방법 논문

라파마이신/mTOR 상호 작용을 연구하기 위한 반정량적 약물 선호도 반응 형 표적 안정성(DARTS) 분석

DOI:

10.3791/59656

⸱

2019년 8월 27일

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1Department of Orthopaedic Surgery, New York University Medical Center, 2Department of Cell Biology, New York University School of Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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이 연구에서는 단백질 안정성의 변화를 모니터링하고 단백질-리간드 상호작용의 친화성을 추정하여 DARTS 실험의 데이터 분석 기능을 향상시켰습니다. 상호 작용은 두 개의 곡선으로 플롯 될 수있다: proteolytic 곡선과 용량 의존 곡선. 우리는 모범사례로 mTOR-rapamycin 상호 작용을 사용했습니다.

초록

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약물 선호도 반응형 표적 안정성(DARTS)은 신규한 소분자 단백질 표적을 검출하는 강력한 방법입니다. 그것은 알려진된 작은 분자-단백질 상호 작용을 확인 하 고 천연 제품에 대 한 잠재적인 단백질 목표를 찾는 데 사용할 수 있습니다. 다른 방법에 비해 DARTS는 기본, 수정되지 않은 작은 분자를 사용하며 간단하고 작동하기 쉽습니다. 이 연구에서는 단백질 안정성의 변화를 모니터링하고 단백질-리간드 상호작용의 친화성을 추정하여 DARTS 실험의 데이터 분석 기능을 더욱 향상시켰습니다. 단백질-리간드 상호작용은 단백질 용해 곡선과 용량 의존 곡선의 두 가지 곡선으로 플롯될 수 있습니다. 우리는 우리의 프로토콜의 설립을위한 예시 사례로 mTOR- 라파마이신 상호 작용을 사용했다. 프로테올리화 곡선으로부터 우리는 pronase에 의한 mTOR의 프로테오리시스가 라파마이신의 존재에 의해 억제되었다는 것을 보았다. 용량 의존성 곡선은 라파마이신 및 mTOR의 결합 친화성을 추정할 수 있게 해 주었으며, 이를 통해 우리는 라파마이신및 mTOR의 결합친화도를 추정할 수 있게 하였다. 이 방법은 신규표적 단백질을 정확하게 식별하고 약물 표적 참여의 최적화를 위한 강력하고 간단한 방법이 될 가능성이 높습니다.

서론

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소분자 표적 단백질을 식별하는 것은 잠재적인 치료 약물의 기계학적이해 및 개발에 필수적이다 1,2,3. 친화성 크로마토그래피는 소분자의 표적 단백질을 식별하는 고전적인 방법으로서, 좋은결과를4,5. 그러나, 이 방법은 소분자의 화학적 변형이 종종 감소되거나 변형된 결합 특이성 또는 친화도를 초래한다는 점에서 한계가 있다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 몇몇 새로운 전략은 최근에 작은 분자의 화학적 변형 없이 작은 분자 표적을 확인하기 위하여 개발되고 적용되었습니다. 라벨없는 소분자의 표적 식별을 위한 이러한 직접적인 방법은 약물 친화성반응형 표적 안정성(DARTS) 6, 산화율(SPROX)7,세포열시프션 분석법(CETSA) 8을 포함한다. ,9, 및 열 프로테오메 프로파일링 (TPP)10. ....

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프로토콜

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1. 세포를 수집하고 포액

  1. Dulbecco의 변형 된 독수리 배지 (DMEM)를 사용하여 10 % 태아 소 혈청, 2 mM 글루타민 및 1 % 항생제를 사용하여 293T 세포를 성장시다. 37°C에서 5% CO2 미만의배양물.
    참고: 세포의 성장 상태는 후속 실험의 안정성에 영향을 미칠 수 있습니다.
  2. 80\u201290% 합류에 도달할 때까지 배양에서 세포를 확장합니다.
  3. 345 μL의 세포 용해 시약 (재료 표참조) 20x 프로테아제 억제제 칵테일 25 μL, 불소 나트륨 1개 중 25 μL, 100 mM β-글리세로포스페이트 50 μL, 50 mM 의 50 μL 의 50 μL 또는 50 mmmmmmmmmm. 얼음에 진정 된 라시스 버퍼를 유지 합니다.
    참고: 다양한 세제(예: 트리톤 X-100 또는 NP-40)가 있는 기타 용해 완충제는 변성되지 않는 한 DARTS와 함께 사용할 수 있습니다. 막 단백질 또는 핵 단백질은 세포 용해액에 0.4% 트리톤 X-100 또는 0.4% NP-40을 첨가하여 추출될 수 있다.
  4. 차가운 인산염 완충식염수(PBS)로 세포를 두 번 세척합니다.
  5. 세포 스크레이퍼를 사용하여 적절한 양의 세포 용해 완충액으로 세포를....

