 및 사용에 관한 국립 보건원 규정에 따라 수행되었으며 알버트 아인슈타인 의과 대학동물 관리 및 사용의 승인을 받았습니다. 위원회 (IACUC).

1. 살아있는 동물 화상 진찰을 이용한 "파열 투과성" 평가

  1. 형광 대식 세포와 마우스 숙주로 합성 유방 종양의 이식
    1. 이식에 적합한 종양 조직의 조각을 생성합니다.
      1. 형광성 마우스를 발현하는 형질전환 마우스를 가진 자발적이고, autochthonous, 유전자 조작 마우스 유방 암 모델 MMTV-PyMT 마우스를 교차하여 마우스 유방암 모델에서 형광 표지 종양을 생성한다38, 39 [예를 들어, 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP), 강화 된 청색 형광 단백질 (ECFP), 또는 덴드라2].
      2. 형광으로 표지된 종양을 가진 MMTV-PyMT 마우스가 2 cm (나이의 대략 10-12 주)의 더 큰 크기로 증가하는 것을 허용하십시오.
      3. MMTV-PyMT 마우스를 베어링하는 종양을 모든 호흡이 멈춘 후 30 초까지 5 % 이소플루란으로 챔버에 배치하여 안락사시.
      4. 자궁 경부 탈구를 수행합니다.
      5. 국소 제모 크림을 사용하여 안락사 마우스의 복부에서 머리카락을 제거합니다.
      6. DMEM/F12 세포 배양 배지를 얼음 위에 놓고 페트리 접시를 놓습니다.
      7. 마우스와 페트리 접시를 얼음 위에 놓고 연기 후드에 넣습니다.
      8. 70% 에틸 알코올로 마우스의 복부를 소독하십시오.
      9. 멸균 장갑과 수술 도구 (멸균 가위, 집게 및 블레이드)를 사용하여 종양을 제거하고 페트리 접시에 넣습니다.
      10. 작은 조각으로 종양을 잘라 (~ 2mm x 2mm x 2mm 크기), 어떤 괴사 부분을 폐기, 그들은 페트리 접시에있는 동안.
    2. 종양 조각을 수용자 숙주에게 이식하십시오.
      1. 유전자 조작형 형광 표지형 대식세포(예: 맥그린40 또는 맥블루 41 마우스)를 사용하여 마우스를 키우기(Csf1r -GAL4VP16/UAS-ECFP)
      2. 형광표지된 대식세포가 있는 FVB 마우스가 ~4-6주 나이로 자라도록 하였다.
      3. FVB 마우스를 담체 가스로서 산소와 함께 5% 이소플루란을 사용하여 챔버에 형광으로 표지된 대식세포로 마취시다.
      4. 마취를 ~3% 이소플루란으로 줄이고 건조를 방지하기 위해 마우스의 눈에 안과 연고를 적용하십시오.
      5. 마우스의 4번째 유선 에서 머리카락을 제거합니다.
      6. 베타딘으로 피부를 깨끗하게 합니다. 절차의 나머지 부분에 걸쳐 멸 균 상태를 유지 하는 것이 중요 하다. 여기에는 멸균 된 기기 및 시약 사용이 포함됩니다.
      7. 작은 절개를 ~2 ~ 3mm 정도 만 4젖꼭지에 열등 하 게 합니다.
      8. 유방 지방 패드가 노출 될 때까지 해부하십시오.
      9. 인공 세포 외 매트릭스에 페트리 접시와 코트에서 종양 조각을 가져 가라.
      10. 4유방 지방 패드 의 밑에 종양을 이식하십시오.
      11. 시아노아크릴레이트 접착제를 사용하여 절개를 닫습니다.
      12. 마취에서 완전히 회복되고 흉골 의 힘을 유지할 수 있을 때까지 동물을 지속적으로 모니터링하십시오. 또한 완전한 회복이 될 때까지 동물을 다른 동물의 회사에 반환하지 마십시오.
