Method Article

이중 루시파라제 기자 시스템을 통해 포유류 세포에서 CRISPR 플라스미드 의 건설 및 녹아웃 효율 검출

DOI:

10.3791/59639

⸱

December 5th, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Qingdao Agricultural University, Qingdao, China, 2University of Cantabria, Santander y Torrelavega, Spain

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기서, CRISPR 효소와 관련 단일 가이드 RNA(sgRNAs)를 모두 발현하는 플라스미드의 효율적인 생성을 위한 간소화된 방법을 설명하는 프로토콜을 제시한다. 이 sgRNA/CRISPR 벡터와 이중 루시파라제 리포터 벡터를 결합하여 포유류 세포의 공동 배빙을 통해 녹아웃 효율을 평가할 수 있습니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

비록 매우 효율적이지만 CRISPR 효소에 의한 게놈 부위를 수정하려면 표적 부위에 고유한 sgRNA 생성이 사전에 필요합니다. 이 작업은 DNA 염기서열 분석 전에 PCR에 의한 양성 식민지를 효율적으로 검출할 수 있는 전략을 사용하여 효율적인 sgRNA 벡터의 시공으로 이어지는 주요 단계를 설명합니다. CRISPR 시스템을 이용한 효율적인 게놈 편집에는 매우 효율적인 sgRNA가 필요하기 때문에 시간과 노력을 절약하기 위해 후보 sgRNA 표적을 사전 선택해야 합니다. 이중 루시파라제 기자 시스템은 단일 가닥 어닐링을 통해 이중 가닥 브레이크 수리를 검토하여 녹아웃 효율성을 평가하기 위해 개발되었습니다. 여기서, 우리는 특정 유전자 편집을 위한 후보 sgRNA 벡터로부터 선호하는 xCas9/sgRNA 표적을 픽업하기 위하여 이 리포터 시스템을 이용합니다. 설명된 프로토콜은 10일 안에 바람직한 sgRNA/CRISPR 효소 벡터를 제공할 것이다(적절하게 설계된 올리고뉴클레오티드로 시작).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CRISPR sgRNA는 게놈 표적 서열1,2에상보적인 20-뉴클레오티드 서열(protospacer)을 포함한다. 매우 효율적이지만, CRISPR/Cas 시스템이 주어진 게놈 부위를 수정할 수 있는 능력은 대상 부위(들)에 고유한 효율적인 sgRNA를 운반하는 벡터의 생성을 필요로한다 2. 이 백서는 sgRNA 벡터 생성의 주요 단계를 설명합니다.

CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 성공적인 게놈 편집을 위해 고효율 sgRNAs를 사용하는 것은 중요한 전제 조건3,4,5입니다. 게놈 편집에 사용되는 엔지니어링 뉴클레아제는 상이한 표적 로시1에서다양한 효율성을 나타내기 때문에, 시간과 노력을 절약하기 위해 후보 sgRNA 표적의 사전 선택이 필요하다6,7,

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Protocol

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1. sgRNA 올리고뉴클레오티드 설계

  1. Cas-Designer 온라인 도구(http://www.rgenome.net/cas-designer/)와 같은 온라인 도구를 사용하여 sgRNAs를 디자인합니다. PAM 시퀀스는 사용되는 Cas9을 기반으로 중요합니다. xCas9의 경우 관련 PAM 시퀀스는 NG이며 이전 참조된 Cas-Designer 온라인 도구는 xCas9 관련 sgRNA를 생성할 수 있습니다.
    1. 온/오프 타겟 예측(http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design)11에대한 알고리즘을 포괄하는 sgRNA 설계 도구를 사용합니다. 점수0.2 이상의 점수가 선호됩니다.
  2. 최적의 스크리닝을 위한 최대 3개의 유전자 편집 표적을 선택하십시오(예를 들어, T1, T2 및 T3는양 DKK2 엑슨 1 유전자 표적을 대상으로 설계하였다[표 1]).

2. 올리고뉴클레오티드 수정

  1. sgRNA 올리고뉴클레오티드를 수정하려면 프로토스페이서 서열(예: TGCCTGCTCCTACTGGCCGC [20 nt])을 유지하여....

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Results

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이 프로토콜에 설명된 방법은 sgRNA 및 xCas9 발현 벡터의 시공을 위한 다음 상대적으로 높은 유전자 표적화 효율을 가진 sgRNA 올리고스의 최적화 스크리닝을 위한 것이다. 여기서 는 양 DKK2 엑슨 1에 대한 3sgRNA 표적의 대표적인 예를 표시합니다. SgRNA 및 xCas9 발현 벡터는 벡터 백본(그림2)을예소화한 다음, 어닐링 올리고 쌍을 통해 짧은 이중 가닥 DNA 단편을 연이어 계게 함으로써 생성될 수 있다. 양성 식민지는 특정 프라이머 쌍을 통해 검출될 수있었다(도 3). 양 DKK2 엑슨 1의 440bp DNA 단편은 아스시와 살리를 이용한 이중 소화를 사용하여 pSSA-Dual 플라스미드15로 스캐폰되어 pSSA-Dual-DKK2를 생성했다. pX330-xCas9-T1, pX330-xCas9-T2 및 pX330-xCas9-.......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리가 여기서 설명한 sgRNA 벡터 복제 절차는 올리고뉴클레오티드 주문 및 벡터 시퀀싱에서 파생된 대부분의 비용으로 sgRNAs의 효율적인 생산을 용이하게 합니다. 설명된 방법은 사용자가 CRISPR/Cas9와 함께 사용하기 위해 sgRNA를 생성할 수 있도록 설계되었지만, 프로토콜은 Cas9 정형소또는 Cpf1과 같은 다른 RNA 유도 엔도넬리스와 함께 사용하기 위해 쉽게 적응할 수 있으며 벡터 백본 및 올리고뉴클레오티드 과열에 대한 사소한 수정을 도입할 수 있습니다.

