방법 논문

동적 압축으로 연골 세포 자극을 위한 미세 유체 플랫폼

DOI:

10.3791/59676

⸱

2019년 9월 13일

 ,  ,  , 
1Department of Genetics, Cell Biology and Anatomy, University of Nebraska Medical Center, 2Department of Physiology and Pharmacology, Karolinska Institutet, 3Department of Mechanical and Materials Engineering, University of Nebraska-Lincoln, 4Nebraska Center for Materials and Nanoscience, University of Nebraska-Lincoln

이 논문에서

요약

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이 문서에서는 연골 세포 압축을 위한 공압 작동 미세 유체 장치를 제조하고 특성화하기 위한 자세한 방법을 제공합니다.

초록

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기계적 자극은 세포와 조직의 생물학적 기능을 조절하는 것으로 알려져 있습니다. 최근 연구는 압축 스트레스 성장 플레이트 연골 아키텍처를 변경 하 고 어린이의 긴 뼈의 성장 변조 결과 제안. 뼈 성장에 압축 응력의 역할을 결정하기 위해, 우리는 알긴산 하이드로 겔 실린더에 내장 된 동적으로 (또는 정적으로) 압축 성장 판 연골 세포에, 공압 압력에 의해 작동 미세 유체 장치를 만들었습니다. 이 문서에서는 이 장치를 조작하고 특성화하는 자세한 방법을 설명합니다. 우리의 프로토콜의 장점은 : 1) 압축 응력의 다섯 가지 크기는 하나의 플랫폼에서 다섯 개의 기술적 복제에 생성 될 수있다, 2) 기존의 빛 현미경을 통해 세포 형태를 시각화하기 쉽습니다, 3) 세포는 신속하게 분리 될 수있다 압축 후 디바이스로부터 다운스트림 어노세를 용이하게 하고, 4) 플랫폼은 하이드로겔에서 성장할 수 있는 임의의 세포 유형의 메카노생물학을 연구하기 위해 적용될 수 있다.

서론

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마이크로 엔지니어링 플랫폼은 물리적 및 화학적 미세 환경모두의동적 제어를 가능하게하기 때문에 분자, 세포 및 조직 수준 생물학을 연구하기위한 귀중한 도구입니다1,2,3 ,4,5,6,7,8. 따라서, 여러 가설은 동시에 엄격하게 통제된 방식으로 시험될 수 있다. 성장판 연골의 경우,성장판 연골9,10,11에대한 작용을 통해 뼈 성장을 조절하는 데 있어 압축 스트레스의 중요한 역할에 대한 증거가 증가하고있다. 12,13,<....

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프로토콜

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참고: 이 프로토콜의 모든 단계에 장갑과 실험실 코트와 같은 개인 보호 장비(PPE)를 착용하십시오.

1. 마스터 금형 제작

참고: 연기 후드에서 1.1단계 - 1.3단계를 수행합니다.

  1. 유리 처리
    참고: 1.1단계에서는 얼굴 보호막, 장갑 및 실험실 코트를 착용하십시오.
    1. 피라냐 용액(60 mL)을 황산(H2SO4)과과산화수소(H2O2)를부피비 3:1로 혼합하여 만듭니다.
      주의: 폭발 위험으로 인해 동일한 연기 후드에 피라냐 용액과 아세톤을 사용하지 마십시오.
    2. 40°C에서 30분 동안 피라냐 용액에 유리판(50.8mm × 76.2 mm × 1.2 mm)을 놓습니다.
    3. 탈이온수(diH 2O)로 유리판을헹구다.
    4. 유리 판을 실온에서 아세톤에 넣고 10분 동안 놓습니다.
    5. 유리판을 이소프로판올로 헹구고질소(N2)가스로 건조시면 됩니다.
    6. 유리판을 200°C에서 20분간 핫 플레이트에 굽습니다. 이후의 모든 베이킹 단계는 핫 플레이트를 사용합니다.

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결과

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이 문서는 미세 유체 연골 세포 압축 장치 제조의 상세한 단계를 보여줍니다(그림 2). 이 장치는 원통형 알긴산-콘드로시트 구문 5개 어레이를 포함하며, 이러한 구문은 5가지 압축 크기로 압축될 수있다(그림 1, 그림 3 및 그림 4). 공압 마이크로채널의 높이는 약 90 μm이며 PDMS 풍선 직경은 각각 1.2, 1.4, 1.6, 1.8 및 2.0 mm입니다. 장치의 성능은 정적 압축 조건 및 이미지 처리와 공초점 현미경으로 정량화되었다. 정적 압축은 공초점 현미경 검사법을 가진 z-stack화상 진찰이 몇 분 걸리기 때문에 현미경 화상 진찰을 위해 채택되었습니다, 그래서 동적 압축 도중 양적 화상 진찰을 위해 너무 느립니다.