      13. 감염을 최소화하려면 동물의 식수 병(8 fl oz)에 1mL의 100 mg/mL 엔로플록사신 항생제를 추가하십시오.
      14. 종양이 만져지도록 하십시오 (~5 mm; ~ 4 주).
      15. 실험에 따라 마우스를 치료 그룹으로 할당하고 해당 되는 경우 해당 처리를 수행합니다.
  2. 바이탈 이미징을 위한 설정
    1. 현미경의 2 광자 레이저와 검출기를 켭니다.
    2. 가열 상자를 켜고 현미경의 x-y 단계를 예열합니다.
    3. 맞춤 제작 스테이지삽입부(42)를 x-y 스테이지에 놓습니다.
  3. 이미징 창준비
    1. 이미징을 위해 설정하기 전에 맞춤형 원형 이미징 창 프레임42를오토클레이브합니다.
    2. 파이펫 또는 인슐린 주사기를 사용하여 얇은 층의 시아노아크릴레이트 접착제를 창틀에 놓고 8mm 원형 커버 유리를 부착합니다.
      참고 : 1) 커버 유리의 투명 한 조리개에 잔류물이 들어가지 않도록하는 것이 중요합니다. 2) 이미징에 사용하기 전에 커버 글래스를 창틀에 적어도 1시간 동안 부착하는 것이 중요합니다.
    3. 소량의 아세톤으로 적신 실험실 와이프를 사용하여 커버 유리의 투명 조리개에 여분의 시아노아크릴레이를 조심스럽게 닦으하십시오.
  4. 화상 진찰 도중 액체 및 형광 염료의 행정을 위한 꼬리 정맥 카테터의 준비
    1. 꼬리 정맥 카테터를 구성하기 위해 폴리에틸렌 튜브의 30cm 조각을 잘라.
    2. 30G 바늘의 바늘 부분을 Luer 테이퍼에서 바늘이 부러질 때까지 바늘을 앞뒤로 부드럽게 구부려 분리합니다.
      참고 : 바늘은 바늘 끝이 아닌 Luer 테이퍼 에 가깝게 개최해야합니다. 이것은 바늘 막대기 상해를 방지하기 위하여 바늘을 붙잡기 위하여 펜치 또는 집게로 행해질 수 있습니다.
    3. 폴리에틸렌 튜브의 한쪽 끝에 바늘의 무딘 끝을 삽입합니다.
    4. 다른 30G 바늘의 날카로운 끝을 삽입하여 Luer 테이퍼를 튜브의 반대쪽 끝에 부착하십시오.
    5. 인산완식 식염수1cc 주사기를 채우고 조립된 카테터의 루어 테이퍼에 부착하고 꼬리 정맥 카테터를 플러시하여 시스템에 기포가 없는지 확인합니다.
    6. 혈관 라벨링을 위해 1cc 주사기에 100 μL의 10mg/kg 155 kDa dextran-tetramelhodamine(TMR) 또는 양자점을 채웁니다.
  5. 이미징용 마우스 준비
    1. 마우스를 100% 산소와 혼합하여 4%-5% 이소플루란을 사용하여 열램프 아래(~1피트 아래)에서 마우스를 분당 1.5-2L의 흐름으로 설정하여 마취시다.
    2. 수술 작업 영역에 열 램프를 켭니다. 이 단계는 수술 중 마우스의 핵심 생리체 온도를 유지하는 데 매우 중요합니다.
    3. 열 램프 아래에 마우스를 놓고 수술 기간 동안 마취를 2 %-3 %로 낮춥니다.
      참고: 과열을 방지하기 위해 열램프를 마우스에서 안전한 거리(~1피트) 떨어진 곳에 보관하십시오.
    4. 눈과 실명의 건조를 방지하기 위해 마우스의 눈에 안과 연고를 놓습니다.
    5. 발가락 핀치 테스트를 수행하여 마우스가 마취되어 있는지 테스트합니다. 동물이 물러나면 이소플루란 복용량을 1 % 늘리고 1-2 분 안에 다시 검사하십시오.
    6. 꼬리 정맥 카테터를 가능한 꼬리의 가장 원위 지점에 삽입하십시오.
    7. 꼬리 정맥 카테터를 꼬리를 감싸고 바늘에 달라붙는 작은 실험실 테이프로 꼬리에 부착하여 빠지지 않도록 합니다.
