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방법 논문

소형 돼지에서 1 차 대동맥 내피 세포의 격리 및 배양

8.4K 조회수

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DOI:

10.3791/59673

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2019년 8월 14일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nephrology, Shenzhen Longhua District Central Hospital, Affiliated Central Hospital of Shenzhen Longhua District, Guangdong Medical University, 2Shenzhen Xenotransplantation Medical Engineering Research and Development Center, Shenzhen Second People's Hospital, First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen University School of Medicine, 3Department of Medical Laboratory, Shenzhen Longhua District Central Hospital, Affiliated Central Hospital of Shenzhen Longhua District, Guangdong Medical University, 4Department of Endocrinology, Shenzhen Longhua District Central Hospital, Affiliated Central Hospital of Shenzhen Longhua District, Guangdong Medical University, 5Xenotransplantation Program, Department of Surgery, University of Alabama at Birmingham, 6People's Hospital of Longhua

이 논문에서

요약

소형 돼지로부터 1차 돼지 대동맥 내피 세포(pAECs)를 분리하는 효과적인 효소 방법이 설명되어 있다. 단리된 1차 pAECs는 이종이식에서 면역 및 응고 반응을 조사하는데 사용될 수 있다.

초록

Xenotransplantation은 말기 장기 부전 환자를 위한 인간 기관의 부족을 해결하는 유망한 방법이고, 돼지는 적당한 기관 근원으로 여겨됩니다. 면역 거부 및 응고는 이종이식의 성공을 위한 2개의 중요한 장애물입니다. 혈관 내피 세포 (EC) 손상 및 기능 장애는 이종이식에서 염증 및 응고 반응의 발달에 중요하다. 따라서, 돼지 대동맥 내피 세포(pAECs)의 분리는 면역 거부 반응 및 응고 반응을 조사하기 위해 필요하다. 여기에서, 우리는 소형 돼지에서 고도로 정제된 pAE의 격리, 특성화 및 확장을 위한 간단한 효소 접근법을 개발했습니다. 첫째, 미니어처 돼지는 케타민으로 마취되었고, 대공의 길이를 절제시켰다. 둘째, 대치의 내피 표면은 0.005 % 콜라게나아제 IV 소화액에 15 분 동안 노출되었습니다. 셋째, 대초원의 내피 표면은 세포 스크레이퍼 (<10 회)로 한 방향으로만 긁어 내고 (<10 번), 및 의 과정에서 압축되지 않았습니다. 긁. 마지막으로, 제3일의 단리된 pAECs, 및 제1및 2항 후에, 항-CD31 항체를 가진 유세포측정에 의해 확인되었다. CD31 양성 세포의 백분율은 각각 97.4% ±1.2%, 94.4% ±1.1%, 및 92.4% ±1.7%(평균 ±SD)였다. 콜라게나아제 IV의 농도, 소화 시간, 방향, 스크레이핑의 빈도 및 강도는 섬유아세포 오염을 줄이고 고순도 및 많은 수의 EC를 얻는 데 매우 중요합니다. 결론적으로, 우리의 효소 방법은 소형 돼지 대원으로부터 EC를 분리하는 고효율 방법이며, 세포는 이종이식에서 면역 및 응고 반응을 조사하기 위해 시험관 내에서 확장 될 수 있습니다.

서론

이식에 사용할 수 있는 장기의 부족은 전세계적으로 눈에 띄는 문제 1. 중국 적십자사에 따르면, 2018년 중국에서 말기 장기 부전 환자 중 소수의 환자만이 적합한 장기를 받았다고 합니다.

Xenotransplantation은 장기 부족 문제를 해결할 수있는 유망한 방법입니다. 돼지 장기는 해부학및 생리적 유사성 때문에 인간에게 가장 적합한기관으로 간주되며 2,3. 돼지 이종이식의 실패는 주로 영장류 면역 거부 및 응고 반응과 관련이 있다. 돼지 내피 세포(ECs)는 이들 세포가 항체, 보체, 사이토카인 및 면역 세포(예를 들어, T 세포, B 세포 및 대식세포)를 포함하는 영장류 면역계와 상호 작용하는 첫 번째 세포이기 때문에 중요하다 4,5. 돼지 장기와 아일렛 이종이식6,7에서중요한 역할을 하는 돼지 ECs. 따라서, ECs는 돼지 이식편에 대한 거부 및 응고 반응을 조사하기 위한 중요한 세포이다. 이종이식 연구에는 고품질 돼지 EC의 분리가 필요합니다.