위에서 설명한 프로토콜은 적절하게 설계된 올리고뉴클레오티드로 시작할 때 10일 이내에 선호하는 sgRNA 표적을 제공할 것입니다. 여기에는 sgRNA 설계(1h, Steps 1 - 2), 희석, 알리쿼트 및 올리고뉴클레오티드의 어닐링(30분) 단계 3), sgRNA 발현 벡터의 소화 및 정제(3h, Step 4), sgRNA 올리고뉴클레오티드의 복제를 예전형 빈 벡터로 (하룻밤, 단계 5 - 6), 콜로니의 P.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

Acknowledgements

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이 프로젝트는 중국 국립 자연과학 재단(31301936)의 중국 산둥성 일류 초원 과학 징계 프로그램에 의해 지원되었습니다. 31572383), 공익농업과학연구특별기금(201403071), 우유 제품 품질 및 안전의 국가 위험 평가 주요 특별 프로젝트(GJFP201800804) 및 칭다오 인민생계과학기술 프로젝트(19-6-1-68-nsh, 14-45-25-25-25-45-25-25-45-25-25-25-45-25-45-25-45-25-45-45-45-25-45-25-45-25-45-25-25-45-25-45-45-25-45-25-25-45-25-45-25-25-25-25-45-25-25-45-25-45-25-45-25-45-25-25-45-25-45-45-45-25-25-25-25-45-25-25-25-45-45-45-25-25-25-45-25 13-1-3-88-nsh).

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
차세대 풀 터치 스크린 그라디언트 PCR 기기LongGeneA200표적 유전자 증폭
AscI 제한 효소New England BiolabsR0558V절단 대상 벡터
BbsI 제한 효소New England BiolabsR0539S절단 대상 벡터
클린 워크벤치AIRTECHSW-CJ-2FD/VS-1300L-U국부적으로 높은 청정 공기 환경 DH5 &alpha를 생성하는 수직 층류 형태의 부분 정화 장치
; 유능한 세포TaKaRaK613플라스미드 벡터 변환
이중 루시페라 리포터 분석 시스템PromegaE1910듀얼 루시페라 리포터 분석
전기 온도 조절 수조Sanfa Scientific InstrumentsDK-S24수조에서 일정한 온도에 의한 가열 시약
전기 영동Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.DYY-6C제어 전압, 전류 등
Eppendorf Reference 2Eppendorf China Ltd.참고 2의 흔적을 정확하게 그리고 전송
Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.WD-9413B전기 영동 젤 이미지 분석을 위해
GloMax 20/20 광도계PromegaE5311이중 루시페라제 활성 감지
고속 냉장 원심 분리기BMH시그마 3K15핵산 추출 및 정제
지능형 생화학 인큐베이터Sanfa Scientific InstrumentsSHP-160효소 분해 실험에 적합한 온도 환경 제공
LB Broth AgarSangon BiotechA507003-0250E.coli
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent KitThermo FisherL3000015DNA Transfection
SalI 제한 효소New England BiolabsR3138V절단 타겟 벡터
SanPrep Column DNA Gel 추출 키트Sangon BiotechB518131-0050재활용 DNA 단편
SanPrep Column Plasmid Mini-Preps KitSangon BiotechB518191-0100플라스미드 DNA
추출 T4 DNA LigaseNew England BiolabsM0202VLink DNA fragment
TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0TaKaRa9761DNA 정제
수직 압력 증기 살균기JIBIMEDLS-50LD실험실 장비에서 박테리아, 곰팡이 및 기타 미생물을 죽이는 고온 및 오토클레이브
수조 온도 조절기Changzhou Guoyu Instrument Manufacturing Co., Ltd.SHZ-82공기와의 접촉에 좋은 박테리아를 계속 흔들게 하십시오.
액체 겔 이미징 분석기

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, H., et al. A surrogate reporter system for multiplexable evaluation of CRISPR/Cas9 in targeted mutagenesis. Scientific Reports. 8 (1), 1042(2018).
  2. Nageshwaran, S., et al. CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems.....

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CRISPR PlasmidssgRNA ConstructionDual Luciferase ReporterKnockout EfficiencyMammalian CellsxCas9 VectorBbs1 DigestionColony PCR ScreeningLuciferase AssayT7EI Assay

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