    8. 적절한 수분을 제공하기 위해 꼬리 정맥 카테터를 통해 PBS의 h당 50 μL을 주입하십시오. 너무 많은 유체 (h당 200 μL 이하) 또는 마우스에 치명적일 수 있으므로 카테터에 거품을 주입하지 않는 것이 중요합니다.
    9. 제모 크림을 사용하여 4 번째와 5번째 유방 땀샘을 통해 복부에 머리카락을 제거하십시오.
    10. 베타딘으로 피부를 깨끗하게 하고 피부가 건조해지도록 합니다.
    11. 성기에 즉시 우수한 세로 중간 절개를 하고 4유방 선의 우수한 측면의 수준까지 절개를 수행합니다.
    12. 절개를 4유방 선의 우수한 측면으로 가로 운반하십시오. 이 시점에서 혈액 공급을 손상 하지 않도록 하는 것이 중요 하다.
    13. 멸균 집게와 가위를 사용하여 조직 플랩을 만드는 복막 떨어져 유방 지방 패드를 해부.
      참고: 피부 플랩 이미징은 중요한 운동 아티팩트및 조직 탈수에 취약합니다. 이들은 앞서 설명한 대로43,44, 플랩의 피부 측에 단단한 고무 조각을 부착하여 (연조직을 경화시키고 신체의 나머지 부분으로부터 격리) 종양을 얕은 이미징으로 배치함으로써 피할 수 있습니다. 수화를 보존할 수 있습니다. 이것은 이 설정에 있는 종양 그리고 주변 조직이 아주 준수하기 때문에 안정한 화상 진찰을 위해 중요합니다.
    14. 플랩의 피부 쪽에 2cm x 2cm를 측정하는 단단한 고무 의 작은 조각 (시아노 아크릴레이트 접착제)을 부착하여 피부 플랩을 안정화. 종양은 고무에 의해 안정화되는 영역의 중심에 있어야합니다.
    15. 노출된 조직을 PBS 방울로 수화하십시오.
    16. 맞춤형 이미징 윈도우 프레임의 바깥쪽 테두리에 시아노아크릴레이트로작은 필름을 바깥쪽 에 바깥쪽에 바포세요.
    17. 커버 유리의 중앙에 PBS(~10-20 μL)의 작은 물방울을 바뜨립니다.
    18. 실험실 닦음으로 주변 플랩 조직을 건조시고 말립니다. 창 틀의 시아노아크릴레이다가 유리의 PBS와 접촉하지 않도록 하는 것이 중요합니다.
    19. 명확한 조리개 중앙에 종양이있는 조직 플랩에 작은 이미징 창을 부착하십시오.
    20. 무대에서 가열 상자를 제거합니다.
    21. 마취 된 마우스와 꼬리 정맥 카테터를 현미경 단계로 옮니다. 꼬리 정맥 카테터가 빠지지 않도록 극도의 주의를 기울이라.
    22. 마우스를 쉬운 위치에 놓습니다.
    23. 마취의 유지를 보장하기 위해 주전자 위에 이소플루란의 코 콘을 놓습니다.
    24. 사용자 정의 x-y 스테이지 플레이트의 보어에 창을 삽입합니다.
    25. 생리적 온도를 유지하기 위해 가열 상자를 다시 무대에 놓습니다.
    26. 클립 센서를 통해 펄스 산소 측정기 프로브를 백 발에 부착하여 동물의 활력 징후를 모니터링합니다.
    27. 천천히 감소 이소플루란 0.5%-1% 적절 한 혈액 흐름을 유지 하 고 마우스를 마 취 를 통해 피하기 위해.
  6. 바이탈 이미징
    참고 : 우리가이 섹션에서 설명하는 이미징은 이전에 설명 된 사용자 정의 내장 된 2레이저 다광자 현미경에서 수행되었다 5,39,45. 간단히 말해서 펨토초 레이저는 880 nm를 중심으로 90펨토초 펄스 레이저 광을 생성하는 데 사용됩니다. 형광광은 이색(Chroma, Z720DCXXR)에 의해 여기광으로부터 분리된 후 4개의 동시에 획득하는 검출기(청색 = 447/60, 녹색 = 520/65 및 빨간색 580/60; 중앙 파장/대역폭)로 검출됩니다. 현미경 스탠드에는 25x, 1.05 NA (수치 조리개) 긴 작동 거리 (2mm) 대물 렌즈가 포함되어 있습니다. 우리가 주문을 받아서 만들어진 현미경을 사용하는 동안, 아래에 기술된 프로토콜은 또한 상업적으로 이용가능한 어떤 다광자 현미경에서 달성될 수 있다는 것을 주의하는 것이 중요합니다.