상이한 장기(예를 들어, 심장, 신장, 간 및 대류)로부터 EC를 분리하려는 시도에서, 여러 프로토콜은8, 9,10,11,12를 이종이식으로 보고되었다. 그러나 격리된 EC의 초순수 문화를 유지하는 것은 표준 프로토콜에서 뛰어난 문제입니다. 소화 된 용액의 농도 증가, 부적절한 소화 시간 및 긁힘 강도는 현재연구에서섬유 아세포 오염 증가8,10,13에기여할 수 있습니다. 게다가, 소형 돼지에서 분리 된 pAECs의 방법은 덜 연구된다. 여기서, 우리는 소형 돼지 (우지산 또는 바마)에서 고도로 정제 된 pAECs를 분리하는 최적화 된 효소 방법을 설명합니다. 프로토콜의 여러 단계는 섬유아세포 오염을 줄이고 고순도 EC를 얻기 위해 고안되었습니다.

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프로토콜

동물의 사용은 동물 복지의 원칙에 따라 심천 제 2 인민 병원의 윤리 검토위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 동물, 중간 및 완충제 의 준비

  1. 미니어처 돼지를 준비합니다.
    참고 : 모든 미니어처 돼지는 중국 우지산 또는 바마 돼지 (수컷)였다. 돼지의 연령 및 체중은 각각 100일간 ±8일 및 5.7 kg±1.0 kg(평균±SD, n=3)이었다.
  2. 배양 배지를 준비하십시오: 내피 세포 배지 (ECM) 10% (v/v) 열 불활성화 태아 소 혈청 (FBS), 1% (v/v) 페니실린/스트렙토마이신 (P/S) 및 1% (v/v) 내피 세포 성장 보충제 (ECGS)로 보충.
  3. 세척 버퍼 준비: 1% (v/v) P/S가 있는 1x PBS 용액(pH 7.4).
  4. 0.005% 콜라게나아제 IV 소화용액을 준비하십시오: PBS 용액 20 mL에 콜라게나아제 IV 파우더 1 mg. 소화 전에 37°C에서 콜라게나아제 소화액을 미리 데우다.
  5. 정지 버퍼 준비: 덜베코의 수정된 독수리 배지(DMEM)는 10% 열 불활성화 FBS와 1% P/S로 보충됩니다.

2. 돼지 대동맥 내피 세포 격리를위한 수술 및 준비

  1. 수술 을 수행하기 전에 1 시간 동안 UV 광으로 수술실을 소독하고 의료 용 소독제 84 액체 (사용 가능한 염소 함량은 4.0 % - 5.0 %, 재료표).
  2. 소형 돼지가 15 mg/kg 케타민, 15 mg/kg 자일라진 염산염 및 0.05 mg/kg 페나세틴 염산염(부적: 100μL/kg, 재료표)에의해 형성된 근육 내 주사를 받은 후(그림1A),동물의 확인 돼지 고통스러운 자극을 검사와 마취 상태 (예를 들어, 한 쪽 귀를 꼬집거나 한 쪽 앞다리를 흔들어) 및 생리 지수 (예를 들어, 혈압, 심장과 호흡 속도).
    참고: 또 다른 반 복용량 주입 깨어의 흔적을 보여주는 경우 돼지에 게 주어질 수 있습니다.
  3. 메스로 복부를 자르고 열등한 정맥을 노출시키고 결과적으로 헤파린 나트륨 (5,000 U, 재료표)을 5 mL 주사기로 열등한 정맥에 주입합니다.
  4. 5 분 후, 혈액에 복부 대동맥에 카테터를 삽입하고 가슴의 피부를 자르고 메스로 횡격막을 절개한 후 좌심실을 잘라냅니다.
    참고 : 돼지가 혈액을 흘리고 심장을 절단 한 후 대동맥 맥박을 확인하여 안락사되어 있는지 확인하십시오.
  5. 뼈 집게 (재료표)로 갈비뼈를 절제하고 심장과 폐를 노출시다. 심장과 폐에 대한 후방을 찾아 두 끝을 고정합니다. 대류를 미리 냉각된 세척 버퍼로 한 번 씻습니다(그림1B,C).
  6. 가위로 대공을 잘라내고 양쪽 끝에 대오르타를 고정시되게 합니다. 멸균 집게와 가위로 대강 주위의 과잉 조직을 제거하십시오. 대불을 50 mL 원심 분리튜브에 넣고 미리 냉각된 세척 버퍼로 대불을 3배(세척당 30mL)로 세척하고 대불을 실험실로옮김(그림 1D).