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결과

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실험의 플로우 차트는 그림1에 설명되어 있습니다. 쿠마시 블루 염색의 결과는 그림2에 나와 있습니다. 작은 분자를 가진 배양은 proteolysis에 대하여 보호를 부여합니다. 차량 제어를 통해 라파마이신으로 인큐베이션하여 보호되는 것으로 보이는 3개의 밴드가 발견되었습니다. 프로테오리틱 곡선 실험의 예상 결과는 그림3에 나와 있습니다. 원리증명으로, 우리는 약물 라파마이신25의표적이 되는 잘 연구된 단백질 mTOR을 조사했습니다. 서양 블로팅은 낮은 pronase에서 mTOR 단백질의 존재를 보여줍니다: 단백질 비율 및 증가 비율과 의 감소 및 손실 (그림3A). 프로나제에 의한 mTOR의 프로테오리즘은 라파마이신의 존재에 의해 명백하게 억제되.......

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토론

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DARTS는 열화에 대한 단백질 결합의 보호 효과를 이타함으로써 작은 분자 표적을 식별할 수 있습니다. DARTS는 소분자(26)의 어떠한 화학적 변형 이나 고정을 필요로 하지 않는다. 이것은 작은 분자가 그들의 직접적인 결합 단백질 표적을 결정하기 위하여 이용될 수 있습니다. 고전 DARTS 방법에 대한 표준 평가 기준은 겔 염색, 질량 분석 법 및 서부 블로팅12,13을포함한다. 고전적인 방법론은 또한 이러한 데이터를 정량적으로 분석 할 수 있다고 언급하지만 그러한 예는 제공되지 않습니다. 여기서, 우리는 세포 열 시프트 분석법(CETSA)의 원리를 사용하여 데이터를 반정적으로 분석하고, 다트 분석8의 효용성을 증가시키는 CESTA(Tm 및 EC50)에 의해 제공된 것과 유사한 파라미터를 얻는다. 리간드-표적 상호작용은 프로나제:단백질 .......

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

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이 작품은 NIH 연구 보조금 R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484, 및 DOD 연구 보조금 W81XWH-16-1-0482에 의해 부분적으로 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
100X 프로테아제 억제제 칵테일Sigma-AldrichP834020X로 희석
ATCCCRL-3216DMEM 배지 10% FBS
아세트산Sigma-AldrichA6283
BCA 단백질 분석 키트Thermo Fisher23225
염화칼슘Sigma-AldrichC1016
Cell scraperThermo Fisher179693
Coomassie Brilliant Blue R-250 염색 용액Bio-Rad1610436
Dimethyl sulfoxide(DMSO)Sigma-AldrichD2650
GraphPad PrismGraphPad SoftwareVersion 6.0statistical analysis and drawing software
Hydrochloric acidSigma-AldrichH1758
ImageJNational Institutes of Health버전 1.52이미지 처리 및 분석 소프트웨어
M-PER 세포 용해 시약Thermo Fisher78501
인산염 완충 식염수(PBS)CorningR21-040-CV
PronaseRochePRON-RO10mg/ml
염화나트륨Sigma-AldrichS7653
불화나트륨시그마-알드리치S7920
오르토바나데이트나트륨시그마-알드리치450243
피로인산나트륨시그마-알드리치221368
트리즈마 염기시그마-알드리치T1503pH 8.0
&베타;-글리세로인산시그마-알드리치G9422
초순수 293T 세포주로 염

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rask-Andersen, M., Masuram, S., Schioth, H. B. The druggable genome: Evaluation of drug targets in clinical trials suggests major shifts in molecular class and indication. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 54, 9-26 (2014).
  2. O'Connor, C. J., Laraia, L., Spring, D. R.

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재인쇄 및 허가

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Protein stabilityProteolytic curveDose dependence curvemTOR rapamycin interactionWestern blotBCA assayPronase digestionCell lysisSDS PAGE gel

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