    1. 25x, 1.05 NA 현미경 대물과 창의 커버 유리 사이에 증류수를 떨어뜨려 광학 접촉을 합니다.
    2. 현미경 접안 렌즈를 사용하여 창 표면 근처에 형광 종양 세포가있는 영역에 초점을 맞춥니다.
    3. 흐르는 혈관과 라벨이 부착된 대식세포를 찾아보세요. 혈관의 역학을 평가하기 위해 흐르는 혈관을 가지고하는 것이 중요합니다.
    4. 현미경을 다광자 모드로 전환합니다.
    5. 약 50 μm를 측정하는 z 계열의 상한및 하한을 설정합니다.
      1. 초점 조절기를 사용하여 가장 피상적인 위치에서 원하는 시작 위치로 목표를 이동하고 Z 위치 상단 버튼을 클릭하여 소프트웨어 내에서 이 위치를 0으로 표시하여 z 계열의 상한을 설정합니다.
      2. z 계열의 하한을 가장 깊은 층(일반적으로 더 작은 종양의 경우 상단에서 50-70 μm)으로 이동하고 Z 위치 하단 버튼을 클릭합니다.
      3. z-스텝 크기를 5 μm로 설정합니다.
    6. Time-Lapse 패널 버튼을 클릭하고 수집 사이의 시간 간격을 최소 10초로 설정하여 대물 렌즈 위의 물을 보충할 적절한 시간을 제공합니다. 이것은 장시간 경과 하는 동안 목표에 스퀴즈 파이펫으로 수동으로 이루어집니다.
    7. 꼬리 정맥 카테터에 PBS로 주사기를 제거하고 155 kDa dextran-TMR (테트라메틸 로다민)을 포함하는 다른 주사기로 교체하십시오.
    8. 꼬리 정맥 카테터를 통해 155 kDa dextran-TMR의 100 μL을 주입하십시오.
    9. 주입 후 TMR 주사기를 PBS 주사기로 교체하십시오.
    10. Z 스택 및 타임랩스 버튼을 클릭한 다음 기록 버튼을 클릭하여 z-스택 타임랩스 이미징을 획득합니다.
    11. 동물의 적절한 수분을 유지하기 위해 30-45분마다 50 μL의 PBS를 주입합니다. 유체 과부하가 발생할 수 있으므로 시간에 200 μL 이상을 주입하지 마십시오.
  7. 안락사
    1. 이소플루란을 5%로 늘리고, 호흡이 중단된 후 30s까지 코콘으로 동물을 5% 이소플루란 이하로 유지합니다.
    2. 스테이지에서 마우스를 제거합니다.
    3. 자궁 경부 탈구를 수행합니다.
  8. 이미지 처리
    1. 모든 이미지를 ImageJ에 로드하고 5차원 하이퍼스택(x, y, z, t 및 색상 채널)으로 포맷합니다.
    2. 확립된 방법38을사용하여 스펙트럼 중첩(즉: GFP 및 CFP)의 분리 및 하이퍼스택으로부터의 x-y 드리프트 제거를 수행한다.
    3. 밝기 및 대비 조정을 사용하여 배경 신호가 표시되도록 혈액 채널의 흰색 수준을 높입니다.
    4. 각 z 슬라이스에 대해 각 영화를 주의 깊게 검사하여 일시적인 혈관 누출("버스트")의 징후를 검사합니다. 동영상을 빠른 프레임 속도(40fps)로 실행하면 이러한 식별에 도움이 될 수 있습니다.
    5. 버스트가 확인되면 이 채널의 밝기를 정상 수준으로 되돌리고 하이퍼스택을 이 영역과 z 슬라이스로 자른다.