3. 돼지 대동맥 내피 세포의 격리

  1. 무균 조건하에서, 돼지 대불을 세척 완충제에서 제거하고, 150 mm 페트리접시에 놓는다(그림 2A).
  2. 대공의 두 끝을 부드럽게 잘라내고 멸균 집게와 가위로 대공 주위의 과잉 조직을 다시 절제하십시오 (그림2B). 대류의 외부와 내부를 20-50 mL의 세척 버퍼로 세척하십시오(실온에서 배양 접시 위에).
    참고: 일부 EC가 이 부위에 손상되었기 때문에 수술 중에 클램프가 놓인 부위만 잘라내고 과도한 조직과 동맥 측 가지를 제거하십시오.
  3. 대장을 통해 수술 봉합사를 통과한 다음 외과 봉합사 (5-0, 90cm, 재료표)를 사용하여 대반의 한쪽 끝을 묶습니다. 외과 봉합사를 대강장 안쪽에 보관하십시오 (그림2C,D).
  4. 집게로 묶인 끝 부근에 대장을 부드럽게 고정한 다음 대류의 내피 표면이 노출될 때까지 대류를 반대로 하기 위해 수술 봉합사를 천천히 당깁니다(그림2E-G).
    참고 : 묶여 끝 근처에 대장을 고정하고 대장을 단단히 고정하지 마십시오, 또는 다른 대는 수술 봉합사를 당겨 반전 할 수 없습니다.
  5. 대류의 내피 표면을 세척 버퍼 3x (세척 당 10 mL)로 씻은 다음이 용액을 폐기하십시오. 대불을 15 mL 원심분리기 튜브에 넣고 튜브에 10 mL0.005 % 콜라게나아제 IV 소화 액으로 대불을 덮습니다 (그림2H).
    참고: 소화 전에 37°C에서 0.005% 콜라게나아제 IV 소화액을 미리 데우세요.
  6. 37°C에서 15분 동안 배양. 소화된 대류와 소화액을 100 mm 배양 접시에 넣고 미리 냉각된 스톱 버퍼를 10-15 mL 추가하여 0.005% 콜라주나아제 IV의 효과를 막습니다.
    참고: 권장되는 소화 시간은 10분에서 20분 사이입니다. 대류의 내피 표면이 정지 버퍼로 덮여 있는지 확인합니다.
  7. 세포 스크레이퍼를 사용하여 대공의 내부 표면에서 pAECs를부드럽게 긁어냅니다 (그림 2I). 긁힌 대류를 세척 버퍼 (시간당 5 mL)로 3 x 씻으하십시오. 배양 접시에서 용액을 50 mL 원심 분리튜브에 넣습니다. 배양 접시의 바닥을 세척 버퍼(시간당 5 mL)로 2x 세척하고 용액을 다시 50 mL 원심분리기 튜브에 넣습니다.
    참고: 한 방향으로 부드럽게 긁어 내고 압축하지 마십시오. 가장자리와 구멍 근처의 조직을 만지지 마십시오. 5-8x를 긁는 것이 좋습니다.
  8. 4 °C에서 6 분 동안 600 x g에서 튜브를 원심 분리합니다. 상급체를 버리고 50 mL 원심 분리튜브 바닥에 10 mL의 용액을 둡니다. 50 mL 원심 분리튜브에 20 mL의 세척 버퍼를 추가하고 펠릿을 다시 일시 중단합니다. 이 단계에서는 거품을 피하십시오.
  9. 4 °C에서 6 분 동안 600 x g에서 원심 분리기. 상급체를 천천히 버립니다. 배양 배지 1 mL로 세포 펠릿을 다시 중단하고 잘 섞는다.
    참고: 얻어진 cm 대류당 EC의 평균 수는 1.9 x 10 5±1.4 x 10 4(평균 ± SD, n=3)이다.
  10. 셀 카운터로 셀을 계산합니다. 플레이트 및 배양 세포는 세포 수에 따라 어떤 물질을 코팅하지 않고 용기에 세포를 배양한다. 세포 수가 1.0 x 106보다낮거나 같으면, 배양 세포는 25 cm2 플라스크에서 배양한다. 세포 수가 1.0 x 106보다큰 경우, 배양 세포는 여러 25 cm2 플라스크(플라스크당 1.0 x 10 6세포)에서 배양한다. 플라스크를 37°C에서 37°C에서 5% CO2로 인큐베이터에 놓고 2-3일마다 배지를 교체합니다.
    참고 : 일부 세포는 세포 스크레이퍼에 의해 손상됩니다. 세포 생존율 분석결과, 살아있는 세포의 백분율은 95.7% ±1.7%(평균 ±SD, n=3)로 나타났다. 단리된 세포의 두 배 시간은 약 1-2 일입니다.

