대류 강화 전달을 통해 뮤린 뇌로 항체 전달

요약

대류 강화 전달 (CED)은 큰 조직 볼륨의 직접 관류에 의해 뇌로 치료제의 효과적인 전달을 가능하게하는 방법입니다. 절차는 카테터와 최적화 된 주입 절차의 사용을 필요로한다. 이 프로토콜은 마우스 뇌로 항체의 CED에 대한 방법론을 설명합니다.

초록

대류 강화 전달 (CED)는 카테터 시스템을 사용하여 큰 뇌 볼륨의 효과적인 관류를 가능하게하는 신경 외과 기술입니다. 이러한 접근법은 혈액 뇌 장벽(BBB)을 우회하여 안전한 전달 방법을 제공하므로 BBB 투과성이 좋지 않은 치료제 또는 전신 노출이 바람직하지 않은 치료제(예를 들어 독성으로 인한 치료)를 허용합니다. CED는 카테터 설계, 주입 프로토콜 및 난간 특성의 최적화가 필요합니다. 이 프로토콜을 통해 우리는 마우스의 카우데이트 푸타멘내로 항체의 최대 20 μg를 포함하는 용액의 CED를 수행하는 방법을 기술한다. 그것은 단계 카테터의 준비를 설명하고, 시험관 내에서 시험하고 램핑 주입 프로그램을 사용하여 마우스에서 CED를 수행합니다. 프로토콜은 다른 주입 볼륨에 대해 쉽게 조절될 수 있으며 화학요법, 사이토카인, 바이러스 입자 및 리포좀을 포함한 다양한 트레이서 또는 약리활성 또는 비활성 물질을 주입하는데 사용할 수 있습니다.

서론

혈액 뇌 장벽 (BBB) 혈액 순환에서 중추 신 경계를 분리 하는 반 투과성 국경을 형성 (CNS). 그러나 치료와 함께 CNS에 도달하는 것은 뇌종양, 알츠하이머 병 (AD) 또는 파킨슨 병 (PD)과같은 다양한 질병의 맥락에서 필요하다 1. 이것은 새로운 치료법의 개발에 중요하게 되고, 특히 시험된 약물이 BBB 투과성이 좋지 않거나전신 노출이 위험한 독성으로 이어질 수 있는 경우 1,^2. 임상적으로 사용된 항체 중 일부는 이러한 두 가지 특징을 모두 표시한다. 이 문제에 대한 해결책은 BBB 바로 뒤에 치료제를 전달하는 것입니다.

대류 강화 배달 (CED) 큰 두뇌 볼륨의 효과적인 관류를 가능하게 하는 신경 외과 기술입니다. 이것은 표적으로 한 지역에 하나 이상의 카테터를 외과적으로 설치함으로써 달성됩니다. 약물 적용 중에 카테터의 개구부에서 압력 구배가 형성되며, 이는 조직^3,4에서난간 분산의 원동력이됩니다. 따라서 관류 범위 2,

프로토콜

여기에 설명된 모든 방법은 스위스 주 수의학 사무소의 라이센스 번호 ZH246/15에 따라 승인되었습니다.

1. 스텝 카테터 의 준비

1. 카테터의 단계에 대한 융합 실리카 튜브의 제조
   1. 융합된 실리카 모세관을 내경 0.1mm, 벽 두께 0.0325mm의 두께로 30mm 길이로 자른다.
   2. 튜브 개구부가 매끄러운 표면을 가지고 있는지 확인하기 위해 마이크로 포지를 사용하여 끝을 균열 및 열 연마 튜브를 검사합니다.
2. 금속 바늘에 내부 튜브의 고정
   1. 10 μL 주사기에 27 G 바늘을 장착하고 주사기를 입체 로봇에 놓습니다.
   2. 로봇을 사용하여 주사기를 단단한 표면 위로 이동하고 바늘 끝으로 만지다. 이 위치는 카테터 단계의 길이를 설정하기위한 참조 표면 역할을하기 때문에 소프트웨어에 주목하거나 저장해야합니다.
   3. 바늘 내부에 융합 실리카 모세관의 배치를 가능하게하기 위해 바늘을 상승
   4. 융합된 실리카 모세관을 바늘에서 20mm의 모세관이 돌출되도록 바늘에 놓습니다.
   5. 피펫을 사용하여,

결과

이 프로토콜은 실험실 환경에서 CED절차에서 사용하기 위한 단계 카테터(그림 1)의 제조를 가능하게 한다. 카테터를 누출, 바늘 관을 따라 역류 및 막힘에 대한 카테터를 제어하려면 염료(예: 트라이판 블루 용액)를 아가로즈 블록으로 주사하는 것이 좋습니다. 도 3은 CED 카테터를 사용하여 0.5 μL/분에서 1 μL의 주입 후 트라이판 블루 형성의 구름을 도시한다(도3A). 카테터 단계의 시작 부분에 바늘 관을 따라 역류가 보이지 않았습니다. 더욱이, 분산된 구름은 원하는 구형 형상을 형성했다. 이는 현저한 역류가 관찰될 수 있는 종래의 27G 무딘 말단 바늘(도3B)을사용하여 얻은 결과와 대조적이다.

또한 CED는 최적화된 주입 절차가 필요합니다.

토론

대류 강화 된 배달, 또는 뇌에 압력 매개 약물 주입, 처음에 처음 제안 되었다 1990³. 이 접근은 통제된 방식으로 혈액 두뇌 방벽 의 뒤에 큰 두뇌 양의 관류를 약속합니다². 그러나, 지금까지, 몇몇 임상 시험은 임상 설치에 있는 CED가 기술적으로 요구하는 것으로 나타났기 때문에 부분적으로, 이 접근을 사용하여 수행되었습니다^24,25. 카테터 설계 및 주입 프로그램의 최근 발전은 이러한기술적 어려움을 극복 한 것으로 보인다 8,¹⁹. 면역조절 체크포인트 차단제의 출현을 포함하는 치료항체의 임상적 구현이 진행되고 있으며, CNS^{장애(10)의}치료에 적용을 기다리고 있다. 이러한 개발은 소형 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10 &뮤; L 주사기	해밀턴	7635-01
27G 무딘 바늘	해밀턴	7762-01
아가로 스	Promega	V3121
아티 파메 졸	Janssen
뼈 왁스	브라운	1029754
부 프레 노르 핀	인디비어 슈바이즈 AG
카르 프로펜	화이자 AG
치과용 드릴 비트, 스틸, 크기 ISO 009	Hager & Meisinger	1RF009
에탄올 100%	Reuss-Chemie AG	179-VL03K-/1
펜타닐	헬베팜 AG
FITC-덱스트란, 2000kDa	시그마 알드리치	FD2000S
플루마제닐	Labatec Pharma AG
포름알데히드	시그마 알드리치	F8775-500ML
고점도 시아 노 아크릴 레이트 접착제	Migros
요오드 용액	Mundipharma
Medetomidin	Orion Pharma AG
Microforge	Narishige	MF-900
Midazolam	Roche Pharma AG
안과 연고	Bausch + Lomb	비타민 A Blache
PBS	ThermoFischer Scientific	10010023
Silica tubing 내부 직경 0.1 mm, 벽 두께 0.0325 mm와
		51615
정위 로봇	Neurostar	드릴 및 사출 로봇
Succrose	Sigma Aldrich	S0389-500G
국소 티슈 접착제	Zoetis	GLUture
Trypan blue	ThermoFischer Scientific	15250061
Water	Bichsel	1000004

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