2. 고정 조직 분석을 이용한 혈관 외 의 외선평가

  1. 종양 및 시료 준비
    참고 : 이 프로토콜의 2nd 부분은 유방 종양이 유방 암종 (즉, MMTV-PyMT)의 정형 면역 이식 마우스 모델에서 수확되었다고 가정합니다. 이 모형은 형광표지한 종양이 이 시점에서 필요하지 않더라도, 프로토콜의 1st 부분에 기술된 것과 동일할 수 있었습니다.
    1. 실험 파이프라인(즉, 약물 치료 등)의 종료 후, 10mg/mL 100 μL의 꼬리 헛된 주사를 수행하여 155 kDa dextran-tetramethyl 로다민, 마우스를 희생하기 전에 1 시간.
    2. 마우스를 희생하고 유방 종양을 수확하십시오.
    3. 48-72 시간 동안 10 % 포르말린에서 종양을 수정하고 파라핀 포함으로 진행하십시오.
    4. 마이크로토메를 사용하여 포르말린 고정 파라핀 내장(FFPE) 조직에서 5 μm 두께의 순차 슬라이드 2개를 자른다. 한 슬라이드는 덱스트렌 을 염색하는 데 사용되며 다른 슬라이드는 TMEM 트리플 IHC를 수행하는 데 사용됩니다.
      참고: TMEM 삼중 면역성 화학 프로토콜은 다른 곳에서 10개에대해 기술되었다.
  2. 두 개의 순차적 섹션 중 첫 번째 에 대한 염색 및 스캐닝
    1. 슬라이드를 표준 탈파라핀화 프로토콜로 제출합니다. 여기에는 자일렌(각 10분)에 2개의 후속 침수가 포함되며, 이어서 연속적으로 희석된 알코올 용액에서 탈수(100%, 95%, 70%, 및 H2O에서 50% EtOH각 침지 2분)를 포함한다.
    2. 20 분 동안 구연산염 (pH 6.0 조정)에 잠긴 섹션을 가열 (끓는 점에 가까운)에 의해 항원 검색을 수행합니다.
    3. 샘플을 실온으로 15-20 분 동안 식힌 다음 PBS 3x로 2 분 동안 씻으십시오.
    4. 차단 완충액에서 60-90 분 동안 차단 (10 % FBS; 1 % BSA; 0.0025 % 생선 피부 젤라틴; 0.05 % PBST, 즉 0.05 % 트웬-20을 가진 PBS).
    5. 엔도뮤신과 TMR을 각각 표적화하는 1차 쥐 및 토끼 항체의 혼합물로 샘플을 배양한 다음, 각각 PBST 3x, 2분씩 세척한다.
    6. 래트 IgG(Alexa-647에 공액)와 토끼 IgG(Alexa-488로 공액)에 대하여 이차 당나귀 항체의 혼합물로 샘플을 인큐베이션한 다음, PBST 3x 2 분 각각으로 세척한다.
    7. 일상적인 DAPI 염색(즉, 5-6분 동안 DAPI 용액에 침지)을 수행하고, 글리세롤이 없는 "하드" 장착 매체를 사용하여 슬라이드를 장착하고 스캔할 때까지 어두운 곳에 보관합니다.
    8. 최적의 결과를 얻으려면 디지털 전체 슬라이드 스캐너에서 슬라이드를 스캔합니다.
  3. 이미지 분석
    1. 디지털 병리학에 적합한 소프트웨어를 사용하여 케이스당 10개의 고전력 필드(HHPF)를 캡처합니다.
    2. 엔도뮤신(빨간색) 및 TMR(녹색) 채널을 TIFF로 별도로 저장합니다.
    3. ImageJ를 사용하여 TIFF 파일을 업로드하고 8비트 이미지로 변환합니다.
    4. 8비트 이미지를 네거티브 컨트롤 수준으로 임계값화하고, 엔도뮤신 및 TMR "마스크"를 보여주는 두 개의 비내화 이미지를 생성합니다.
    5. 이진 도구에서 엔도뮤신 마스크의 구멍 채우기를 선택합니다.
    6. 관심 영역을 생성하고 저장: 1) 임계값 dextran ROI로 임계값 dextran 이미지 (ROI1), 2) "혈관 ROI"(ROI2)로 임계 엔도뮤신 이미지, 3) "혈관 ROI"(ROI3), 4) 교차로 반전 엔도뮤신 이미지 " 혈관 외 ROI" 및 "Dextran ROI" 이미지(ROI1+ROI3)를 "엑스트라넥스 ROI"(ROI4)로, 5) 전체 이미지를 "종양 ROI"(ROI5)로 합니다.
    7. ROI4 영역을 ROI5 영역으로 나누고 100을 곱하여 전체 종양에서 엑스트라틱이 커버하는 백분율 영역을 생성합니다.
    8. 케이스당 10-20개의 HHPF에 대한 과정을 반복하고(조직 가용성에 따라 다름) 각 케이스에 대해 평균 혈관 외 Dextran(%영역)을 생성합니다.

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결과

이 프로토콜 문서에 설명된 실험 절차는 그림 1 A-C에간략하게 요약되고 설명되어 있습니다.

TMEM 매개 혈관 투과성("파열 활성")을 측정하고 다른 혈관 투과성 모드(즉, 소개에서 설명한 대로 세포 간 및 파라셀룰러)의 실험 소음을 줄이기 위해 정맥 내(i.v.) 155 kDa Dextran과 같은 고분자량 프로브를 테트라메틸 로다민에 공액화합니다. 낮은 분자량 덱스트랜스는 혈관 투과성의 세 가지 모드를 구별하지 않았다. 우리의 이전 경험은 155 kDa TMR-Dextran의 전신 순환이 유선 및 폐와 같은 두 정상 조직의 혈관 구조뿐만 아니라 신생물 조직(그림2A,B)을효율적으로 표시했다는 것을 지적했습니다. 원발성 유방암 및 유방암은 폐에서 전이 (그림2