4. 수확 및 순수한 내피 세포의 특성화

  1. 세포가 약 4-5 일 동안 자라도록 둡니다. 세포가 80% 합류에 도달하면 (그림3A),0.25% 트립신으로 세포를 소화하고 세포를 통과한다. 이어서, 일부 단리된 세포를 수집하고(3일째, 1항 및 통로 2) 유세포분석(항-CD31 항체)에 의해 식별한다.
  2. 단질된 pAECs (세포 수:1 x 10 5) (3일째, 항문 1 및 통로 2) 항포르신 CD31-플루오세인 이소티오미세네이트(FITC) 공액 항체(100 μL 세포당 10 μL 항체, 세포 세포 4°C에서 30분 동안 염색).
  3. 전방 분산 플롯, 음수 대조군으로 스테인드되지 않은 샘플을 사용하여 총 라이브 셀 모집단을 게이트합니다. 그런 다음 히스토그램으로 문이 닫힌 세포의 CD31 양성 세포를 제시합니다.
    참고: CD31 양성 세포의 효능은 각각 97.4% ±1.2%(3일째), 94.4% ±1.1%(P1) 및 92.4% ±1.7%(평균±SD)이다(그림 3B).

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결과

우리의 방법은 소형 돼지에서 대불에서 고도로 정제 된 EC를 분리하는 효과적인 방법을 제공하는 것을 목표로합니다. 대동맥 수술 의 과정은 그림1에 도시되어 있습니다. 첫 번째 단계는 전체 대류가 돼지에서 절제된다는 것입니다. 다른 세포 또는 세균 오염을 방지하는 것은 매우 중요합니다. 따라서, 표적세포나 세균이 대류를 오염시킬 경우 다른 장기 나 조직을 손상시키지 말고, 미리 냉각된 세척 완충액으로 대장을 3배 세척한다(도1B-D). 세포 생존력을 유지하는 또 다른 중요한 단계는 외과 시편과 격리 절차를 얻는 사이의 기간을 최소화하는 것입니다.

PAE의 정제에 관여하는 프로세스는 그림 2에나와 있습니다. 우리의 방법은 대류의 한쪽 끝이 묶여 있고 내피 표면이 노출되기 때문에 다른 방법과 다릅...