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토론

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성장판 연골세포에 대한 압축 응력의 영향을 테스트하기 위해 미세유체 연골세포 압축장치(그림 1)를개발하여 알긴산 하이드로겔 스캐폴드의 연골세포에 다양한 수준의 압축 스트레스를 3D로 적용했습니다. 처리량이 높은 방식으로 문화를 전달합니다. 다른 연구자가 장치를 채택하거나 유사한 장치를 개발할 수 있도록 이 프로토콜 문서에서 장치 제작 단계에 대한 세부 정보를 제공했습니다.

이 프로토콜의 중요한 단계는 1) 1층의 기포가 공압 마이크로채널을 손상시키지 않고 공압 마이크로채널(Layer 1)으로 PDMS 층을 제작하는 것입니다. PDMS 풍선의 탄성이 경화온도(36,3)에 의존하기 때문에 PDMS 풍선(Layer 2)을 경화하기 위한 일정한 온도(예를 들어, 80°C)는 신선한 아미노실란화된 유리를 사용하여 알긴산 겔 구조를 PDMS 풍선과 정렬하고 4)에 의존하는 것으로 알려져 있기 때.......

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

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크리스토퍼 모라에스 박사와 스티븐 에이 모린 박사가 장치 설계 및 제작을 지원해 주신 것에 대해 감사드립니다. 이 연구 결과는 네브라스카 링컨 대학 (UNL)와 네브래스카 대학 의료 센터 (UNMC)에서 인간 건강 교부금을 위한 생명 공학에 의해 지원되고, NIH/NIAMS에서 AR070242를 부여했습니다. 우리는 공초점 현미경 검사법에 도움을 제공한 네브래스카 대학 의료 센터에 있는 고급 현미경 코어 시설의 제니스 A. 테일러와 제임스 R. Talaska에게 감사합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
(3-Aminopropyl)triethoxysilane (ATPES)Sigma-Aldrich741442-100ML
(Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)-1-TrichlorosilaneUnited Chemical TechnologiesT2492-KG
아크릴 시트McMaster-Carr8560K354
에어 펌프Schwarzer PrecisionSP 500 EC-LC4.5V DC2015년에 구입한 모델을 사용했습니다. 2016년 초에 에어 펌프(SP 500 EC-LC)의 내부 설계 및 성능이 변경되었습니다. 또한 공기 펌프 성능은 시간이 지남에 따라 변화해 왔습니다. 따라서 SP 500 EC-LC 공기 펌프에서 생성된 공기 압력은 사용하기 전에 보정해야 합니다.
알긴산 분말FMC CorporationPronova UP MVG
미늘 스트레이트 커넥터(금속 튜브)PneumadyneEB40-250
Calcein AMInvitrogenC3100MP
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco11960-044
염색된 빨간색 수성 형광 입자Thermo Fisher ScientificR0100
EDC (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염)Thermo Fisher Scientific22980
폼 패드GRAINGER항목 # 5GCE8
기능/임의 파형 발생기Keysight Technologies33210A
염산피셔 케미컬A144-500
과산화수소피셔 BioReagentsBP2633500
이소프로필 알코올BDH1174-4LPVWR
현미경 슬라이드Thermo Fisher Scientific22-267-013
플라즈마 클리너Harrick PlasmaPDC-001
폴리디메틸실록산(PDMS)다우코닝184 SIL ELAST KIT 0.5KG
전원 공급 장치Keysight TechnologiesE3630A
SeaKem LE AgaroseLonza50004
수산화나트륨Fisher ChemicalS318-1
솔레노이드 매니폴드PneumadyneMSV10-1
솔레노이드 밸브PneumadyneS10MM-30-12-3
스핀 코터Laurell TechnologiesWS-650Mz-23NPPB
SU8 개발자마이크로켐 주식회사Y020100 4000L1PE
SU8-100MicroChem Corp.Y131273 0500L1GL
SU8-5마이크로켐 공사Y131252 0500L1GL
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosoxynimide)Thermo Fisher Scientific24510
황산EMD MilliporeMSX12445

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Analytical Chemistry. 76 (18), 5257-5264 (2004).
  2. Malek, A. M., Izumo, S. Mechanism of endothelial cell shape change and cytoskelet....

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