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토론

여기에서는 TMEM 출입구에 존재하고 혈관 이체의 중단과 연관된 특정 유형의 혈관 투과성을 시각화하고 정량화하기 위해 적용할 수 있는 두 가지 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 혈관 투과성의 이 모형은5위에 설명된 것과 같이 삼자 TMEM 세포 복합체에 의해 일시적이고 통제됩니다. TMEM 관련 혈관 투과성을 확인하고 정량화하는 능력은 종양에 대한 기존의 세포 독성 요법의 효과를 조사하는 전이성 암 세포 미세 환경의 평가뿐만 아니라 전임상 연구에 매우 중요합니다. 미세 환경뿐만 아니라 표적 및 비 표적 치료의 전이성 전이성 잠재력. 중요한 것은, 우리는 이 평가가 고정된 조직에 있는 선인 화상 진찰 또는 면역 형광에 의해 행해질 수 있다는 것을 여기에서 설명했습니다. 두 방법 모두 장점과 단점이 있습니다. 혈관 투과성의 동적 프로세스를 직접 시각화 할 수 있지만 전문 장비와 훈련이 필요합니다. 한편, 고정 조직에서 수행되는 면역형광은 정적 이미지만을 제공하지만 대부분의 실험실에서 일상적으...

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공개 사항

저자는 이해 관계의 충돌을 공개하지 않습니다.

감사의 글

우리는 화상 진찰 지원을 위한 알버트 아인슈타인 의과 대학에 있는 분석 화상 진찰 시설 (AIF)에게 감사하고 싶습니다. 이 작품은 NCI (P30CA013330, CA150344, CA150324, CA216248), SIG 1S10OD019961-01, 그루스 -리퍼 바이오 포토닉스 센터 및 통합 이미징 프로그램, 몬테피오레의 루스 L Kirsch 2 의 교육에서 보조금에 의해 지원되었다. 종양 미세 환경 연구 (CA200561).

GSK는 원고를 공동 작성하고, 도 면 1C 및 3B에 대한 이미징을 수행하고, 고정 조직 분석 프로토콜을 개발하고, 모든 데이터를 분석하고 해석합니다. JMP는 원고를 공동 작성하고, 도 1B,2C 및 3A에 대한 수술 및 사내 영상을 수행; LB & AC는 도 2B에 대한 수술 및 인바이탈 이미징을 수행; RJ는 도 2A에 대한 수술 및 활력 내 이미징을 수행; JSC는 원고를 공동 작성하여 모든 데이터를 분석하고 해석했습니다. MHO는 원고를 공동 작성하여 모든 데이터를 분석하고 해석했습니다. DE는 도 2D를 위한 수술 및 활력 내 이미징을 수행하고, 원고를 공동 작성하고, 고정 조직 분석 및 활력 내 이미징 프로토콜을 개발하고, 모든 데이터를 분석하고 해석했다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
안티 토끼 IgG (Alexa 488)Life Technologies CorporationA-11034
안티 랫트 IgG (Alexa 647)Life Technologies CorporationA-21247
소 혈청 알부민Fisher ScientificBP1600-100
구연산염 Eng Scientific Inc9770
커버 유리 슬립전자 현미경 과학72296-08
시아노아크릴레이트 접착제헨켈 접착제1647358
DAPIPerkin ElmerFP1490
덱스트란-테트라메틸-로다민시그마 AldrichT1287
DMEM/F12Gibco11320-033
엔도무신(1차 항체)Santa Cruz Biotechnologysc-65495
엔로플록사신바이엘84753076 V-06/2015
소 태아 혈청시그마 알드리치F2442
피쉬 스킨 젤라틴피셔 사이언티픽G7765
인슐린 주사기벡톤 디킨슨309659
이소플루오란헨리 샤인NDC 11695-6776-2
마트리겔코닝CB40234인공 세포 외 매트릭스
바늘 (30 G)Becton Dickinson305128
Phosphate Buffered SalineLife Technologies CorporationPBS
폴리에틸렌 튜빙Scientific Commodities IncBB31695-PE/1
맥박 산소 농도계Kent ScientificMouseOx
Puralube Vet OintmentDechraNDC 17033-211-38
Quantum DotsLife Technologies CorporationQ21561MP
RubberMcMaster Carr1310N14
TMR (primary antibody)InvitrogenA6397
Tween-20MP BiologicalsTWEEN201
XyleneFisher Scientific184835

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