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토론

내피 세포는 혈관 기능 장애, 당뇨병, 조직 재생, 이식 및 암14,15,16,17,18의연구에 일반적으로 사용된다. 이러한 질병에서 EC의 생물학 및 기능을 이해하고 특성화하기 위해, 다른 병든 장기 또는 조직의 EC를 분리하는 수많은 방법이8,19,20, 보고되었다. 21세 , 22세 , 23세

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

이 작품은 광동성 자연 과학 재단의 보조금에 의해 지원되었다, 보조금 / 수상 번호: 2016A030313028; 광동성 의학 과학 연구 재단, 보조금 / 수상 번호: B2018003; 심천 과학 기술 재단, 그랜트 / 수상 번호: JCYJ20180306172449376, JCYJ20180306172459580, JCJY202022229204449975, GJHZ2022920449975, GJHZ20170331417135556, JCYJ20201604011 및 JCYJ2016040440404040 심천 롱화 지구 과학 기술 재단, 보조금 / 수상 번호: 2017013; 중국 의 국가 주요 R & D 프로그램, 보조금 / 수상 번호: 2017YFC1103704; 심천에서 의학의 산밍 프로젝트, 그랜트 / 수상 번호: SZSM201412020; 광동성 고등병원 건립특별기금(2019년) 심천의 높은 수준의 의료 분야 건설을위한 기금, 보조금 / 수상 번호: 2016031638; 심천 건강 및 가족 계획 위원회의 재단, 보조금 / 수상 번호 : SZXJ2017021 및 SZXJ2018059. 우리는 원고의 준비를 도와 준 심천 대학에서 한청 장과 Zhicheng Zou 감사합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
BD FACSAria IIBD Bioscience
Boneforceps베이징 HeLi KeChuang 기술 개발 CO., Ltd. 중국HL-YGQ   
BOON 일회용 주사기 (10ml)Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. 중국
CD31-FITC 항체Bio-RadMCA1746F
세포 스크래퍼Corning 3010#
콜라겐 분해 효소 IV시그마-알드리치C5138#-1G
컴파운드 케타민 주사 선양의 수의학 제약 공장케타민 염산염?0.3g/2ml, 자일라진 염산염:0.3g/2ml, 페나세틴 염산염?1mg/2ml
DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐인돌, 디염산염)생명 과학D1306#
DMEM생명 기술11965118#
ECMSciencell1001#
ECGSSciencell1052#
Eppendorf Snap-Cap Microtube(1.5mL) AXYGENMCT-150-C#
Falcon 100mm 세포 배양 접시Corning353003#
Fetal 소 세럼GIBCO10270-106#
Flowjo v10.0
펜치 ShangHai medical instruments Co., Ltd.China
Heparin sodiumJiangsu WanBang biopharmaceutical Co., Ltd.China
요오드 팅크Guilin LiFeng Medical Supplies Co., Ltd.China
Miniature Pig (Bama 또는 Wuzhishan)Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, China
Mshot microscope 광저우 마이크로 탄 기술 Co., 주식 회사.M152
페트리 접시 (150 x 15 mm)Biologixgroup66-1515#
페니실린/스트렙토마이신생명 기술15070063#
벤트 캡이 있는 직사각형 경사 목 세포 배양 플라스크? T25?코닝 3289#
가위ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China
혈청학적 전사 피펫 (10ml)JET BiofilGSP010010# 
멸균 파스퇴르 피펫GeneBrickGY0025#
멸균 주사기 필터 (0.22µ m)MilliporeSLGV033RS#
외과용 메스ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China22#
외과용 봉합Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd5-0#
주사기?5mL?Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China
Trypsin-EDTA (0.25%), 페놀 레드GIBCO25200056#
75% 의료용 알코올Guilin LiFeng Medical Supplies Co., Ltd.China
20 x PBS 용액(pH 7.4, 뉴클레아제 무료)Sangon BiotechB540627#
Medical 소독제 84 액체쓰촨성 Yijieshi Medical Technology Co., Ltd450ml/병
중국 사

참고문헌

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소형 돼지 대동맥콜라게나제 IV 소화혈관내피세포 분리유세포 분석CD31 항체 염색세포 긁어내기 기법이종이식 연구혈관내피세포세포 배양 확장
소형 돼지에서 1 차 대동맥 내피 세포의 격리 및 배양
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